Summary
Denne protokol viser en metode til isolering af primær decidual menneskeceller indsamlet fra de føtale membraner i sigt efterbyrd, som kan bruges til en lang række applikationer (dvs. immuncytokemi, flowcytometri, etc.) med det formål at studere rollen, som forskellige cellepopulationer i graviditetskomplikationer.
Abstract
Decidua, også kendt som gravid endometriet, er en kritisk vigtige reproduktive væv. Decidual celler, består hovedsagelig af decidualized stromale celler og immunceller, er ansvarlig for udskillelsen af hormonelle og provokerende faktorer, som er afgørende for vellykket blastocyst implantation, placenta udvikling og spiller en rolle den indledning af arbejdskraft på sigt og præmature. Mange graviditetskomplikationer kan opstå fra perturbationer af en fin balance mellem forskellige cellepopulationer bestående af decidua. Ændringer i andelen af specifikke decidual celletyper kan forstyrre disse afgørende processer og øge risikoen for at udvikle alvorlige komplikationer af graviditet, såsom embryo implantation fiasko, intrauterin vækst begrænsning, præeklampsi og præmature arbejdskraft. Den protokol, der er skitseret her viser en omkostninger og tid effektiv metode til isolering af primær decidual menneskeceller indsamlet fra de føtale membraner af udtrykket efterbyrd. Ved at kombinere enzymatisk fordøjelse og blid mekanisk afbrydelse af det decidual væv, blev et højt udbytte af decidual celler opnået med stort set ingen chorion forurening. Vigtigere, isoleret decidual celler blev præget (stromale celler (55-60%), leukocytter (35%), epithelial (1%) eller trofoblast (0,01%) celler) og vedligeholdes højt levedygtighed (80%), hvilket blev bekræftet af flerfarvet imaging flow flowcytometri assay. Denne protokol er specifikke for decidua parietalis og kan tilpasses til første og andet trimester efterbyrd. Når isoleret, kan decidual celler bruges til en lang række eksperimentelle applikationer med henblik på at forstå rollen, som forskellige decidual celle delpopulationer i graviditetskomplikationer.
Introduction
Endometriet, en af de mest aktive voksne kvindelige væv, gennemgår dramatiske remodeling hver menstruationscyklus i respons på stimulation af æggestokkene hormoner, østrogen (E2) og progesteron (P4). Decidua, også kendt som gravid endometriet, er en kritisk vigtige reproduktive væv, der dannes ved udgangen af den postovulatory fase som følge af P4-drevet differentiering efter E2-dominerende proliferativ fase. Decidual celler er ansvarlige for udskillelsen af hormonelle faktorer for vellykket blastocyst implantation og udvikling af grænsefladen utero-placenta for at opretholde maternel tolerance over for den føtale allograft.
Decidualization kræves for implantation og efterfølgende remodellering af decidual spiral arterier. Endometrie stromale celler underkastes decidualization, under kontrol af P4 og cAMP, sen luteal fase af menstruationscyklus1. Denne proces er indledt omkring blodkar og breder sig i hele stroma, tyder på sin rolle i Vaskulaturen remodellering og leukocyt handel forordning. Denne cellulære transformation er karakteriseret ved en cirkulær morfologi, øget nukleare størrelse og udvidelse af ru endoplasmatiske reticulum og Golgi apparatet2. Decidualized stromale celler er i stand til at producere paracrine faktorer støtte blastocyst implantation og karakteriseret ved udskillelsen af talrige hormoner (dvs. prolaktin), angiogene vækstfaktorer, insulin vækstfaktor bindende protein-1 (IGFBP-1), prostaglandin (PG) E (stimulator af intracellulære cAMP), cytokiner, ekstracellulære matrix komponenter og næringsstoffer afgørende for placenta implantation og udvikling af3,4,5,6 .
Den decidual celle befolkning består ikke udelukkende af decidualized stromale celler, men indeholder også store, graviditet-specifikke decidual leukocyt populationer. Decidualization indebærer forbigående lokaliseret ødem og tilstrømning af Natural killer (NK) celler, T-celler, dendritiske celler og makrofager. Den største leukocyt delpopulation er de uterine NK celler, bestående af ca. 50-70% af alle mødres leukocytter infiltrerer decidua, som er en kilde af cytokiner og angiogene faktorer, som kan støtte i decidualization processen og stigning i antallet i hele graviditeten7. Makrofager, at være den næststørste delpopulation af immunceller, er fundet i nærheden af webstedet implantation og øge under graviditet8. De er en kilde af cytokiner og vækst faktorer såsom koloni stimulerende faktor (CSF-1)9, tumor nekrose faktor α (TNFα)10 og prostaglandin (PG) E11.
Under graviditeten, og før sigt arbejdskraft er decidua en væsentlig kilde til cytokiner og kemokiner ansvarlig for maternel perifere leukocyt aktivering og efterfølgende migration i de uterine væv at indlede arbejdskraft. Dyreforsøg viste, at mange pro-inflammatoriske cytokiner er op-reguleret i mus decidua under fødslen, såsom TNF-a, IL-6, IL-12, og IL-1b12. I den menneskelige decidua udviser pro-inflammatoriske cytokiner IL-1b, IL-6 og IL-8 (store neutrofile chemoattractant) højere udtryk i løbet af arbejdskraft i forhold til ikke i labor13. Disse udskilles cytokiner resultatet i en aktivering og tilstrømning af leukocytter i decidual væv14; en stigning i decidual makrofag og neutrofile infiltration i både menneskelige og rotte er set under sigt arbejdskraft, med decidual infiltration forud myometrial bukkes 4 gange større, der angiver en kaskade af aktivering mellem denne to-tilstødende uterin væv 15. disse infiltrerer leukocytter producerer PGs i stand til at aktivere synkron sammentrækninger af myometrium16, matrix metalloproteinases (MMPs) at indlede membran briste17,18, samt pro-inflammatoriske cytokiner til at forstærke uterine aktivisering oparbejde ('cytokin storm').
På grund af mange vigtige funktioner i decidual celler, såsom at spille en afgørende rolle i implantation proces, opretholdelse af maternel-føtal tolerance i tidlige drægtighed og deltager i aktivering af arbejdskraft på sigt, kan forskellige patologier opstå under graviditet. For eksempel kan (1) infertilitet på grund af tilbagevendende implantation fiasko og tilbagevendende graviditet tab skyldes en fejl i decidual modning; (2) intrauterin vækst begrænsning (IUGR) og preeclampsia på grund af forkert udvikling og dysfunktion af decidua/moderkagen eller kompromitteret vaskulære transformation på decidual-myometrial junction; samt (3) præterm fødsel, som kan følge af for tidlig decidual aktivering.
I lyset af disse store lidelser, kombineret med de etiske og praktiske begrænsninger af menneskelige i vivo undersøgelser, oprettelse af primære menneskelige decidual cellelinjer er afgørende for in vitro- analyse med det formål at bedre forståelse og forbedrer kliniske håndtering af graviditetskomplikationer. Formålet med vores forskning var derfor, at udvikle en protokol, som giver til isolering af menneskelige primære decidual celler med høj celle udbytte og levedygtighed indsamlet fra de føtale membraner af udtrykket efterbyrd. Denne aktuelle protokol klart beskrives en tid og omkostninger effective metode for isolering af specifikke undertyper af decidual celler der bruges til en bred vifte af in vitro- analyser. Karakterisering af overfloden og fænotype af decidual delpopulationer på sigt og sammenligning til første eller andet trimester er afgørende for at definere deres roller i hele menneskelige drægtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Efterbyrd er indsamlet fra sunde sigt, ikke i labor kvinder, der gennemgår elektiv kejsersnit sektioner. Indsamling, forarbejdning og engangs menneskelige prøver overholde retningslinjerne for bestyrelsens Mount Sinai Hospital etik. En skriftlig samtykke fra hver enkelt patient. Denne undersøgelse er godkendt af etik forskningsudvalg på Mount Sinai hospitalet.
1. præparater
Bemærk: Alle trin skal udføres under et stinkskab og alle kirurgiske udstyr skal være steriliseret via autoklave inden anbringelsen i stinkskab. Alle andre materialer (flasker, 50 mL rør, osv.) skal være steriliseret med 70% ethanol opløsning. Altid slid personlige værnemidler til enhver tid, når du arbejder med biologisk affald (laboratoriekittel, handsker, lange hår bundet tilbage, osv.).
-
Enzymatisk fordøjelsen løsning (endelige løsning: 200 mL)
- Der afpipetteres 180 mL HBSS-/ - i et 500 mL bægerglas, tilføje sterile omrøring magnet og placere på omrøring plade ved stuetemperatur.
- Afvejes og tilføje følgende til HBSS/løsning langsomt og sekventielt: 20 mL af FBS, 400 mg Collagenase 2 ([endelige] = 2 mg/mL), 20 mg soja bønne trypsin inhibitor ([endelige] = 0,1 mg/mL), 30 mg DNase 1 ([endelige] = 0,15 mg/mL), og 200 mg BSA ([endelige] = 1 mg/mL)
- Indstil omrøring til medium hastighed, og lad blandingen omrøres i 10-20 min (dække med tin folie eller paraffin film under omrøring).
- Hæld blandede løsningen i en 250 mL glasflaske ved hjælp af en plastik tragt og plads i stinkskab.
- Passere gennem en plastik top filtrering enhed (0,22 μm membranfilter, 500 mL), alikvot 20 mL 50 mL rør (10 rør total) og opbevares ved-20 ° C indtil brug.
-
RPMI 1640 medier (2% vask løsning og 10% komplet vækstmediet)
- Kombiner RPMI 1640 og FBS i en glasflaske i stinkskab.
- 2% FBS løsning, kan du kombinere 490 mL RPMI 1640 og 10 mL FBS.
- 10% FBS løsning, kan du kombinere 450 mL RPMI 1640 og 50 mL FBS.
- Tilsæt 500 μL af normocin i 500 mL glasflaske fra det forrige trin, der indeholder RPMI medier og FBS (50 mg/mL stock, 0,05 mg/mL arbejder koncentration).
- Passere medier gennem et 0,22 μm membranfilter og butik i en 500 mL glasflaske ved 4 ° C indtil brug.
- 30 min før du starter eksperimentet, anbringes 20 mL alikvot af frosne enzymatisk fordøjelsen løsning i et 37 ° C perle bad, placere 2% FBS og 10% FBS RPMI 1640 medier i et 37 ° C perle bad, tænde den vuggende vandbad indstillet til 37 ° C , 2 g, og sæt en temperatur kontrolleret centrifuge til 4 ° C.
2. indsamling af Decidual væv fra sigt placentamembranerne
- Placer flasker med HBSS +/ +, HBSS-/-fem 50 mL rør i et rack under stinkskab. Der afpipetteres 25 mL af HBSS +/ + i et rør.
-
Brug behandskede hænder, tage sigt moderkagen fra beholdere anvendt til transport af det fra teatret operationsstuen. Placer moderkagen på ble pad (moderens side opad) og sprede de føtale membraner ud ved hjælp af saks og pincet.
- Lå overlappende ble puder på stinkskab.
- Bruge en separat ble til flip moderkagen så i moderens side er ansigt op.
- Find punktet af membran brud og gøre indsnit at tillade membran til at udfolde sig og lægge fladt på fumehood overflade.
Bemærk: Når membranen er trukket tilbage fra moderkagen, decidua vil være ansigt op hviler på chorion-laget med dyr lag på bagsiden.
- Ved hjælp af en plastik celle skraber, forsigtigt skrabe det decidual væv off chorion og sted i en 50 mL tube med 25 mL HBSS +/ +.
- Skrabe membran med moderat pres. Gælde ikke for meget pres, da det kan resultere i chorion forurening. Indsamle små blodpropper så godt, da disse indeholder nogle decidual celler.
Advarsel: Efter decidual indsamling, skal moderkagen pakket i en biohazard plast bin og frosset i en-20 ° C fryser før passende bortskaffelse (efter din institutionelle regler). Blodige ble puder skal indpakket i en sæl-stram plastpose og bortskaffes i en biologisk sikkerhed box.
3. vask og Enzymatisk nedbrydning af det Decidual væv
- Vask indsamlet væv af forsigtigt ryste 50 mL tube i hånden og passerer en 250 μm metal sigten (250 μm, størrelse 60 mesh) hvile over et sterilt prøvemateriale (urin) container.
- Gentag vaskes to gange med HBSS +/ + og to gange med HBSS-/ - i frisk rør til hver vask. (endelig vasker med HBSS-/-giver mulighed for fjernelse af calcium og magnesium findes i HBSS +/ +, som ellers ville forstyrre de følgende enzymatisk fordøjelsesprocessen).
BEMÆRK. Under vask trin bliver chorion væv forurening tilsyneladende som det decidual væv er lys pink i farven og amorf, mens chorion er hvide, tætte og trævlet. Derfor, chorion kontaminering kan let fjernes med pincet. - Valgfrit, hvis det decidual væv er tyk, overføre det til en steril 10 cm diameter petriskål og fortsætter til hakkekød væv med to modsatrettede skalpeller i fadet.
-
Placere den vasket væv i sterile 50 mL tube indeholdende 100 mg af væv/mL af enzymatisk fordøjelsen løsning (Se præparater).
- Som et referencepunkt, sikre, at niveauet for decidual væv når 5-10 mL mærket på 50 mL tube.
- Bruge ca 20 mL af enzymatisk fordøjelsen løsning (tilberedt i trin 1.1) til at fordøje de samlede decidua indsamlet fra en hele udtrykket føtal membran.
- Forsegle hætten af røret med paraffin film (forsegling røret stramt og wrap paraffin film omkring den fælles landbrugspolitik og toppen af røret) under kulturen hætte og inkuberes decidual væv ved 37 ° C i 20 min. i en rystende vandbad (145 rpm 2 g).
- Efter inkubationen fjerne paraffin film og sterilisere overfladen af røret indeholder fordøjet væv med 70% ethanol og bringe under stinkskab. Ryst glasset kort i hånden.
- Indsamle cellesuspension gennem metal sigten (250 μm, størrelse 60 mesh) til en ny beholder, sterilt prøvemateriale. Fortyndes med en tilsvarende mængde (20 mL) RPMI + 10% FBS indeholdende 0,1% normocin til at stoppe enzymatisk reaktion. Gå direkte til centrifugering trin 4.1.
- Hvis det er nødvendigt, placere den resterende ufordøjet væv tilbage i en ny 50 mL tube med 20 mL af frisk enzymatisk fordøjelsen løsning og gentage fordøjelsen (20 min, 37 ° C, ryster vandbad).
- Hvis en anden fordøjelse er nødvendigt, placere den første slange med cellesuspension på is (dække med paraffin film til at holde sterile). Gentag trin 3,5-3,6 og kombinere to celler suspensionerne.
4. generere en enkelt cellesuspension
- Der centrifugeres cellesuspension (420 g, 4 ° C, 11 min).
- Fjern supernatanten og resuspend celler i 40 mL af RPMI + 2% FBS indeholdende 0,1% normocin ("vaskebuffer").
Bemærk: Celle pellet vil være løs og gelatinøse på grund af røde blodlegemer forurening, Aspirér supernatanten med forsigtighed. Fjernelse af de øverste fase med en manuel pipette kan være påkrævet. - Gentag centrifugering ved 420 g ved 4 ° C for 11 min.
- Omhyggeligt fjernes supernatanten (som nævnt i Note trin 4.2) og resuspenderes celle i 5 mL af wash buffer og tilsaettes 35 mL erytrocyt lysisbuffer i det samme rør.
Bemærk: Hvis pelleten er stor eller meget blodige, det kan opdeles i to rør for erytrocyt lysis trin ved tilsætning af 10 mL af wash buffer og opdele ligeligt i to rør og derefter tilføje 35 mL af erytrocyt lysisbuffer til hver tube. - Der inkuberes i isbad i 20 min. kort vortex røret i begyndelsen og slutningen af inkubation til lyse røde blodlegemer.
- Der centrifugeres ved 420 g i 11 minutter ved 4 ° C.
- Grundigt, Fjern supernatanten og resuspenderes i 40 mL af wash buffer.
- Passere en 70 μm nylon filter til at fjerne celle klumper af celler.
- Der centrifugeres ved 420 g i 11 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og celle resuspenderes i 10 mL af komplette mellemstore (RPMI 10% + FBS der indeholder 0,1% normocin).
-
Tælle celler benytter trypan blå farvestof-udelukkelse hemocytometer procedure som beskrevet nedenfor:
- Under kultur hood forsigtigt afpipetteres cellesuspension op og ned 3 x for at blandes grundigt før kombinere med trypan blå. I en 1,5 mL tube forberede cellesuspension, fortyndes 1:2 (kombinere 20 μL af trypan blå løsning) og 20 μL decidual cellesuspension. Bland omhyggeligt trypan blå-celle løsning af pipettering op og ned et par gange (denne løsning ikke er sterilt).
- Sted hemocytometer på scenen i mikroskop med glas coverslip på toppen.
Bemærk: Hemocytometer er et objektglas med gitre på det at give ni store firkanter divideret med tredobbelt linjer. Hver store square har et areal på 1 mm2, og dybden af væske i salen er 0.1 mm. Mængden af væske, der kan udfylde hver store kvadrat er derfor 1 mm * 1 mm * 0,1 mm = 0.1 mm3= 10-4 mL. - Langsomt tilføje 10 μL trypan blå-celle blandingen ind i rillen af hemocytometer, tillader kapillaritet at sprede celle blandingen over hele diaset (stop før blandingen fylder godt).
- Se celler under mikroskop (ved 10 X forstørrelse) og tælle alle hvid/grøn celler, der udelukker trypan blå (disse er de levedygtige celler) i de fire store ydre pladser for hemocytometer. Når tælle celler, der rører linjen, Tæl kun de at touch højre og øverste linjer, men ikke dem at røre venstre og nederste linjer. Tæl ikke med mørk blå celler; blå farve indikerer at cellen er død som trypan blå farvestof kan nemt trænge ind gennem plasmamembran i cytoplasmaet.
- Til at beregne antallet af levedygtige celler i 1 mL cellesuspension (X):
2 = fortyndingsfaktoren
10.000 = omregningsfaktor (1 mL = 1 cm3 = 10, 000 * 0,1 mm3)
- Fortynd decidual celler til et ønskeligt, endelig koncentration i RPMI + 10% FBS (vækstmedium).
Bemærk: For vævskultur plating, afpipetteres 2 * 106 celler/brønd i en 6-godt plastplade, 10 * 106 celler ind i en 10-cm plastik plade eller 75.000 celler til et glas coverslip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at validere effektivitet og levedygtighed af de isolerede celler, de var præget af to metoder: flow flowcytometri og immuncytokemi (ICC). 4 cellepopulationer var målrettet; decidualized stromale celler blev opdaget af anti-vimentin antistoffet, pan-leukocyt markør CD45 blev brugt til at identificere decidual immunceller, cytokeratin blev brugt til at registrere epitelial/endotelceller og endelig cytokeratin 7 blev brugt til at registrere nogen potentielle trofoblast (chorion eller placenta) forurening.
Til karakterisering af flerfarvet imaging flowcytometri, blev frisk isolerede decidual celler farves med et fixable farvestof at afgøre cellulære levedygtighed. Cellerne var permeabilized og faste, efterfulgt af farvning med fluorokrom-konjugeret mus monoklonale antistoffer rettet mod vimentin-APC, CD45-APC-H7, cytokeratin-FITC og cytokeratin 7-PerCP. Antistof oplysninger er angivet i Tabel af materialer. Fast og farvede celler blev opbevaret ved 4 ° C natten over i farvning buffer for at undgå dissociation af tandem farvestof og køre den følgende dag på billedet stream MK2 imaging flow Flowcytometret. Analysen blev udført ved hjælp af en software. Celle debris og aggregater blev udelukket af serielle gating ved hjælp af tre sekventielle Funktionsmaske kombinationer (figur 1A-B). Fluorescens Minus én (FMO) gating kontrol blev brugt til at identificere positive decidual cellepopulationer og enkelt pletten celler blev brugt til kompensation (figur 2). Endelige dot parceller demonstrere positivt farves cellen befolkningen i de fire markører (figur 2) og cellulære levedygtighed på 80% (figur 1 c). Repræsentative billeder af positivt farvede celler kan ses i figur 1 d. Brug denne metode, fandt vi, at befolkningen først og fremmest bestod af stromale celler (55-60%), leukocytter (35%), epithelial (1%) eller trofoblast (0,01%) celler (figur 1E). Eksperimentet blev gentaget tre gange. Disse resultater kontrollere renhed (fravær af trofoblast forurening fra chorion) og høj rentabilitet af primære humane decidual celler indsamlet og isoleret fra de føtale membraner i sigt efterbyrd.
I en separat ICC eksperiment, var frisk isolerede decidual celler seedet på glas coverslips (75.000 celler/coverslip), lov til at vedhæfte og forblev i kultur i 48 timer. Medier blev ændret efter 24 timer til at fjerne løsgængere døde celler. Cellerne blev derefter fast med 50% acetone - 50% methanol, permeabilized med 0,02% nonionisk overfladeaktivt stof og uspecifik bindende blev blokeret med blokering løsning. Cellerne blev derefter farves med musen monoklonale antistoffer: anti-CD45 (pan-leukocyt markør), anti-cytokeratin (epitelcelle markør) og anti-cytokeratin 7 (trofoblast markør), og ged polyklonale anti-vimentin antistof (stromale celle markør). Æsel anti-ged og æsel anti-mus blev brugt som sekundære antistoffer. DAPI blev brugt til at plette kerner. Musen IgG, ged IgG og sekundære antistoffer alene blev brugt som negativ og specificitet kontrolelementer. Billeder blev taget på 20 X forstørrelse på en roterende disk Konfokal mikroskop. Antistoffer bruges er anført i Tabel af materialer og repræsentative billeder præsenteres i figur 3. Vores visuel observation angiver, at størstedelen af vedlagte primære decidual celler er vimentin-positive stromale celler (ca. 95%), med et lille antal leukocytter (ca. 1-2%), epithelial (ca. 1%) og trofoblast cellepopulationer (enkelt celler blev opdaget tegner sig for < 0,01% af alle). Den største forskel mellem flow cytometric og ICC resultater er faldet i CD45 positive leukocyt befolkning påvist ved flowcytometri. Denne uoverensstemmelse kan forklares ved de metoder, som de to eksperimenter blev udført: i flow flowcytometri analyse, isoleret decidual celler blev straks forarbejdes og farves, betydningen leukocyt befolkning blev medtaget i analysen. Med ICC, blev den samlede decidual cellesuspension forgyldt og kulturperler i 48 timer i medier, der for det meste støtter udlæg i stromale og epitel celler, men ikke immunceller. Efter 24 timer var de immunceller, der ikke var knyttet fjernes under media ændring, tegner sig for forskellen i resultaterne præsenteres af disse to metoder. Vi konkluderede, at for at studere leukocyt delpopulationer i menneskelige decidua fra komplicerede graviditeter særlig forsigtighed bør anvendes til at undgå utilsigtet fjernelse af befolkningens leukocyt.
Figur 1: Gating strategi for decidual celle befolkning forskelsbehandling. (A) frisk isolerede fast decidual celler blev oprindeligt låge for at udelukke celle dubletter, og (B) efterfølgende låge ved hjælp af tre sekventielle Funktionsmaske kombinationer for at udelukke celle debris. (C) levende celler (pink gate, 80% af den samlede befolkning) blev differentieret fra døde celler (blå gate, 20% af den samlede befolkning) ved hjælp af en fixable levedygtighed farvestof. (D) repræsentative billeder af decidual celler farves med levedygtighed markør og fire fluorescerende-konjugerede antistoffer (Ab) (vimentin-APC, CD45-APC-H7, cytokeratin-FITC og cytokeratin 7-PerCP). Punkteret skalalinjen er lig med 7 μm. (E) når en debris-gratis, levende celle befolkning var bestemt, disse markører blev anvendt til at bestemme procentdelen af hver celletype inden for befolkningens decidual celle. For tal 1B og 1 Crepræsenterer hver dot en enkelt decidual celle. For tal 1A og 1 Cskildrer farveområde af dot parceller celle tæthed, med røde tilkendegiver meget tætte celler og blå mindre tætte af celler. Data præsenteres her er repræsentant for 3 biologiske replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Representativeflow cytometric analyse af primære humane decidual celler med FMO gating plots. Repræsentative farve dot parceller af celler isoleret fra sigt decidua og farves med (A) vimentin-APC (stromale celle markør), (B) CD45-APC-H7 (leukocyt markør), (C) cytokeratin-FITC (epitelcelle markør) og (D) cytokeratin 7-PerCP (trofoblast markør) sammen med hver respektive FMO kontrol. Lysstofrør-Minus-One (FMO) kontrolelementer, rør, der indeholder den fulde antistof cocktail minus markør i spørgsmålet og forberedt identisk med den fuldt farves eksperimentel prøve, blev brugt under flow flowcytometri dataanalyse til at bestemme sandt positive decidual cellepopulationer. FMO kontrol viser den relative baggrund og giver mulighed for nøjagtig gating af sandt positive signaler. Data præsenteres her er repræsentant for 3 biologiske replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant Immunocytochemical analyse af primær decidual menneskeceller. Primære humane decidual celler blev dyrket på glas coverslips for 48 h, med medier forandringer efter 24 h. celler blev fastsat med acetone-methanol og farves med monoklonale musen anti-CD45 (leukocyt markør), anti-cytokeratin (epitelcelle markør) og anti-cytokeratin 7 (trofoblast markør) antistoffer, og ged polyklonale anti-vimentin antistof (stromale celle markør). Repræsentative billeder viser (A) vimentin-positive fibroblaster (sekundær Abs: æsel anti-ged), (B) CD45 + leukocytter (sekundær Abs: æsel anti-mus), (C) cytokeratin positive epitelceller (sekundær Abs: æsel anti-mus) og (D) cytokeratin 7-positive trofoblast celler (sekundær Abs: æsel anti-mus) blev opdaget (rød farvning). DAPI farvning blev brugt til at farve kerner af celler (blå farvning). Ikke-specifikke mus og ged IgG (M IgG og G IgG) blev brugt som negative kontroller, udelade primære Abs blev brugt som sekundær antistof kontrolelementer (M 2nd kun og G 2nd kun). Billeder er taget på 20 X forstørrelse på DMI spinning disc Konfokal mikroskop. Skalere barer = 32 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her viser en omkostninger og tid effektiv metode til at isolere primære decidual celler indsamlet fra de føtale membraner af hele den menneskelige sigt efterbyrd, der er meget tilgængeligt og ligetil. Succes i denne protokol er afhængige af to kritiske faktorer, (1) effektivitet af decidual skrabning fra chorion-laget af føtale membraner og (2) den omhu, hvormed håndteres de decidual celler i hele protokollen. Det er vigtigt at chorion væv forurening er kontrolleret ved at sikre, at ingen er ved et uheld medtaget under decidual skrabning og ved at identificere og fjerne enhver forurening under vask trin (forskellen i decidua og chorion morfologi tillader til nem fjernelse af chorion, som kan indsamles ved et uheld med decidua). Decidual celler er skrøbelige derfor hurtige og hyppige pipettering kan resultere i nedsat levedygtighed. Vi foreslår derefter, at indstillingen pipette ejector hastighed bør forblive på langsom og minimal pipettering skal bruges når du blander celler.
En af de måder, hvorpå denne protokol forhindrer trofoblast forurening af udelukkende indsamling decidua fra de føtale membraner af moderkagen (bestående af decidua parietalis), bortset fra indsamling af decidua basalis, hvilket gøres ved at tage biopsier fra moderens side af moderkagen. Derfor, mens vores nuværende protokol forbedrer renheden af decidual celle befolkningen vi isolere, det udelukker en del af decidua (dvs. decidua basalis), som kan optræde som en begrænsning for forskning rettet mod denne del af decidua eller Hvornår begge dele af decidua er påkrævet. Denne udelukkelse omfatter den største begrænsning af denne undersøgelse. Derudover mens isolere decidual celler fra menneskelige patienter giver mulighed for en mere biologisk relevante indsigt i decidual og graviditet forskning, mindre manipulation og færre perioder kan studeres i forhold til gnaver-baserede undersøgelser af etiske årsager.
I hele denne protokol, der er skridt, som kan vise sig for at skabe problemer, og hvis ikke ordentligt mildnet kan påvirke celle udbytte og levedygtighed. For at komme rundt om dette, kan ændringer skal foretages. Den mest kritiske er at sikre, at den decidual skrabe ud af føtale membraner er tilstrækkelig (trin 2.4); på grund af menneskelige variabilitet, kan hver moderkagen være forskellige med hensyn til mængden af decidual væv, væv konsistens og niveau af væv tørhed. Det er vigtigt at modulere ciula for at sikre, at kun decidua er at blive fjernet. Hvis decidua og membraner er tørre, blive PBS/kan hældt på membraner til at tillade lettere skrabning. Det andet skridt er erytrocyt lysering af decidual cellesuspension (trin 3,4). Som nævnt, hvis den celle pellet er meget stort og indeholder en høj mængde af blod, kan pellet opdeles i to rør til at forbedre effektiviteten af den lysing. Hvis der stadig er røde blodlegemer efter dette trin kan der være behov for at opdele pelleten i flere rør for maksimal effektivitet.
Mens forskellige decidual isoleret protokoller fra sigt moderkagen og isolation af endometrie cellen fra ikke-gravide kvinder, der gennemgår Hysterektomier har været tidligere offentliggjorte18,19, opfylder disse metoder ikke forskellige begrænsninger, såsom lav celle levedygtighed og tilstødende væv forurening. Vi fandt disse grænser når du udformer den protokol, der præsenteres her, hvilket fører til større celle udbytte, øget levedygtighed og reduceret risiko for smitte fra omgivende væv. Automatiske dissociations har tidligere, været brugt til mekanisk nedbryde decidual væv19,20. Denne metode er relativt hårdt da det omfatter en kraftig mekaniske dissociation hvor det decidual væv er indsamlet i en tube, indsat i den maskine, som fungerer på samme måde til en blender af hurtigt roterende Sakse til at nedbryde væv, resulterer i nedsat cellernes levedygtighed. Vores nye metode beskrevet her kombinerer en kort (20 minutter) Enzymatisk nedbrydning kombineret med blid vuggende vand bad bevægelser handler i stedet for mekanisk kraft, vævet. Den enzymatiske nedbrydning løsning er designet til at øge cellernes levedygtighed og udbytte, der indeholder (1) collagenase for at fordøje den ekstracellulære matrix af decidual væv; (2) en sojabønne trypsin hæmmer at forhindre ikke-specifikke fordøjelsen på grund af en resterende trypsinolytic aktivitet af collagenase; (3) DNase 1 at fjerne frit svævende DNA (4) føtal bovint serum (FBS) og bovint serumalbumin (BSA) protein til at beskytte celler fra over fordøjelsen. Den anden store begrænsning af tidligere undersøgelser er bosat i, at decidua basalis blev indsamlet ved at skære den øverste lag af moderkagen, som potentielt kan føre til trophoblastic forurening moderens side. Vores nye protokol isolerer decidua parietalis af forsigtigt skrabe decidua off den føtale membran (chorion) og giver mulighed for nem fjernelse af chorion forurening under vask trin.
Derfor vores metode giver mulighed for en ukompliceret isolation af primær decidual celler indsamlet fra placentamembranerne i en kort periode (hele processen tager ca 3 timer) resulterer i høje celle udbytte og fremragende cellernes levedygtighed. Når decidual celler blevet isoleret kan de bruges til en lang række eksperimenter; for eksempel, menneskelig primær decidual celler kan være seedet på coverslips for andre analyser, de kan være dyrket i kultur for forskellige behandlinger og manipulationer, samt direkte farvet for multicolor flow flowcytometri analyse til at vurdere de sammensætning af human decidua med graviditetskomplikationer i forsøg på at forstå rollen, som forskellige sub cellepopulationer. Mens metoden præsenteres her blev brugt til at isolere cellerne fra sigt moderkagen (slutningen af tredje trimester af menneskelige drægtighed), kan denne protokol også være let tilpasses til først og den anden trimester moderkagen giver mulighed for fleksibilitet af drægtigheden fase at tackle ens forskning.
Tidligere har publicerede protokoller brugt automatisk dissociations til at bryde fra hinanden decidual væv eller enzymatisk fordøjelsen alene21,22. Ved at kombinere en blid mekanisk kraft (rokkende vandbad ved 37 ° C) samt en enzymatisk fordøjelsen cocktail designet til at optimere fordøjelsen og cellernes levedygtighed, skaber protokollen skitseret ovenfor den ideelle balance mellem celle udbytte og levedygtighed. Derudover har tidligere protokoller undladt at nævne cellen total afkast opnået fra deres isolering og kun nuværende celle levedygtighed procentdel19. Her viser vi et højt udbytte af decidual celler bestemmes gennem celle tælle (spænder fra 10-20 millioner pr. moderkagen). Desuden, mange af de aktuelle publikationer demonstrere dyrkning af primære decidual/endometrisk celler fra mus; vores protokol giver mulighed for undersøgelse af menneskelige væv, gengivelse sig en mere biologisk relevante kilde af celler for eksperimenter23. Denne protokol kan også være let tilpasses til først og den anden trimester moderkagen giver mulighed for fleksibilitet i drægtighedsperioden scenen, at ens forskning henvender sig til. Når cellerne har været isoleret, kan de bruges i en række eksperimentelle teknikker såsom immuncytokemi, flowcytometri, proteiner og RNA udvinding, efterfølgende isolation af leukocytter, etc. i forsøg på at forstå rollen, som forskellige celle delpopulationer. At identificere forskelle i gen- og protein udtryk i decidua mellem sund og komplicerede graviditeter (såsom præeklampsi eller præterm arbejdskraft) ved hjælp af real-time PCR eller genom bred forbundet undersøgelser kan give nye mål, som kan støtte i udvikling af diagnostiske og terapeutiske værktøjer. Derudover kan forandringer i forholdet hos decidual celler, specielt leukocytter, som let kan identificeres ved hjælp af flowcytometri også give svar for ætiologien af graviditetskomplikationer, såsom ændringer i både leukocyt delpopulation nøgletal samt deres aktivisering status, som har vist sig at moduleres i både udtrykket og præmature labor24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke donorerne, RCWIH BioBank, og Mount Sinai Hospital/UHN Institut for Obstetrik og Gynækologi for de menneskelige prøver, der anvendes i denne undersøgelse. Vi vil gerne takke medlemmerne af lud lab, især Dr. Caroline Dunk for hendes hjælp med metodeudvikling. Dette arbejde støttes af Burroughs velkommen fond (grant #1013759).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
References
- Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. Decidualization and relevance to menstruation. , Cambridge University press. 187-212 (1990).
- Kariya, M. Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).
- Wu, W. -X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy. Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).
- Bell, S. C. Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua. Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).
- Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. Decidual natural killer cells: key regulators of placental development. Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).
- Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy. Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).
- Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor. Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).
- Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms. Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).
- Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).
- Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).
- Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women. Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biology of Reproduction. 86, 39 (2011).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. Cytokines and infection-induced preterm labour. Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).
- Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. The role of leukocyte traffic and activation in parturition. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).
- Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface. Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).
- Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface. Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).
- Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens. Journal of Visualized experiments. 87, (2014).
- Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue. Journal of Visualized experiments. 112, (2016).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).
- Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).
