Summary
Bu iletişim kuralı bir yöntem için birincil insan decidual hücreleri çeşitli uygulamalar (Yani immunocytochemistry, Akış Sitometresi, vb) için kullanılan terim placentae fetal membranlar toplanan yalıtım gösterir hedefleyen farklı hücre popülasyonlarının gebelik komplikasyonları olarak rol çalışmak için.
Abstract
Decidua olarak da bilinen hamile endometrium, kritik düzeyde önemli bir üreme dokudur. Decidual hücreleri, esas olarak decidualized stromal hücreler ve bağışıklık hücreleri, oluşan salgısı ve hormonal ve inflamatuar faktörlerin hangi başarılı blastosist implantasyonu, plasental gelişimi için kritik olan ve bir rol oynamak için sorumlu term ve preterm emek başlangıcında. Birçok gebelik komplikasyonları farklı hücre popülasyonlarının decidua oluşan ince bir denge tedirginlikler ortaya çıkabilir. Belirli decidual hücre tipleri oranındaki değişikliklere çok önemli bu işlemler bozabilir ve gebeliğin embriyo implantasyonu başarısız, intrauterin büyüme kısıtlama, preeklampsi gibi ciddi komplikasyonlar riskini artırmak ve Preterm emek. Burada özetlenen protokolü bir maliyet ve zaman birincil insan decidual hücrelerin izolasyonu için etkili yöntem dönem placentae fetal membranlar toplanan gösterir. Enzimatik sindirim ve decidual doku nazik mekanik bozulma birleştirerek, yüksek verim decidual hücre hemen hemen hiçbir koryon kirlenme ile elde edildi. Önemlisi, izole decidual hücreleri ile karakterize (stromal hücreler (55-%60), lökosit (% 35), epitel (% 1) veya (% 0.01) Trofoblast hücreleri) ve çok renkli görüntüleme Akış Sitometresi tahlil tarafından doğrulandı yüksek canlılık (% 80) yapılmaktadır. Bu iletişim kuralı için decidua parietalis belirli ve birinci ve ikinci üç aylık placentae için adapte edilebilir. Bir zamanlar decidual hücreler farklı decidual hücre alt nüfus içinde gebelik komplikasyonları rolünü anlamak amaçlayan deneysel uygulamalar için kullanılabilir.
Introduction
Endometrium, biri en aktif yetişkin kadın dokuları, dramatik yumurtalık hormonlar, (E2) östrojen ve progesteron (P4) tarafından yanıt olarak uyarılması her adet döngüsü remodeling uğrar. Decidua olarak da bilinen hamile endometrium, P4 tahrik farklılaşma E2-baskın proliferatif faz takip sonucunda postovulatory aşamasının sonunda oluşan kritik düzeyde önemli bir üreme dokudur. Hormonal faktörler başarılı blastosist implantasyon ve fetal homogreft anne tolerans korumak için rahim plasental arayüzü geliştirilmesi salgılanmasını sorumlu decidual hücrelerdir.
Decidualization implantasyon ve sonraki decidual sarmal damarların remodeling için gereklidir. Endometrium stromal hücreler decidualization P4 ve kamp, kontrol altında geç luteal faz1adet döngüsü sırasında tabi. Bu işlem kan damarları ve damarlara yenileme ve düzenleme kaçakçılığı lökosit rolü düşündüren stroma boyunca yayılır çevresinde başlatılır. Bu hücresel dönüşüm dairesel Morfoloji, artan nükleer boyutu ve kaba endoplazmik retikulum ve Golgi aygıtı2genişleme ile karakterizedir. Decidualized stromal hücreler blastosist implantasyon desteklemek parakrin faktörler üretebilen ve çok sayıda hormonlar (Yani prolaktin), anjiogenik büyüme faktörleri, insülin büyüme faktörü bağlayıcı protein-1 salgılanmasını tarafından karakterize (IGFBP-1), prostaglandin (PG) E (hücre içi kampın uyarıcı), sitokinler, hücre dışı matriks bileşenleri ve gerekli besinlerden plasental implantasyon ve geliştirme3,4,5için,6 .
Decidual hücre nüfus yalnızca decidualized stromal hücreler oluşur değil ama büyük, gebelik özgü decidual lökosit nüfus da içerir. Decidualization geçici lokalize ödem ve doğal öldürücü (NK) hücreleri, T-hücreleri, dendritik hücreleri ve makrofajlar akını içerir. En büyük lökosit subpopulation tüm maternal lökosit Infiltrating sitokinler kaynağı olan decidua ve decidualization sürecinde yardım ve artış anjiogenik faktörler yaklaşık % 50-70 oluşan rahim NK hücreleri olduğunu gebelik7boyunca numarası. Makrofajlar, bağışıklık hücreleri, ikinci büyük subpopulation olmak ve gebelik8sırasında artış implantasyon site içinde bulundu. Onlar sitokinler kaynağıdır ve büyüme faktörleri gibi koloni uyarıcı faktör (CSF-1)9, tümör nekrozis faktör α (TNFα)10 ve prostaglandin (SY) E11.
Hamilelik boyunca ve terim emek önce decidua sitokinler ve kemokinler sorumlu anne periferik lökosit harekete geçirmek ve emek başlatmak için rahim dokuların içine sonraki geçiş için büyük bir kaynaktır. Hayvan çalışmaları gösterdi kadar fare decidua içinde düzenlenir, çok sayıda pro-inflamatuar sitokinlerin doğum sırasında gibi TNF-a, Il-6, IL-12 ve IL-1b12. İçinde insan decidua, pro-inflamatuar sitokinlerin IL-1b, Il-6 ve Il-8 (büyük nötrofil chemoattractant) sırasında emek değil emek13' te kıyasla daha yüksek ifade sergi. Bunlar salgılanan sitokinler sonuç bir harekete geçirmek ve lökosit akını decidual dokular14; decidual makrofaj ve nötrofil infiltrasyon her iki insan ve fare bir artış decidual infiltrasyon myometrial 4'e katlanmış büyük bir çağlayan bu iki bitişik rahim dokulara arasında etkinleştirme gösteren önceki dönem doğum sırasında görülür 15. bunlar lökosit infiltre PGs myometrium16eşzamanlı kasılmaları aktive yeteneğine sahip üretmek, membran başlatmak için matriks metalloproteinazların (MMPs) rüptürü17,18, hem de pro-inflamatuar sitokinlerin rahim etkinleştirme işlemi ('sitokin fırtına') yükseltmek için.
Decidual hücrelerinin, erken gebelik ve terim, vasıl belgili tanımlık harekete geçirmek-emek katılan maternal-fetal tolerans Bakımı implantasyon sürecinde kritik bir rol oynuyor gibi birçok önemli işlevleri nedeniyle farklı patolojileri sırasında ortaya çıkabilir gebelik. Örneğin, tekrarlayan implantasyon başarısızlığı ve tekrarlayan gebelik kaybı nedeniyle (1) infertilite decidual olgunlaşma hatasından kaynaklanabilir; (2) intrauterin büyüme kısıtlama (IUGR) ve preeklampsi uygunsuz geliştirme ve decidua/plasenta veya decidual myometrial kavşağında güvenliği aşılan vasküler dönüştürme işlev bozukluğu nedeniyle; (3) erken doğum yanı sıra hangi erken decidual aktivasyon neden olabilir.
İnsan in vivo çalışmalar, etik ve pratik sınırlamalar ile birleştiğinde bu önemli bozuklukların ışığında birincil insan decidual hücre hatları kurulması vitro analiz amacı ile daha iyi anlaşılması için gerekli olan ve gebelik komplikasyonları klinik yönetiminin iyileştirilmesi. Bu nedenle, bizim araştırma amacı insan birincil decidual hücreleri yüksek hücre verim ve dönem placentae fetal membranlar toplanan canlılığı ile yalıtım için izin veren bir protokol geliştirmekti. Decidual, belirli alt türlerinden yalıtma hangi hücreleri için bu geçerli protokol açıkça bir zaman ve cost effective yöntemi açıklanır var olmak kullanılmış için a değişiklik-in vitro analizler. Bereket karakterizasyonu ve fenotip terim ve karşılaştırma birinci veya ikinci üç aylık dönem için decidual alt nüfusun insan gebelik boyunca onların rolleri tanımlama için önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Placentae sağlıklı vadede değil seçmeli cesarean bölüm geçiren işçi kadınlar üzerinden toplanır. Toplama, işleme ve insan örnekleri tek kullanımlık Mount Sinai Hastanesi Etik Kurulu yönergeleri için uygun. Yazılı izni her hastadan elde edilir. Bu çalışmada, Mount Sinai Hastanesi araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlıkları
Not: Tüm adımları bir duman başlık altında yürütülen gerekir ve duman başlıklı yerleşim önce otoklav ile tüm cerrahi aletler sterilize edilmiştir. Tüm diğer malzemeler (şişeler, 50 mL tüpler, vb) % 70 etanol çözüm ile sterilize gerekir. Her zaman giyim kişisel koruyucu ekipman her zaman biyolojik atık (önlük, eldiven, uzun saç geri bağlı, vb) ile çalışırken.
-
Enzimatik sindirim çözüm (nihai çözüm: 200 mL)
- HBSS - 180 mL pipet / - steril karıştırma mıknatıs 500 mL kabı ekleyin ve yer oda sıcaklığında plaka karıştırma.
- Tartmak ve şu HBSS-/-yavaş yavaş ve sırayla ekleyin: FBS, 20 mL 400 mg Collagenase 2 ([final] 2 mg/mL =), 20 mg soya fasulyesi tripsin inhibitörü ([final] = 0,1 mg/mL), 30 mg Dnaz 1 ([final] 0.15 mg/mL =) ve 200 mg BSA ([final] 1 mg/mL =)
- Karıştırma için Orta hızda ayarlayın ve 10-20 dk (kalay folyo veya parafin film süre karıştırma ile kapak) için karıştırın karışım izin verin.
- Karışık çözüm plastik huni kullanarak 250 mL cam şişe içine dökün ve duman mahallede yer.
- Bir plastik top filtrasyon ünitesi (0,22 mikron membran filtre, 500 mL), aliquot 20 mL 50 mL tüpler (10 tüpler toplam) ve mağaza-20 ° c kadar kullanım ile çözüme geçmek.
-
RPMI 1640 medya (çözüm ve % 10 tam büyüme orta yıkama %2)
- RPMI 1640 ve FBS duman başlıklı bir cam şişe içinde birleştirir.
- İçin % 2 FBS çözüm, 490 mL RPMI 1640 ve 10 mL FBS birleştirin.
- % 10 FBS çözüm için 450 mL RPMI 1640 ve 50 mL FBS birleştirir.
- 500 mL cam şişe RPMI medya ve FBS (50 mg/mL stok, 0,05 mg/mL çalışma konsantrasyonu) içeren önceki adımdaki içine normocin 500 μL pipet.
- Medya aracılığıyla bir 0,22 mikron membran filtre ve mağaza 500 mL cam şişe 4 ° c kadar kullanmak geçirin.
- deneme, başlamadan önce 30 dk 20 mL aliquot, Enzimatik sindirim çözüm bir 37 ° C boncuk banyoda dondurulmuş koyun, %2 yer FBS ve 37 ° C boncuk banyo, % 10 FBS RPMI 1640 medyada üzerinde sallanan su banyosu açmak ve 37 ° C için ayarla , 2 g ve set 4 ° c sıcaklık kontrollü santrifüj
2. dönem plasental zarlar Decidual doku toplanması
- Yer HBSS ile şişe +/ +, HBSS-/- ve beş 50 mL tüpler bir rafa duman başlık altında. HBSS 25 mL pipet +/ + bir tüp.
-
Eldivenli ellerini kullanarak, terim plasenta ameliyathane tiyatro taşınmasında kullanılan kapsayıcı üzerinden çıkar. Plasenta bebek bezi pad (anne tarafı yukarı) yerleştirin ve makas ve forseps kullanarak fetal membranlar yayıldı.
- Üst üste gelen bebek bezi yastıkları duman kaputa yatıyordu.
- Böylece anne yan yüz kadar plasenta çevirmek için ayrı bir bez kullanın.
- Membran rüptürü nokta bulmak ve membran açılmak ve fumehood yüzeyinde yat izin vermek için insizyon olun.
Not: bir kez membran plasenta geri çekilir, decidua koryon katmandaki arka amnion katmanında ile dinlenme kadar yüzü olacak.
- Bir plastik hücre kazıyıcı kullanarak dikkatlice kazımak koryon ve 25 mL HBSS içeren 50 mL tüp yerde kapalı decidual doku +/ +.
- Orta basınç ile membran kazı. Koryon kirlenme neden olabileceğinden çok baskı uygulamayın. Küçük kan pıhtıları yanı sıra, bu decidual bazı hücreler içeren toplamak.
Dikkat: decidual toplandıktan sonra plasenta olmalı bir biohazard plastik depo gözünde paketlenmiş ve -20 ° C-dondurucu (göre kurumsal kurallarınızı) uygun bertaraf önce donup kalan ev. Kanlı bezi yastıkları mühür geçirmez plastik bir torbaya sarılmış ve biohazard kasa içinde bertaraf gerekir.
3. yıkama ve Enzimatik sindirim Decidual doku
- Yavaşça 50 mL tüp el sallayarak ve bir 250 Mikron metal elek (250 mikron, boyutu 60 mesh) steril numune (idrar) konteyner üzerinde dinlenme üzerinden geçen tarafından toplanan doku yıkayın.
- Yıkama HBSS ile iki kez tekrar +/ + ve iki kez ile HBSS-/ - her yıkama için taze tüpler. (final yıkar HBSS - ile /-kalsiyum ve magnezyum HBSS içinde mevcut kaldırılması için sağlar + / +, hangi aksi takdirde aşağıdaki Enzimatik sindirim işlemine engel).
DİKKAT EDİN. Çamaşır adımları uyguladığınızda, koryon doku kirlenme decidual doku pembe renkte ışık ve amorf, koryon ise beyaz, yoğun ve lifli olduğu belli olacak. Bu nedenle, koryon kirlenme Forseps ile kolayca kaldırılabilir. - İsteğe bağlı olarak, decidual doku kalın ise, steril 10 cm Çap petri kabına aktarmak ve tabak içinde iki karşıt neşter ile dokusunun kıyma geçin.
-
Yıkanmış doku doku/mL Enzimatik sindirim çözeltisi 100 mg içeren steril 50 mL tüp içinde yer (hazırlıklar bakın).
- Bir referans noktası olarak decidual doku düzeyini 5-10 mL işareti 50 mL tüp ulaştığından emin olmak.
- Bütün dönem fetal membran toplanan toplam decidua sindirmek için yaklaşık 20 mL Enzimatik sindirim çözeltisi (hazırlanan adım 1.1) kullanın.
- Parafin film ile tüpün kapağı kapatın (tüp sıkıca kapatın ve parafin film kapağı ve tüpün üst etrafında sarın) kültür altında hood ve titreyen bir su banyosu (145 rpm içinde 20 dk 37 ° C'de decidual doku kuluçkaya 2 g).
- Kuluçka sonra parafin film kaldırmak ve % 70 etanol ile sindirilir doku içeren boru yüzeyine sterilize ve duman başlık altında getir. Tüp kısaca el salla.
- Hücre süspansiyon metal elekten (250 mikron, boyutu 60 mesh) yeni bir steril numune konteyner içine toplamak. Bir eşit hacmi enzimatik reaksiyon durdurmak için RPMI + % 10 FBS kapsayan %0,1 normocin ile (20 mL) oranında seyreltin. Doğrudan Santrifüjü adıma 4.1 geçin.
- Gerekirse, 20 mL taze Enzimatik sindirim çözeltisi ile yeni bir 50 mL tüp içine geri kalan sindirilmemiş doku yerleştirin ve sindirim (20 dk, su banyosu sallayarak 37 ° C) tekrarlayın.
- İkinci bir sindirim gerekli ise, hücre süspansiyon ile ilk tüp buz (steril tutmaya parafin film ile kapak) yerleştirin. 3.5-3,6 adımı yineleyin ve iki hücre süspansiyonlar birleştirir.
4. bir tek hücre süspansiyon oluşturma
- Hücre süspansiyon (420 g, 4 ° C, 11 dk) santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve RPMI + %2 FBS içeren % 0,1 normocin ("yıkama tampon") 40 mL hücrelerde resuspend.
Not: Hücre Pelet gevşek ve kırmızı kan hücresi kontaminasyon nedeniyle jelatinimsi, dikkatle süpernatant Aspire edin. El ile bir pipet ile üst aşama kaldırılması gerekebilir. - Santrifüjü 420 g 4 ° c de 11 dk için yineleyin.
- Dikkatle süpernatant (Not Adım 4.2 içinde belirtildiği gibi) kaldırın ve hücre Pelet yıkama arabellek 5 mL resuspend ve 35 mL eritrosit lizis arabellek aynı tüpte ekleyin.
Not: Pelet büyük ya da çok kanlı ise, bu iki tüp eritrosit lizis adım için yıkama arabellek 10 mL ekleme ve eşit iki tüpler içine bölünüp her tüpün 35 mL eritrosit lizis arabelleği ekleyerek bölünebilir. - 20 dk. kısaca girdap tüpler başında ve sonunda, kırmızı kan hücreleri parçalayıcı kuluçka için buz üzerinde kuluçkaya.
- 4 ° C'de 11 dakika için 420 g, santrifüj kapasitesi
- Dikkatle, süpernatant kaldırmak ve Pelet yıkama arabellek 40 mL resuspend.
- Hücreleri hücre kümeleri kaldırmak için 70 mikron naylon filtre geçmek.
- 4 ° C'de 11 dk için 420 g, santrifüj
- Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 10 mL tam orta resuspend (RPMI % 10 + %0,1 normocin içeren FBS).
-
Aşağıda açıklandığı gibi trypan mavi boya-dışlama hemasitometre yordamı kullanarak hücreleri saymak:
- Kültür başlık altında hafifçe yukarı ve aşağı 3 x hücre süspansiyon trypan mavi ile birleştirerek daha önce iyice karıştırın için pipet. Bir 1,5 mL tüp hazırlamak hücre süspansiyon, 1:2 (birleştirme 20 μL trypan mavi çözüm) ve decidual hücre süspansiyon, 20 μL seyreltilmiş. Dikkatle trypan mavi-hücre çözümü birkaç kez (Bu çözüm steril değildir) yukarı ve aşağı pipetting karıştırın.
- Hemasitometre cam coverslip üstte mikroskopla sahne yerleştirin.
Not: Bir mikroskop slaytta Izgaralar ile üçlü çizgi tarafından bölünmüş dokuz büyük kareler vermek için hemasitometre var. Her büyük kare 1 mm2lik bir alana sahiptir ve sıvı odasında derinliği 0.1 mm. Bu nedenle, her büyük kare doldurabilirsiniz sıvı hacmi 1 mm * 1 mm olan * 0,1 mm = 0.1 mm310-4 mL =. - Yavaş yavaş trypan mavi-hücre karışımı 10 μL kılcal eylem hücre karışımı tüm slayta (karışımı de doldurur önce Durdur) dağıtmak için izin hemasitometre, oluk içine ekleyin.
- Hücreleri (10 X büyütme), mikroskop altında görüntüleyebilir ve (bu hücrelerin vardır) trypan mavi hemasitometre dört büyük dış karelerinin içinde hariç tüm beyaz/yeşil hücreleri saymak. Yolun dokunma hücre sayım sırasında yalnızca sağ dokunma ve üst satırları ama değil, bu sol ve alt çizgiler dokunmadan sayısı. Koyu mavi hücreler sayılmaz; mavi renk trypan mavi boya kolayca plazma zarı ile sitoplazma nüfuz edebilir gibi hücre ölü olduğunu gösterir.
- 1 ml hücre süspansiyon (X), hücrelerin sayısını hesaplamak için:
2 = seyreltme faktörü
10.000 dönüştürme faktörü = (1 mL = 1 cm3 = 10, 000 * 0,1 mm3)
- Bir arzu edilen son konsantrasyon RPMI + % 10 decidual hücrelere seyreltik FBS (büyüme orta).
Not: doku kültürü kaplama, 2 * 106 hücreler/iyi pipet plastik bir 6-şey plaka, 10 * 106 hücre içine 10 cm plastik tabak veya cam coverslip için 75.000 hücre içine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verimlilik ve izole hücre canlılığı doğrulamak için onlar iki yöntemlerle karakterize: Akış Sitometresi ve immunocytochemistry (ICC). 4 hücre popülasyonlarının hedef; pan-lökosit marker CD45 decidual bağışıklık hücreleri tanımlamak için kullanılan, cytokeratin epitel/endotel hücreleri algılamak için kullanılan ve son olarak, cytokeratin 7 herhangi algılamak için kullanılan decidualized stromal hücreler anti-vimentin antikor tarafından algılandı potansiyel Trofoblast (koryon veya plasenta) kirlenme.
Çok renkli görüntüleme Akış Sitometresi tarafından karakterizasyonu için taze izole decidual hücreleri hücresel canlılığı belirlemek için tamir edilebilir bir boya ile lekeli. Hücreleri permeabilized ve sabit, vimentin APC, CD45-APC-H7, cytokeratin-FITC ve cytokeratin 7 PerCP hedefleme fluorochrome Birleşik fare monoklonal antikorlar ile boyama tarafından takip. Antikor bilgi Malzemeleri tabloiçinde listelenir. Sabit ve lekeli hücreleri 4 ° C'de tandem boya ayrılma önlemek ve ertesi gün görüntü akışı MK2 görüntüleme Akış Sitometresi üzerinde çalıştırmak için arabellek boyama geceleme bekletildi. Bir yazılım kullanarak çözümlemenin. Hücre artıkları ve toplamları üç sıralı özelliği/maskesi bileşimlerini (şekil 1A-B) kullanarak seri çoğunluğuna tarafından dışlandı. Floresans eksi bir (FMO) gating denetimleri olumlu decidual hücre popülasyonlarının tanımlamak için kullanılan ve tek leke hücreleri için tazminat (Şekil 2) kullanılmıştır. Son nokta araziler dört işaretleri (Şekil 2) olumlu lekeli hücre nüfusa ve %80 (şekil 1 c) hücresel canlılığı göstermektedir. Temsili resim olumlu lekeli hücre şekil 1 diçinde görülebilir. Bu yöntemi kullanarak, esas olarak stromal hücreler (55-%60), lökosit (% 35), epitel oluşan popülasyon (% 1) veya (% 0.01) Trofoblast hücreleri (1E rakam) bulduk. Deneme üç kez tekrarlandı. Bu sonuçlar saflık (koryon kirlenme Trofoblast yokluğu) ve toplanan ve dönem placentae fetal membranlar izole birincil insan decidual hücreleri yüksek canlılık doğrulayın.
Ayrı bir ICC deneyde, taze izole decidual hücreleri eklemek için izin ve kültür için 48 saat kaldı cam coverslips (75.000 hücreler/coverslip), Tarih numaralı seribaşı. Medya 24 saat sonra ekli olmayan ölü hücreleri kaldırmak için değiştirildi. Hücreleri sonra % 50 aseton - %50 metanol, ile %0,02 non-iyonik yüzey aktif permeabilized ile tespit edildi ve belirsiz bağlama çözüm engelleme ile engellendi. Hücreleri sonra fare monoklonal antikorlar ile lekeli: anti-CD45 (pan-lökosit marker), anti-cytokeratin (epitel hücre işaretçisi) ve anti-cytokeratin 7 (Trofoblast marker) ve keçi poliklonal anti-vimentin antikor (stromal hücre işaretçisi). Eşek Anti-keçi ve eşek Anti-fare ikincil antikor kullanılmıştır. DAPI çekirdeklerin leke için kullanıldı. Fare IgG, keçi IgG ve ikincil antikorlar yalnız negatif ve özgüllük denetimleri kullanılmıştır. Görüntüleri dönen disk confocal mikroskop üzerinde 20 X büyütmede alındı. Antikorlar kullanılan Malzemeler tablo listelenir ve temsilcisi görüntüleri şekil 3' te sunulmaktadır. Bizim görsel gözlem iliştirilmiş birincil decidual hücreleri çoğunluğu gösterir (edildi tek hücre hücre popülasyonlarının vimentin pozitif stromal hücreler (yaklaşık % 95), lökosit (yaklaşık % 1-2), epitel (yaklaşık % 1) az sayıda ve Trofoblast vardır için muhasebe tespit < % 0,01 tüm). Akış sitometrik ve ICC sonuçları arasındaki en önemli fark CD45 pozitif lökosit nüfus Akış Sitometresi tarafından algılanan azalmadır. Bu tutarsızlık içinde iki deneyler yöntemlerle açıklanabilir: Akış Sitometresi Analizi, izole decidual hücreleri hemen işlendi ve lekeli, niyetli lökosit nüfus analize dahil. ICC ile toplam decidual hücre süspansiyon kaplama ve çoğunlukla stromal ve epitel hücreleri, ama değil bağışıklık hücreleri ve eki destekliyordu medya 48 saattir kültürlü. 24 saat sonra değil bağlı bağışıklık hücreleri medya değişim, bu iki yöntem tarafından sunulan sonuçlar farkı muhasebe sırasında kaldırıldı. Biz sonucuna lökosit alt nüfus karmaşık gebeliklerin özel önlem gelen insan decidua lökosit nüfusunun yanlışlıkla eleme önlemek için kullanılması gereken eğitimi için.
Şekil 1: decidual hücre nüfus ayrımcılık için strateji geçişi. (A) taze izole sabit decidual hücreleri başlangıçta hücre birini ve daha sonra hücre artıkları dışlamak için üç sıralı özelliği/maskesi bileşimlerini kullanarak geçişli (B) dışarıda bırakmak için kapı. (C) canlı hücreleri (pembe kapı, toplam nüfusun % 80'i) ölü hücreleri (mavi kapısı, toplam nüfusun % 20) ayırt tamir edilebilir canlılığı boya kullanarak. (D) temsilcisi görüntüleri decidual hücre canlılığı marker ve dört floresan Birleşik antikorlar (Ab) (vimentin APC, CD45-APC-H7, cytokeratin-FITC ve cytokeratin 7-PerCP) ile lekeli. Noktalı ölçek çubuğu 7 mikron eşittir. (E) bir kez bir enkaz ücretsiz, canlı hücre nüfus tespit edilmiştir, bu işaretleri her hücre tipi decidual hücre nüfus içinde yüzde belirlemek için kullanılmıştır. Şekil 1B ve 1 Ciçin her nokta tek bir decidual hücre temsil eder. Şekil 1A ve 1 Ciçin nokta araziler renk aralığını kırmızı simgeleyen son derece yoğun hücreler ve mavi hücreler daha az yoğun hücre yoğunluğu gösterilmektedir. Burada sunulan veri 3 Biyolojik çoğaltır temsilcisidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Representativeflow sitometrik analiz FMO araziler geçişi ile birincil insan decidual hücrelerinin. Temsilci renkli nokta araziler hücre terimi decidua izole ve (A) vimentin-APC (stromal hücre işaretçisi), (B) CD45-APC-H7 (lökosit marker), (C) cytokeratin-FITC (epitel hücre işaretçisi) ve (D) ile lekeli cytokeratin 7-PerCP (Trofoblast marker) ilgili her FMO denetimin yanında. Floresan eksi bir (FMO) denetimleri, soru işaretleyicisinde eksi kokteyl ve aynı şekilde tamamen lekeli deneysel örnek için hazırlanmış tam antikor içeren tüpler Akış Sitometresi veri çözümlemesi sırasında gerçek pozitif belirlemek için kullanılan decidual hücre popülasyonlarının. Göreli arka plan gösterir ve doğru doğru olumlu sinyaller geçişi için izin FMO kontrol eder. Burada sunulan veri 3 Biyolojik çoğaltır temsilcisidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: birincil insan decidual hücreleri analizini temsilcisi Immunocytochemical. Birincil insan decidual hücreleri üzerinde cam coverslips 48 h, 24 h hücre aseton-metanol ile sabit ve monoklonal fare anti-CD45 ile (lökosit marker), lekeli sonra medya değişikliklerle için yetiştirilen anti-cytokeratin (epitel hücre işaretçisi) ve Anti-cytokeratin 7 (Trofoblast marker) antikor ve keçi poliklonal anti-vimentin antikor (stromal hücre işaretçisi). Temsilcisi resimleri göster (A) vimentin pozitif fibroblastlar (ikincil Abs: eşek Anti-keçi), (B) CD45 + lökosit (ikincil Abs: eşek Anti-fare), (C) cytokeratin pozitif epitel hücrelerinin (ikincil Abs: eşek Anti-fare) ve (D) cytokeratin 7-pozitif Trofoblast hücreleri (ikincil Abs: eşek Anti-fare) algılanan (kırmızı boyama) olduğunu. DAPI boyama (mavi boyama) hücre çekirdekleri boya kullanılmıştır. Birincil atlama Abs kullanılan ikincil antikor denetimleri (M 2nd sadece ve sadece G 2nd ), spesifik olmayan fare ve keçi IgG (M IgG ve G IgG) negatif denetimler olarak kullanıldı. Görüntüleri DMI dönen disk confocal mikroskop üzerinde 20 X büyütmede alınır. Ölçek çubukları 32 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol bir maliyet ve çok erişilebilir ve doğru sözlü birincil decidual hücreleri izole için etkili yöntem tüm insan dönem placentae fetal membranlar toplanan saat gösterir. Bu protokol iki kritik faktörler, (1) decidual (2) ile decidual hücreler boyunca protokolünün işlenme bakım ve fetal membranlar koryon katmanından kazıma verimliliğini bağımlı bir başarıdır. Koryon doku kirlenme yok decidual kazıma sırasında ve belirlenmesi ve herhangi bir kirlenme çamaşır adımları (farkı decidua ve koryon Morfoloji sırasında kaldırma tarafından yanlışlıkla dahil olmasını sağlayabilmek tarafından denetlenir önemlidir yanlışlıkla decidua ile toplanan koryon kolay kaldırılması için) olanak sağlar. Decidual hücreleri kırılgan bu nedenle hızlı ve sık pipetting azalmış canlılık neden olabilir. O zaman, pipet itici hız ayarı, yavaş kalmalıdır ve en az pipetting hücreleri karıştırma kullanılmalıdır öneririm.
Bu iletişim kuralı Trofoblast kirlenme engelleyen yollarından yalnızca decidua (decidua parietalis oluşan) plasenta fetal membranlar toplayarak, biyopsi alarak yapılır decidua basalis topluluğu hariç Plasenta anne kısmından. Bizim geçerli protokol biz izole decidual hücre nüfus saflığını artırır iken, bu nedenle, bir sınırlama decidua bu bölümü hedefleme araştırma oluşturabilecek (örneğin decidua basalis) decidua bir bölümünü dışlamak veya ne zaman her ikisi de decidua bölümlerini gereklidir. Bu dışlama bu çalışmanın en büyük sınırlama oluşmaktadır. Buna ek olarak, decidual hücreleri insan hastalardan izole decidual içine daha fazla biyolojik ilgili bir fikir ve gebelik araştırma, daha az manipülasyon ve daha az zaman dönemlerini okudu kemirgen tabanlı çalışmalar etik nedenlerden dolayı kıyasla sağlar.
Bu iletişim kuralı hangi zorluk, oluşturmak için ispat edebilir adım vardır ve düzgün Mayıs hafifletilmiş etkisi hücre verim ve canlılığı. Bu etrafını için değişiklikler yapılması gerekebilir. Decidual kapalı fetal membranlar kazıma yeterli (Adım 2.4); olduğundan emin olmak için en kritik olduğunu insan değişkenlik nedeniyle her plasenta decidual doku, doku tutarlılık ve doku kuruluk düzeyine miktarı açısından farklı olabilir. Sadece decidua kaldırılmakta olan emin olmak için kazıma modüle önemlidir. Decidua ve membranlar kuru ise, PBS/can daha kolay kazıma için izin vermek için membran üzerine dökülür. Decidual hücre süspansiyon (Adım 3.4), eritrosit lizis ikinci adımıdır. Aynı derecede mezkur, hücre Pelet çok büyükse ve kan yüksek miktarda içerir, pelet lysing verimliliğini artırmak için iki tüpler içine ayırabilirsiniz. Yoksa hala kırmızı kan hücreleri bu adımdan sonra maksimum verimlilik için daha fazla tüpler Pelet bölmek için bir ihtiyaç olabilir.
Ise terim plasenta ve yalıtım hysterectomies geçiren gebe olmayan kadınların rahim hücrenin farklı decidual yalıtım kurallarından daha önce yayımlanmış18,19olabilirdi, bu yöntemleri çeşitli gidermez sınırlamalar, düşük hücre canlılığı ve bitişik doku kirlenme gibi. Biz büyük hücre verim yol açar, burada anlatılan Protokolü tasarlarken bu sınırları canlılığı arttı ve dokuları çevreleyen gelen bulaşma riskinin düşük olarak kabul. Daha önce otomatik dissociations mekanik decidual doku19,20kırmak için kullanılmaktadır. Bu yöntem nispeten sert makası doku kırmak için hızlı bir şekilde döndürerek bir blender için benzer işlevleri makine içine bir tüp decidual doku toplanan nerede güçlü bir mekanik ayrışma içerir gibi sonuçlanan azalma hücre canlılığı. Burada açıklanan yeni yöntemi Enzimatik sindirim dokusu ile uygulanan mekanik kuvvet yerine hareket nazik sallanan su banyosu hareketleri ile birlikte kısa (20 dakika) birleştirir. Enzimatik sindirim çözüm hücre canlılığı ve verim, decidual doku hücre dışı matriks sindirmek için (1) collagenase içeren artırmak üzere tasarlanmıştır; (2) collagenase kalan trypsinolytic aktivite nedeniyle non-spesifik sindirim önlemek için bir soya tripsin inhibitörü; (3) Dnaz 1 serbest yüzen DNA (4) fetal sığır serum (FBS) ve aşırı sindirim hücreleri korumak için sığır serum albumin (BSA) protein kaldırmak için. Önceki çalışmaların ikinci büyük sınırlama aslında bulunduğu decidua basalis trofoblastik kirlenme neden olabilir plasenta Anne tarafında üst tabakası kesim tarafından toplanan. Bizim yeni protokol decidua yavaşça decidua kazıma tarafından parietalis fetal membran (koryon) kapalı ve koryon kirlenme çamaşır adımları sırasında kolayca kaldırılmasına olanak sağlar izole ediyor.
Bu nedenle, bizim yöntem için birincil decidual hücrelerinin basit bir yalıtım (tüm süreç yaklaşık 3 saat sürer) zaman kısa bir süre içinde plasental zarlar toplanan sağlar yüksek hücre verim ve mükemmel Hücre canlılığı ile sonuçlanan. Decidual hücreleri izole edilmiş bir kez onlar-ebilmek var olmak kullanılmış çok sayıda deneyler için; Örneğin, insan birincil decidual hücreleri üzerinde coverslips immunocytochemical analiz için tohumlari, onlar çeşitli tedaviler ve manipülasyonlar kültüründe yetiştirilen yanı sıra doğrudan değerlendirmek için çok renkli Akış Sitometresi Analizi için lekeli gebelik komplikasyonları farklı hücre alt nüfus rolünü anlama girişimi ile insan decidua bileşimi. Burada sunulan yöntem terim plasenta (insan gebeliğin üçüncü üç aylık dönem sonu) hücrelerden ayırmak için kullanılan iken, bu iletişim kuralını da ilk ve ikinci üç aylık dönem plasenta için gebelik Sahne Alanı'nın esneklik sağlayan kolayca adapte edilebilir Bu araştırma ele alıyor.
Daha önce yayımlanmış protokolleri otomatik dissociations ayrı decidual doku veya Enzimatik sindirim yalnız21,22kırmak için kullandık. Nazik bir mekanik kuvvet (37 ° C'de su banyosu sallanan) sindirim ve hücre canlılığı optimize etmek üzere tasarlanmış bir Enzimatik sindirim yanı sıra kokteyl birleştirerek, yukarıda özetlenen Protokolü hücre verim ve canlılığı arasında ideal bir denge oluşturur. Buna ek olarak, önceki iletişim kuralları kendi izolasyonların ve sadece mevcut hücre canlılığı yüzde19toplam hücre verim elde belirtmeyi başarısız oldu. İşte decidual hücre hücre (Plasenta başına 10-20 milyon dolar arasında değişen) sayma yoluyla belirlenen yüksek bir verim göstermektedir. Ayrıca, geçerli yayınları fareler birincil decidual/endometrium hücre izolasyon gösterir; bizim iletişim kuralı insan doku, hücre deneme23daha biyolojik ilgili bir kaynak oluşturma çalışması için izin verir. Bu iletişim kuralı da ilk kolayca adapte olabilir ve için gebelik sahne o kişinin araştırma esneklik sağlayan ikinci trimester plasenta ele alıyor. Hücreleri izole edilmiş bir kez onlar deneysel teknikleri immunocytochemistry, Akış Sitometresi, protein ve RNA ayıklama, sonraki yalıtım lökosit, vb gibi çeşitli girişim farklı hücre rolünü anlamak için kullanılabilir alt nüfus. İlişkili decidua arasında gerçek zamanlı PCR veya genom geniş kullanımı ile sağlıklı ve karmaşık gebelik (preeklampsi veya erken doğum emek gibi) çalışmalarda gen ve protein ifade farklılıkları belirleme yardımcı roman hedeflerin sağlayabilir Tanı ve tedavi araçları geliştirilmesi. Ayrıca, decidual hücre, özellikle lökosit, Akış Sitometresi kullanımı yoluyla kolayca tanımlanabilir oranında değişiklik de cevaplar için her iki lökosit değişiklikler gibi gebelik komplikasyonları etyolojisinde sağlayabilir subpopulation oranları gibi terim ve preterm doğum24modülasyonlu gösterilmiştir onların harekete geçirmek durum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa yoktur
Acknowledgments
Yazarlar bu çalışmada kullanılan insan numuneler için bağış, RCWIH BioBank ve Mount Sinai Hastanesi/bunlar bölümü kadın doğum ve jinekoloji teşekkür etmek istiyorum. Küllü su Laboratuvarı, özellikle Dr. Caroline Dunk için onun yardım yöntemi geliştirilmesi ile üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Burroughs hoş geldiniz Fonu (grant #1013759) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
References
- Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. Decidualization and relevance to menstruation. , Cambridge University press. 187-212 (1990).
- Kariya, M. Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).
- Wu, W. -X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy. Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).
- Bell, S. C. Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua. Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).
- Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. Decidual natural killer cells: key regulators of placental development. Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).
- Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy. Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).
- Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor. Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).
- Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms. Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).
- Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).
- Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).
- Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women. Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biology of Reproduction. 86, 39 (2011).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. Cytokines and infection-induced preterm labour. Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).
- Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. The role of leukocyte traffic and activation in parturition. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).
- Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface. Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).
- Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface. Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).
- Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens. Journal of Visualized experiments. 87, (2014).
- Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue. Journal of Visualized experiments. 112, (2016).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).
- Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).
