Summary
Dit protocol wordt een methode voor de isolatie van primaire menselijke decidual cellen van de foetale membranen van term placentae die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen (d.w.z. immunocytochemie, stroom cytometry, enz.) verzameld gedemonstreerd die gericht zijn studie de rol van verschillende cel populaties in zwangerschapscomplicaties.
Abstract
De decidua, ook bekend als de zwangere endometrium, is een uitermate belangrijk reproductieve weefsel. Decidual cellen, bestaat voornamelijk uit decidualized stromale cellen en immune cellen, zijn verantwoordelijk voor de afscheiding van hormonale en inflammatoire factoren die kritisch zijn voor succesvolle blastocyst implantatie, ontwikkeling van de placenta en een rol spelen de Inleiding van de arbeid op termijn en vroeggeboorte. Veel zwangerschapscomplicaties kunnen voortvloeien uit de verstoringen van een subtiel evenwicht van andere cel populaties bestaande uit decidua. Wijzigingen in het aandeel van de specifieke decidual celtypes kunnen verstoren deze cruciale processen en verhogen het risico van het ontwikkelen van ernstige complicaties van de zwangerschap, zoals embryo-implantatie mislukking, beperking van de uteriene groei, pre-eclampsie en premature Arbeid. Het protocol hier geschetste toont een kosten en tijd effectieve methode voor de isolatie van primaire menselijke decidual cellen van de foetus membranen van term placentae verzameld. Door het combineren van enzymatische spijsvertering en zachte mechanische verstoring van het decidual weefsel, werd een hoog rendement van decidual cellen verkregen met vrijwel geen chorion besmetting. Belangrijker, geïsoleerde decidual cellen werden gekenmerkt (stromale cellen (55-60%), leukocyten (35%), epitheliale (1%) of cellen van de trofoblast (0.01%)) en onderhouden van hoge levensvatbaarheid (80%), die werd bevestigd door multicolor imaging stroom cytometry assay. Dit protocol is specifiek voor de decidua-parietalis en kan worden aangepast aan de eerste en tweede trimester placentae. Geïsoleerde decidual cellen kunnen worden gebruikt voor een veelheid van experimentele toepassingen gericht op het begrijpen van de rol van de verschillende decidual cel subpopulatie in zwangerschapscomplicaties.
Introduction
Het endometrium, een van de meest actieve volwassen vrouwelijke weefsels, ondergaat dramatische remodelleren elke menstruele cyclus in reactie op de stimulatie van de eierstokken hormonen, (E2) oestrogeen en progesteron (P4). De decidua, ook bekend als de zwangere endometrium, is een uitermate belangrijk reproductieve weefsel dat wordt gevormd door het einde van de postovulatory fase als gevolg van P4-gedreven differentiatie na de E2-dominante proliferatieve fase. Decidual cellen zijn verantwoordelijk voor de afscheiding van hormonale factoren voor succesvolle blastocyst implantatie en voor de ontwikkeling van de utero-placenta interface voor het behoud van de maternale tolerantie voor de foetale allograft.
Decidualization is vereist voor implantatie en latere verbouwing van de decidual spiraal slagaders. Baarmoederslijmvlies stromale cellen ondergaan decidualization, onder de controle van P4 en kamp, tijdens de late luteale fase van de menstruele cyclus1. Dit proces wordt gestart rond de bloedvaten en de spreads in het stroma, suggereert haar rol bij het remodelleren van therapieën en leukocyten mensenhandel van de verordening. Deze cellulaire transformatie wordt gekenmerkt door een circulaire morfologie, toegenomen nucleaire omvang en uitbreiding van het ruw endoplasmatisch reticulum en het Golgi-apparaat2. Decidualized stromale cellen zijn geschikt voor het produceren van paracrine factoren ter ondersteuning van de blastocyst implantatie en gekenmerkt door de afscheiding van talrijke hormonen (d.w.z. prolactine), angiogenic groeifactoren, insuline groeifactor bindende eiwit-1 (IGFBP-1), (PG) prostaglandine E (stimulator van intracellulaire cAMP), cytokines, componenten van de extracellulaire matrix en voedingsstoffen die essentieel zijn voor placenta implantatie en ontwikkeling3,4,5,6 .
De decidual-celpopulatie bestaat niet alleen uit decidualized stromale cellen maar bevat ook grote, zwangerschap-specifieke decidual leukocyten populaties. Decidualization omvat het voorbijgaande gelokaliseerde oedeem en toestroom van Natural killer (NK) cellen, T-cellen, macrofagen en dendritische cellen. De grootste leukocyte subpopulatie is de baarmoeder NK-cellen, bestaande uit ongeveer 50-70% van alle moeders leukocyten infiltreert in de decidua die een bron van cytokinen en angiogenic factoren die kunnen helpen bij het decidualization-proces en verhogen in nummer in de gehele zwangerschap7. Macrofagen, wordt de tweede grootste subpopulatie van immune cellen, worden gevonden rond de innesteling plaats en tijdens zwangerschap8te verhogen. Ze zijn een bron van cytokines en groeifactoren zoals kolonie stimulerende factor (CSF-1)9, Tumornecrosefactor α (TNFα)10 en prostaglandine (PG) E11.
Tijdens de zwangerschap, en vóór de termijn arbeid is de decidua een belangrijke bron van cytokines en chemokines verantwoordelijk voor moeders perifere leukocyten activering en latere migratie in de baarmoeder weefsels tot inleiding van de arbeid. Dierlijke studies is gebleken dat talrijke pro-inflammatoire cytokines omhoog-geregeld in de decidua muis tijdens arbeid, zoals TNF-a, IL-6, IL-12, en IL-1b12. In de menselijke decidua vertonen pro-inflammatoire cytokines IL-1b, IL-6 en IL-8 (grote neutrofiele chemoattractant) hogere expressie tijdens arbeid tegenover niet in arbeid13. Deze cytokines resultaat in een activering en de toevloed van leukocyten uitgescheiden in de decidual weefsels14; een toename van de decidual macrophage en neutrofiele infiltratie in zowel de mens en rat is gezien tijdens termijn arbeid, met decidual infiltratie voorafgaand aan myometrial 4-fold meer, met vermelding van een cascade van activering tussen deze twee-aangrenzende uteriene weefsels 15. Deze infiltreren leukocyten produceren PGs staat activeren synchrone contracties van het myometrium16, matrix metalloproteinasen (MMP) tot membraan scheuren17,18, alsmede pro-inflammatoire cytokines aan het versterken van de uteriene activeringsproces ('cytokine storm').
Als gevolg van tal van belangrijke functies van decidual cellen, zoals spelen een cruciale rol in het proces van de innesteling, behoud van moeders-foetale tolerantie in de vroege dracht en deelnemen aan de activering van arbeid op termijn kunnen verschillende pathologieën ontstaan tijdens zwangerschap. Bijvoorbeeld, kan (1) onvruchtbaarheid als gevolg van de steeds terugkerende implantatie falen en terugkerende zwangerschap verlies voortvloeit uit een verzuim van de rijping van het decidual; (2) uteriene groei beperking (IUGR) en pre-eclampsie te wijten aan onjuiste ontwikkeling en dysfunctie van de decidua/placenta of gecompromitteerde vasculaire transformatie op de kruising van de decidual-myometrial; en (3) vroeggeboorte die kan voortvloeien uit de voortijdige decidual activeren.
In het licht van deze belangrijke stoornissen, in combinatie met de ethische en praktische beperkingen van menselijke in vivo studies, tot oprichting van de primaire mens decidual cellijnen is essentieel voor de in vitro analyse met het doel van beter begrip en verbetering van klinische beheer van zwangerschapscomplicaties. Daarom was het doel van ons onderzoek voor de ontwikkeling van een protocol waarmee voor de isolatie van menselijke primaire decidual cellen met een hoge cel opbrengst en levensvatbaarheid van de foetale membranen van term placentae verzameld. Deze huidige protocol duidelijk tijd - en goedkoop cost-effective wordt een methode beschreven voor het isoleren van specifieke subtypen van decidual cellen die worden gebruikt voor een verscheidenheid van in vitro analyses. Karakterisatie van de overvloed en fenotype van decidual subpopulatie op termijn en vergelijking voor de eerste of tweede trimester is van cruciaal belang voor het bepalen van hun rol in de hele menselijke dracht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Placentae worden bijeengezocht uit gezonde termijn, niet in de arbeid vrouwen ondergaan electieve cesarean secties. De inzameling, verwerking, en wegwerp van menselijke monsters voldoet aan de richtlijnen van de Raad van Mount Sinai Hospital ethiek. Een schriftelijke toestemming is verkregen van elke patiënt. Deze studie is goedgekeurd door de Board ethiek onderzoek in het Mount Sinai Hospital.
1. voorbereiding
Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder een zuurkast en alle chirurgische apparatuur moet worden gesteriliseerd via autoclaaf vóór plaatsing in de zuurkast. Alle andere materialen (50 mL tubes, flessen, etc.) moeten met 70% ethanol oplossing worden gesteriliseerd. Altijd persoonlijke beschermingsmiddelen dragen te allen tijde bij het werken met biohazardous afval (laboratoriumjas, handschoenen, lange haren terug gebonden, enz.).
-
Enzymatische spijsvertering oplossing (eindoplossing: 200 mL)
- Pipetteer 180 mL HBSS-/ - toevoegen in een bekerglas van 500 mL steriele roeren magneet en plaats op de plaat roeren bij kamertemperatuur.
- Weeg af en voeg het volgende toe aan de HBSS-/-oplossing langzaam en opeenvolgend: 20 mL FBS, 400 mg Collagenase 2 ([laatste] = 2 mg/mL), 20 mg Soy bean trypsine remmer ([laatste] = 0,1 mg/mL), 30 mg DNase 1 ([laatste] = 0,15 mg/mL), en 200 mg BSA ([laatste] = 1 mg/mL)
- De roeren ingesteld op medium snelheid, en laat het mengsel roeren gedurende 10-20 minuten (cover met tin folie of paraffine film tijdens het roeren).
- Giet de gemengde oplossing in een fles van 250 mL met behulp van een plastic trechter en plaats in de zuurkast.
- Laat de oplossing door een kunststof top filtratie unit (0.22 μm Membraanfilter, 500 mL), in 50 mL tubes (10 totaal buizen) en opslag bij-20 ° C tot gebruik aliquoot 20 mL.
-
RPMI 1640 Media (2% oplossing en 10% compleet groeimedium wassen)
- Combineer RPMI 1640 en FBS in een glazen fles in de zuurkast.
- Voor 2% FBS oplossing, combineren 490 mL RPMI 1640 en 10 mL FBS.
- Voor de 10%-oplossingligttussen FBS, combineren 450 mL RPMI 1640 en 50 mL FBS.
- Pipetteer 500 μL van normocin in de 500 mL glazen fles uit de vorige stap met RPMI media en FBS (50 mg/mL voorraad, 0,05 mg/mL werken concentratie).
- Pass media door een 0,22 μm membraanfilter en winkel in een 500 mL glazen fles bij 4 ° C tot gebruik.
- 30 minuten vóór het opstarten van het experiment, plaatst u een hoeveelheid van 20 mL bevroren enzymatische spijsvertering oplossing in een bad van de kraal 37 ° C, plaatst u de 2% FBS en de media FBS RPMI 1640 10% in een bad van de kraal 37 ° C, zet de rockende waterbad en ingesteld op 37 ° C , 2 g, en stel een temperatuur gecontroleerde centrifuge tot 4 ° C.
2. verzameling van Decidual weefsel van de Term placenta membranen
- Plaatsen van flessen met HBSS +/ +, HBSS-/- en vijf 50 mL buizen in een rack onder de zuurkast. Pipetteer 25 mL van HBSS +/ + in één buis.
-
Met gehandschoende handen, neem de term placenta uit de container gebruikt voor het vervoer van de operatiekamer theater. Plaats van de placenta over de luier pad (moeders kant naar boven) en verspreid de foetale membranen met behulp van schaar en pincet.
- Leg overlappende luier pads op de zuurkast.
- Gebruik een aparte luier om te spiegelen van de placenta, zodat de moeders kant gezicht.
- Zoek het punt van membraan breuk en Maak insnijdingen zodat het membraan te ontvouwen en lag plat op het oppervlak van de fumehood.
Opmerking: Zodra het membraan terug uit de placenta getrokken is, dan zal de decidua gezicht-omhoog rustend op de chorion-laag, met de amnion-laag op de rug zijn.
- Met behulp van een plastic cel schraper, zorgvuldig schrapen het decidual weefsel uit de chorion en de plaats in de tube van 50 mL 25 mL HBSS met +/ +.
- Schraap het membraan met matige druk uitoefent. Niet teveel druk uitoefenen aangezien het in besmetting van de chorion resulteren kan. Kleine bloedstolsels evenals, deze bevatten een aantal decidual cellen verzamelen.
Let op: Na decidual collectie, placenta moet worden verpakt in een kunststof bak van biohazard en bevroren in een vriezer van-20 ° C voorafgaand aan passende verwijdering (volgens uw institutionele regels). Bloedige luier pads moeten worden verpakt in een zegel-strakke plastic zak en verwijderd in een kluisje biohazard.
3. wassen en enzymatische vertering van het Decidual weefsel
- Het wassen van de verzamelde weefsels door voorzichtig met de hand schudden van de tube van 50 mL en het passeren een 250 μm metalen zeef (250 μm, grootte 60 mesh) rusten over een steriele monster (urine) container.
- Herhaal de wash tweemaal met HBSS +/ + en tweemaal met HBSS-/ - in vers buizen voor elke wassen. (finale wast met HBSS-/-zorgt voor de verwijdering van calcium en magnesium aanwezig in HBSS +/ +, die anders zou interfereren met de volgende enzymatische spijsverteringsproces).
OPMERKING. Tijdens de stappen wassen, zal chorion weefsel verontreiniging blijken als het decidual weefsel is licht roze in kleur en amorf, terwijl de chorion is wit, dichte en stringy. Daarom kan chorion besmetting gemakkelijk worden verwijderd met een tang. - Optioneel, als het decidual weefsel dik is, het overbrengen in een petrischaal van steriele 10 cm diameter en overgaan tot gehakt van het weefsel met twee tegengestelde scalpels in de schotel.
-
Plaats de gewassen weefsel in de tube van de steriele 50 mL 100 mg weefsel/ml enzymatische spijsvertering oplossing bevat (Zie voorbereiding).
- Als een referentiepunt, ervoor zorgen dat het decidual weefsel de 5-10 mL merk op de tube van 50 mL bereikt.
- Gebruik ongeveer 20 mL van oplossing (Prepared in stap 1.1) van de enzymatische spijsvertering te verteren de totale decidua verzameld van een gehele looptijd foetale membraan.
- Zegel van de dop van de tube met de film van paraffine (zegel van de buis strak en wikkel paraffine film rond het GLB en de bovenkant van de buis) onder de cultuur zonnekap en incubeer decidual weefsel bij 37 ° C gedurende 20 minuten in een schudden waterbad (145 rpm 2 g).
- Na incubatie, verwijder de folie van paraffine en steriliseren van het oppervlak van de buis met verteerd weefsel met 70% ethanol en brengen onder de zuurkast. Schud de buis kort met de hand.
- Celsuspensie van de metalen zeef (250 μm, grootte 60 mesh) in een nieuwe verpakking van de steriele specimen verzamelen. Verdun met een gelijk volume (20 mL) van RPMI + 10% FBS met 0,1% normocin om te stoppen met enzymatische reactie. Ga direct naar centrifugeren stap 4.1.
- Indien nodig, plaats de resterende onverteerd weefsel terug in een nieuwe tube van 50 mL met 20 mL verse enzymatische spijsvertering oplossing en herhaal spijsvertering (20 min, 37 ° C, schudden waterbad).
- Als een tweede spijsvertering noodzakelijk is, plaatst u de eerste buis met celsuspensie op ijs (cover met paraffine film te houden steriel). Herhaal stap 3.5-3.6 en combineren van de twee cellen schorsingen.
4. het genereren van een enkel celsuspensie
- Centrifugeer de celsuspensie (420 g, 4 ° C, 11 min).
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 40 mL van RPMI + 2% FBS met 0,1% normocin ("wash buffer").
Opmerking: Cel pellet los en gelatine-achtige als gevolg van besmetting van rode bloedcellen, want deze worden gecombineerd supernatant met de nodige voorzichtigheid. Verwijdering van de bovenste fase met een handmatige pipet kan worden verlangd. - Herhaal het centrifugeren bij 420 g bij 4 ° C voor 11 min.
- Verwijder voorzichtig het supernatant (zoals vermeld in noot stap 4.2) en resuspendeer de pellet cel in 5 mL was buffer en het toevoegen van 35 mL lysisbuffermengsel erytrocyt in de dezelfde buis.
Opmerking: Als de pellet groot of zeer bloedige is, het kan worden gesplitst in twee buizen voor de erytrocyt lysis stap door toevoegen van 10 mL was buffer en gelijkelijk te verdelen in twee buizen en vervolgens 35 mL lysisbuffermengsel erytrocyt toe te voegen aan elke buis. - Incubeer op ijs gedurende 20 minuten kort vortex sproeibuis(-buizen) aan het begin en het einde van de incubatie lyse van de rode bloedcellen.
- Centrifugeer bij 420 g gedurende 11 minuten bij 4 ° C.
- Zorgvuldig, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 40 mL was buffer.
- De cellen doorlopen een 70 μm nylon filter verwijderen cel klontjes.
- Centrifugeer bij 420 g gedurende 11 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 10 mL volledige voedingsbodem (RPMI 10% + FBS met 0,1% normocin).
-
Cellen tellen met behulp van de trypan blauwe kleurstof-uitsluiting hemocytometer procedure zoals hieronder beschreven:
- Onder de motorkap cultuur Pipetteer zachtjes celsuspensie op en neer 3 x om het grondig mengen voordat combineren met blauwe trypan. In een 1,5 mL tube bereiden celsuspensie, verdund 1:2 (combineren 20 μL van trypan blauwe oplossing) en 20 μL van decidual celsuspensie. Meng zorgvuldig trypan blauw-cell oplossing door pipetteren omhoog en omlaag een paar keer (deze oplossing is niet steriel).
- Plaats de hemocytometer in het werkgebied van de microscoop met glas dekglaasje aan bovenop.
Opmerking: Hemocytometer is een microscoopglaasje met rasters op het geven van negen grote pleinen verdeeld door drie lijnen. Elke grote plein heeft een oppervlakte van 1 mm,2, en de diepte van de vloeistof in de zaal is 0.1 mm. Daarom is de hoeveelheid vloeistof die elk groot vierkant vullen kan 1 mm * 1 mm * 0.1 mm = 0.1 mm3= 10-4 mL. - Voeg langzaam 10 μl van het mengsel van de blauw-cel trypan in de groef van de hemocytometer, waardoor capillaire actie te verspreiden het mengsel cel over de gehele dia (halte voordat mengsel goed vult).
- Bekijk de cellen onder een microscoop (bij 10 X vergroting) en tellen alle cellen met wit/groen trypan blauw (dit zijn de levensvatbare cellen) in de vier grote buitenste kwadraten van het hemocytometer uitsluiten. Wanneer cellen die de regel raken tellen, tellen alleen degenen die touch rechts en bovenste lijnen maar niet aanraken van de linker- en onderste lijnen. Tellen niet donker blauwe cellen; blauwe kleur geeft aan dat de cel dood zoals trypan blauwe kleurstof gemakkelijk via het plasmamembraan in het cytoplasma doordringen kan.
- Voor het berekenen van het aantal levensvatbare cellen in 1 mL celsuspensie (X):
2 = verdunningsfactor
10.000 = omrekeningsfactor (1 mL = 1 cm3 = 10, 000 * 0.1 mm3)
- Decidual cellen naar een wenselijk eindconcentratie in RPMI + 10% verdunnen FBS (groeimedium).
Opmerking: Voor weefselkweek beplating, Pipetteer 2 * 106 cellen per putje in een kunststof plaat van 6-well, 10 * 106 cellen in een 10-cm kunststof plaat of 75.000 cellen aan een glas dekglaasje aan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te controleren van de doeltreffendheid en levensvatbaarheid van de geïsoleerde cellen, ze werden gekenmerkt door twee methoden: stroom cytometry en immunocytochemie (ICC). 4 cel populaties werden gericht; decidualized stromale cellen werden ontdekt door de anti-vimentin antistof, pan-leukocyte marker CD45 werd gebruikt voor het identificeren van decidual immuuncellen, cytokeratin werd gebruikt voor het detecteren van epitheliale/endotheliale cellen en tot slot cytokeratin 7 werd gebruikt om op te sporen een potentiële trofoblast (chorion of placenta) besmetting.
Voor de karakterisering door multicolor imaging stroom cytometry, werden vers geïsoleerde decidual cellen gekleurd met een muur kleurstof om cellulaire levensvatbaarheid. De cellen waren permeabel en vaste, gevolgd door de kleuring met fluorescerende-geconjugeerde muis monoklonale antilichamen gericht op vimentin-APC, cytokeratin, CD45-APC-H7 en cytokeratin-FITC 7-PerCP. Antilichaam-informatie wordt weergegeven in de Tabel van materialen. Vaste en gekleurde cellen werden opgeslagen bij 4 ° C's nachts in de buffer ter voorkoming van dissociatie van tandem kleurstof en uitvoeren van de volgende dag op de afbeelding stream MK2 imaging stroom cytometer kleuring. De analyse werd uitgevoerd met behulp van een software. Cel puin en aggregaten werden uitgesloten door de seriële poorten met behulp van drie opeenvolgende functie/mask combinaties (figuur 1A-B). Fluorescentie Minus één (FMO) gating besturingselementen werden gebruikt voor het identificeren van positieve decidual cel populaties en één vlek cellen werden gebruikt voor compensatie (Figuur 2). Laatste punt plots tonen de positief gebeitst celpopulatie van de vier markers (Figuur 2) en de cellulaire levensvatbaarheid van 80% (Figuur 1 c). Representatieve beelden van positief gekleurde cellen te zien in Figuur 1 d. Met behulp van deze methode, vonden we dat de bevolking voornamelijk bestaat uit stromale cellen (55-60%), leukocyten (35%), epitheliale (1%) of de cellen van de trofoblast (0.01%) (figuur 1E). Het experiment werd herhaald drie keer. Deze resultaten Controleer de zuiverheid (afwezigheid van trofoblast besmetting van de chorion) en hoge levensvatbaarheid van primaire menselijke decidual cellen verzameld en geïsoleerd van de foetale membranen van term placentae.
In een aparte ICC-experiment, werden vers geïsoleerde decidual cellen zaadjes op glas coverslips (75.000 cellen/dekglaasje aan), kunnen hechten en bleef in cultuur gedurende 48 uur. Media werd veranderd na 24 uur te verwijderen dode cellen niet-ingeschrevenen. De cellen werden vervolgens vast met 50% aceton - 50% methanol, permeabel met 0,02% niet-ionogene oppervlakteactieve stof en aspecifieke bindend is geblokkeerd met het blokkeren van de oplossing. De cellen werden dan gekleurd met muis monoklonale antilichamen: anti-CD45 (pan-leukocyte marker), anti-cytokeratin (epitheliale cel marker) en anti-cytokeratin 7 (trofoblast marker), en de geit polyklonale anti-vimentin antistof (stromale cellen marker). Ezel anti-geit en ezel-antimuis werden gebruikt als secundaire antilichamen. DAPI werd gebruikt om de kernen vlek. Muis IgG, geit IgG en secundaire antilichamen alleen werden als negatief en specificiteit controles gebruikt. Beelden werden genomen bij 20 X vergroting op een draaiende schijf confocal microscoop. Antilichamen gebruikt zijn vermeld in Tabel van materialen en representatieve beelden worden weergegeven in Figuur 3. Onze visuele waarneming geeft aan dat de meerderheid van de bijgevoegde primaire decidual cellen zijn vimentin-positieve stromale cellen (ca. 95%), met een klein aantal leukocyten (ca. 1-2%), epitheliale (ca. 1%) en de trofoblast cel populaties (enkelvoudige cellen waren gedetecteerd accounting voor < 0.01% van alle). Het grote verschil tussen de stroom cytometrische en ICC resultaten is de afname van de CD45 positief leukocyte bevolking gedetecteerd door stroom cytometry. Dit verschil kan worden verklaard door de methoden waarin de twee experimenten werden uitgevoerd: in de stroom cytometry analyse, geïsoleerde decidual cellen werden onmiddellijk verwerkt en gekleurd, wat betekent de leukocyten bevolking werd opgenomen in de analyse. Met ICC, was de totale decidual celsuspensie verguld en gedurende 48 uur in de media dat was meestal ter ondersteuning van de gehechtheid van stromale en epitheliale cellen, maar een niet immune cellen gekweekt. Na 24 h werden de immuuncellen die gekoppeld waren op niet verwijderd tijdens media verandering, boekhouding voor het verschil in resultaten gepresenteerd door deze twee methoden. Wij geconcludeerd dat voor de studie van leukocyten subpopulatie in menselijke decidua van gecompliceerde zwangerschappen speciale voorzorgsmaatregelen moeten worden gebruikt om te voorkomen dat per ongeluk eliminatie van de leukocyten bevolking.
Figuur 1: Gating strategie voor decidual cel bevolking discriminatie. (A) vers geïsoleerde vaste decidual cellen werden aanvankelijk gated om cel paren, en (B) vervolgens gated gebruik te maken van drie opeenvolgende functie/mask combinaties uit te sluiten van cel puin te sluiten. (C) levende cellen (roze poort, 80% van de totale bevolking) werden onderscheiden van dode cellen (blauwe poort, 20% van de totale bevolking) met behulp van een kleurstof corrigeerbare levensvatbaarheid. (D) de representatieve beelden van decidual cellen gekleurd met levensvatbaarheid marker en vier TL-geconjugeerde antilichamen (Ab) (vimentin-APC, cytokeratin, CD45-APC-H7 en cytokeratin-FITC 7-PerCP). Decimale schaal bar is gelijk aan 7 μm. (E) zodra een puin-gratis, live celpopulatie was bepaald, werden deze markeringen gebruikt om te bepalen van de percentages van elk celtype binnen de decidual-celpopulatie. Voor de cijfers 1B en 1 Cvertegenwoordigt elke stip een eencellige decidual. Voor figuren 1A en 1 Ctoont het kleurbereik van de stip percelen celdichtheid, met rode betekenende zeer dichte cellen en blauw minder dichte cellen. Hier gepresenteerde gegevens is vertegenwoordiger van 3 biologische replicatieonderzoeken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Representativeflow cytometrische analyse van primaire menselijke decidual cellen met FMO gating percelen. Representatieve kleur dot percelen van cellen geïsoleerd van term decidua en gekleurd met (A) vimentin-APC (stromale cellen marker), (B) CD45-APC-H7 (leukocyte marker), (C) cytokeratin-FITC (epitheliale cel marker) en (D) cytokeratin 7-PerCP (trofoblast marker) naast elke respectieve FMO-controle. TL-Minus-One (FMO) controles, buizen waarin het volledige antilichaam cocktail minus de markering in vraag en bereid zijn identiek aan het volledig gekleurd experimentele monster, werden gebruikt tijdens stroom cytometry data-analyse om te bepalen waar positief decidual cel populaties. FMO controles laat de relatieve achtergrond en laat voor nauwkeurige gating van echte positieve signalen. Hier gepresenteerde gegevens is vertegenwoordiger van 3 biologische replicatieonderzoeken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger Immunocytochemical analyse van primaire menselijke decidual cellen. Primaire menselijke decidual cellen werden geteeld op glas coverslips voor 48 h, met media wijzigingen na 24 h. cellen werden vastgesteld met aceton-methanol en gekleurd met monoclonal muis anti-CD45 (leukocyte marker), anti-cytokeratin (epitheliale cel marker) en anti-cytokeratin 7 (trofoblast marker) antilichamen en geit polyklonale anti-vimentin antistof (stromale cellen marker). Representatieve beelden tonen (A) vimentin-positieve fibroblasten (secundaire Abs: donkey anti-geit), (B) CD45 + leukocyten (secundaire Abs: donkey-antimuis), (C) cytokeratin positieve epitheliale cellen (secundaire Abs: ezel anti-muis) en (D) cytokeratin 7-positieve trofoblast cellen (secundaire Abs: donkey-antimuis) werden gedetecteerd (rode vlekken). DAPI kleuring werd gebruikt voor het verven van de kernen van cellen (blauw kleuring). Niet-specifieke muis en geit IgG (M IgG en G IgG) werden gebruikt als negatieve controles, weglaten primaire Abs werden gebruikt als secundair antilichaam besturingselementen (alleen M 2nd en G 2nd alleen). Images zijn geschoten op 20 X vergroting op een DMI draaiende schijf confocal microscoop. Schaal bars = 32 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol beschreven hier toont een kosten en tijd effectieve methode voor het isoleren van de primaire decidual cellen van de foetus membranen van de gehele menselijke term placentae verzameld die is zeer toegankelijk en eenvoudig. Het succes van dit protocol is afhankelijk van twee kritische factoren, (1) de efficiëntie van de decidual afschrapen van de chorion-laag van de foetale membranen en (2) de zorg waarmee de decidual cellen in het gehele protocol worden behandeld. Het is belangrijk dat de chorion weefsel besmetting wordt beheerst door ervoor te zorgen dat geen per ongeluk opgenomen is tijdens de decidual schrapen en door het identificeren en verwijderen van elke besmetting tijdens het wassen stappen (het verschil in de decidua en chorion morfologie zorgt voor eenvoudige verwijdering van de chorion die per ongeluk kan worden verzameld met de decidua). Decidual cellen zijn kwetsbaar dus snel en frequente pipetteren kan leiden tot verminderde levensvatbaarheid. Wij stellen voor, vervolgens, dat de pipet ejector snelheidsinstelling langzaam blijven moet en minimale pipetteren moet worden gebruikt bij het mengen van cellen.
Een van de manieren waarin dit protocol besmetting van de trofoblast voorkomt is door uitsluitend verzamelen decidua van de foetale membranen van de placenta (bestaande uit de decidua parietalis), met uitzondering van de collectie van de decidua basalis die wordt gedaan door het nemen van biopten van de moeders kant van de placenta. Daarom, terwijl onze huidige protocol de zuiverheid van de decidual-celpopulatie we isoleren verbetert, sluit een deel van de decidua (d.w.z. decidua basalis) die als een beperking voor onderzoek gericht op dit deel van de decidua kan opleveren of wanneer beide secties van de decidua zijn vereist. Deze uitsluiting omvat de grootste beperking van dit onderzoek. Bovendien, terwijl het isoleren van de decidual cellen van menselijke patiënten zorgt voor een meer biologisch relevant inzicht in decidual en zwangerschap onderzoek, minder manipulatie en minder perioden kunnen worden bestudeerd in vergelijking met knaagdier gebaseerde studies ethische redenen.
In dit protocol, er zijn stappen die blijken kunnen te maken van de moeilijkheden, en als het niet goed verzacht mei invloed hebben op de opbrengst van de cel en de levensvatbaarheid. Om rond dit, kunnen wijzigingen moeten worden gemaakt. Het belangrijkst is om ervoor te zorgen dat de decidual schrapen off van de foetale membranen is voldoende (stap 2.4); Als gevolg van menselijke variabiliteit, kan elke placenta afwijken in termen van de hoeveelheid decidual weefsel, weefsel consistentie en niveau van weefsel droogheid. Het is belangrijk te moduleren het schrapen om ervoor te zorgen dat alleen de decidua wordt verwijderd. Als de decidua en membranen droog zijn, worden PBS-/-kan gegoten op de membranen te voorzien in eenvoudiger schrapen. De tweede stap is de erytrocyt lysis van de decidual celsuspensie (stap 3.4). Zoals gezegd, als de cel pellet zeer groot is en een hoog gehalte aan bloed bevat, kan de pellet worden gesplitst in twee buizen ter verbetering van de efficiëntie van het lysing. Als er nog steeds rode bloedcellen na deze stap kan er een noodzaak om te splitsen van de pellet in meer buizen voor maximale efficiëntie.
Terwijl verschillende decidual isolatie protocollen uit de term placenta en isolatie van het baarmoederslijmvlies cel uit niet-zwangere vrouwen ondergaan operaties eerder gepubliceerde18,19 zijn, blijken deze methoden niet verschillende beperkingen, zoals de levensvatbaarheid van de laag cellen en aangrenzende weefsel besmetting. Wij vonden deze grenzen bij het ontwerpen van het protocol gepresenteerd hier, die leidt tot grotere cel opbrengst, toegenomen levensvatbaarheid en het verminderde risico van besmetting van de omringende weefsels. Eerder, automatische dissociations zijn gebruikt om het mechanisch afbreken van de decidual weefsel19,20. Deze methode is relatief hard zoals het bevat een krachtige mechanische dissociatie waar het decidual weefsel wordt verzameld in een buis, ingevoegd in de machine die op dezelfde manier naar een blender werkt door snel draaien schaar te breken van weefsel, wat resulteert in Verminderde levensvatbaarheid. Onze nieuwe hier beschreven methode combineert een korte (20 minuten) enzymatische spijsvertering gecombineerd met zachte rockende water bad bewegingen optreden in plaats van mechanische kracht toegepast op het weefsel. De spijsvertering van de enzymatische oplossing is ter vergroting van de levensvatbaarheid van de cellen en rendement, met (1) collagenase te verteren de extracellulaire matrix van het decidual weefsel; (2) een soja trypsine remmer om te voorkomen dat niet-specifieke spijsvertering als gevolg van een resterende trypsinolytic activiteit van de collagenase; (3) DNase 1 vrij zwevende DNA (4) foetale runderserum (FBS) en bovien serumalbumine (BSA) eiwitten aan cellen beschermen tegen overmatige spijsvertering te verwijderen. De tweede belangrijke beperking van eerdere studies schuilt in het feit dat de decidua basalis werd verzameld door het snijden van de bovenste laag van de moederlijke zijde van de placenta die leiden trophoblastic besmetting tot kan. Onze nieuwe protocol isoleert de decidua parietalis door voorzichtig schrapen de decidua uit het foetale membraan (chorion) en zorgt voor gemakkelijk verwijderen van chorion besmetting tijdens de stappen wassen.
Daarom onze methode geschikt is voor een ongecompliceerde isolatie van primaire decidual cellen verzameld uit placenta membranen in een korte periode van tijd (het hele proces duurt ongeveer 3 uur) wat resulteert in hoge cel opbrengst en levensvatbaarheid van de uitstekende cellen. Als decidual cellen geïsoleerd werden kunnen zij worden gebruikt voor een veelheid van experimenten; bijvoorbeeld, menselijke primaire decidual cellen kunnen worden uitgezaaid op coverslips immunocytochemische p.a., zij kunnen worden geteeld in cultuur voor diverse behandelingen en manipulaties, evenals rechtstreeks gekleurd voor multicolor stroom cytometry analyse te beoordelen de samenstelling van menselijke decidua met zwangerschapscomplicaties in een poging om te begrijpen van de rol van de verschillende cel subpopulatie. Terwijl de methode die hier gepresenteerd werd gebruikt om te isoleren van cellen uit de term placenta (het einde van het derde trimester van de dracht van de menselijke), kan dit protocol ook gemakkelijk aangepast worden aan de eerste en de tweede trimester placenta flexibiliteit van de fase van de dracht dat is de aanpak van iemands onderzoek.
Gepubliceerde protocollen hebben vroeger automatische dissociations te breken uit elkaar decidual weefsel of enzymatische spijsvertering alleen21,22. Door het combineren een zachte mechanische kracht (schommelen waterbad bij 37 ° C) evenals een enzymatische spijsvertering cocktail ontworpen om te optimaliseren, zowel de spijsvertering en de levensvatbaarheid van de cellen, creëert het bovengenoemde protocol de ideale balans tussen cel opbrengst en levensvatbaarheid. Bovendien hebben de eerdere protocollen niet te vermelden de cel Totaal opbrengst verkregen uit hun isolatie en slechts huidige cel levensvatbaarheid percentage19. Hier laten we een hoog rendement van decidual cellen bepaald door cel tellen (variërend van 10-20 miljoen per placenta). Bovendien, veel van de huidige publicaties tonen het isolement van de primaire decidual/baarmoederslijmvlies cellen van muizen; ons protocol voorziet in de studie van de menselijke weefsels, waardoor zij een meer biologisch relevante bron van cellen voor experimenten23. Dit protocol kan ook gemakkelijk aangepast worden aan de eerste en de tweede trimester placenta flexibiliteit van de fase van de dracht dat iemands onderzoek is richt. Zodra de cellen geïsoleerd werden, kunnen ze worden gebruikt in een verscheidenheid van experimentele technieken zoals immunocytochemie, stroom cytometry, eiwitten en RNA extractie, latere isolatie van leukocyten, etc. in een poging om te begrijpen van de rol van de andere cel subpopulatie. Nieuwe doelstellingen die helpen bij het kunnen voorschrijven identificeren van verschillen in gen- en eiwit expressie in de decidua tussen gezonde en gecompliceerde zwangerschappen (zoals pre-eclampsie of vroeggeboorte arbeid) door het gebruik van real-time PCR of genoom-brede verbonden studies de ontwikkeling van diagnostische en therapeutische instrumenten. Bovendien, kunnen wijzigingen in de verhouding van decidual cellen, specifiek leukocyten, die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd door het gebruik van stroom cytometry ook voorzien in antwoorden de etiologie van zwangerschapscomplicaties, zoals veranderingen in beide leukocyten subpopulatie ratio's, evenals hun status van de activering, die hebben aangetoond te worden gemoduleerd in zowel de termijn en de premature Arbeid24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
De auteurs bedank de donoren, de RCWIH BioBank, en Mount Sinai Hospital/UHN afdeling Obstetrie en Gynaecologie voor de menselijke specimens in deze studie gebruikt. Bedank de leden van de loog lab, met name Dr. Caroline Dunk voor haar hulp bij de ontwikkeling van de methode. Dit werk wordt ondersteund door de Burroughs Welcome Fonds (grant #1013759).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
References
- Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. Decidualization and relevance to menstruation. , Cambridge University press. 187-212 (1990).
- Kariya, M. Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).
- Wu, W. -X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy. Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).
- Bell, S. C. Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua. Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).
- Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. Decidual natural killer cells: key regulators of placental development. Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).
- Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy. Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).
- Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor. Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).
- Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms. Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).
- Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).
- Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).
- Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women. Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biology of Reproduction. 86, 39 (2011).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. Cytokines and infection-induced preterm labour. Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).
- Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. The role of leukocyte traffic and activation in parturition. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).
- Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface. Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).
- Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface. Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).
- Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens. Journal of Visualized experiments. 87, (2014).
- Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue. Journal of Visualized experiments. 112, (2016).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).
- Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).
