Summary
В situ bioindications включить определение пригодности среды для видов, находящихся под угрозой исчезновения мидий. Мы опишем два методы, основанные на несовершеннолетних подверженности пресноводные жемчужины мидии в клетках олиготрофных реки местообитаний. Оба метода реализованы в вариантах для открытой воде и hyporheic водных сред.
Abstract
Знания о пригодности Хабитат для пресной воды мидиями является важным шагом в сохранении этой группы исчезающих видов. Мы описываем протокол для выполнения в situ несовершеннолетних воздействия испытаний олиготрофных речных водосборах за один месяц и 3 месячные периоды. Два метода (в обоих модификаций) представлены для оценки несовершеннолетних темпы роста и выживания. Методы и модификации различаются значения для местности биоиндикации и каждый имеет свои преимущества, а также ограничения. Метод песчаных клетка работает с большим набором отдельных лиц, но только некоторые из лиц, измеряются и результаты оцениваются навалом. В методе сетки клетке лиц хранятся и измеряется отдельно, но оценивается низкой индивидуальный номер. Модификация воздействия открытой воде относительно легко применять; Он показывает несовершеннолетних роста потенциальных участков и также может быть эффективным для тестирования токсичности воды. Изменения экспозиции в кровати нуждается в высокой рабочей нагрузкой, но ближе к условиям окружающей среды несовершеннолетних и это лучше для представления реальных пригодность населенных пунктов. С другой стороны в этой модификации из-за его высокой hyporheic изменчивость среды необходимо больше репликаций.
Introduction
Один из возможных способов получения сведений о качества окружающей среды и (особенно) сайта пригодность для видов воздействия экспериментальной организмов в situ с последующей оценки их состояния. В рамках животных такой биоиндикации применяется главным образом для мелких беспозвоночных, которые способны жить в ограниченном пространстве ограниченных. Молодые стадии двустворчатые (Bivalvia) — один из таких подходящих организм группы1.
Двустворчатых моллюсков семейства Unionidae являются очень важным компонентом водных экосистем2. Однако эти виды находятся часто в критическом состоянии, особенно в ручьи и реки. Некоторые из них характеризуются как «зонтик виды», чьи сохранения тесно связана с сохранению весь поток биотоп и которые требуют всеобъемлющего подхода3. Эти животные имеют жизненный цикл, связанный с многих компонентов окружающей среды, от химии воды4,5 изменений в популяциях рыб, которые служат мидий личинки хостов6. Потому что мидий несовершеннолетних часто представляют собой критический этап жизненного цикла мидий, сайт пригодность для их развития на данном этапе имеет решающее значение для развития успешных видов населения данной местности.
Жемчужница (FWPM, Margaritifera margaritifera; Unionida, Bivalvia) находится в критическом состоянии двустворчатых происходящих в олиготрофном европейских потоков. Их число резко упали в течение 20века по всей области возникновения . Кажется, что текущее сокращение видов размножения в большинстве населения Центральной Европы в первую очередь вызвано очень низко к нулю выживания несовершеннолетних в течение первых нескольких лет их жизни. Предполагается, что несовершеннолетних FWPMs многие годы жить в мелкой hyporheic зона7, из которых условия и их изменчивость до сих пор не хорошо описаны. Кроме того до их второй год жизни, несовершеннолетних есть только измерение до около 1 мм, поэтому они очень трудно найти в больших объемах отложений в естественных условиях8. Поэтому эксперименты с плен несовершеннолетних являются необходимыми для изучения их экологии.
В рамках Чешской план действий для пресноводные жемчужины мидии9, есть тысячи несовершеннолетних рост каждый год с полуестественной Племенная программа. Тем не менее есть вопрос, из которых населенных пунктов и мест обитания подходят для успешного населения поддержки этих несовершеннолетних или для реинтродукции возможных видов. Bioindications в situ представляют способ найти ответ.
Несмотря на тот факт, что несогласованные выживаемости несовершеннолетних мидии в клетках экспозиции были замечены в некоторых более ранних работах, которые поставили под сомнение пригодность несовершеннолетних мидии в качестве биоиндикаторов10, некоторые недавние исследования подтвердили применимость методов несовершеннолетних воздействия на качество воды тестирование11,12,13. Кроме того было продемонстрировано, что некоторые факторы необходимо учитывать при интерпретации результатов этих конкретных исследований, таких как акции происхождения14 и сохраняющихся последствий личиночной условия15.
Возникает вопрос как установить экспериментальный несовершеннолетних в проверенных местах и как наиболее эффективно оценить их состояние. Первое строгое применение методов в месте воздействия с несовершеннолетних FWPMs было опубликовано Buddensiek16. Несовершеннолетних лиц FWPM держали в клетках листа, подвергаются в свободной воде потоков, и после нескольких недель воздействия были количественно их выживания и роста. Подход был первоначально разработан как метод полу искусственного разведения, но автор также подчеркнул ее применимости для оценки потребностей в Хабитат и качества воды. Хотя FWPM несовершеннолетних выживание естественно очень низка в масштабе месяцев/лет, и только очень небольшое количество животных выживет, выживаемость может быть хорошим маркером экологического эффекта в масштабе нескольких недель16. За годы исследований были разработаны методы воздействия, в дополнение к провести экспериментальный несовершеннолетних мидий в поток среды обитания и для оценки темпов роста и выживания; к ним относятся песчаные коробки17, силосы мидий, основанный на апвеллинг принцип18и различных других экспозиции клеток (обобщены десен и коллеги)11. Потому что несовершеннолетних происходят естественно в мелкой hyporheic зона7, применение экспериментальных устройств в пределах нижней поток очень желательно.
В нашей статье, мы описывают использование двух воздействия устройства для FWPMs: я) изменение Buddensiek Штампованные сепараторы («сетка клетки») также включение биоиндикации тестирование в hyporheal условиях; и ii) Грушка песчаных полях («песчаный клетки»). Протокол описывает применение обоих методов в открытой воде и hyporheic условиях (т.е., четыре варианта воздействия описаны). Методы были постепенно изменен и расширен более чем 15 лет применения в рамках плана действий Чешской пресноводные жемчужины мидии9 и проверены с помощью ряда экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. сетка клетки
Примечание: Смотрите Рисунок 1.
- Подготовка материала
- Подготовка материала для части в лаборатории эксперимента: ~ 1-2 Л речной воды в клетке сетка, сетка клетки (1 пластиковый корпус, 2 пластиковые крышки, 2 листов специальных технических сита с 340 мкм поры, 4 болта и 4 орехов в клетке), плоскогубцы , гаечный ключ, пипетки Пастера, сито, цифровой фотоаппарат, тринокулярные рассекает зум стерео Микроскоп, калибровка сетке (оборудование микроскопа), 5 чашек Петри диаметром 50 мм, мензурки, 2 пластиковые тарелки (~ 25 см х 15 см х 3 - 5 см) и пластиковой коробке.
- Чтобы выполнить установку hyporheal, подготовьте резиновый шланг и сетку 100 мкм порами и шприц бутылку. Для строительства устройства, см дополнительный файл 1: S.1. Сетка клетки строительных.
- Соберите нижней и Центральной частью сетка клетки. Соберите части клетки, что держит людей. Вставьте одну пластиковую крышку сначала, затем один лист пластика сита, и наконец основной тела на вершине. Для защиты его используйте четыре болта.
- Подготовить биологический материал
- Положите сетки клетке в пластиковых блюдо, содержащие речной воды. Убедитесь, что камеры наполовину. Возьмите FWPM несовершеннолетних (см. дополнительный файл 1: S.6. Биологический материал) из термически изолированные окна и положить их в чашке Петри.
Примечание: Убедитесь, что резкие перепады температуры не превышают ~ 2 ° C. - С помощью шприц бутылку и сито, просеивают через несовершеннолетних для очистки щебня.
- Положите сетки клетке в пластиковых блюдо, содержащие речной воды. Убедитесь, что камеры наполовину. Возьмите FWPM несовершеннолетних (см. дополнительный файл 1: S.6. Биологический материал) из термически изолированные окна и положить их в чашке Петри.
- Настройка микроскоп и камеры. Выполнить калибровку инструментов (см. дополнительного File1: S. 5. Микроскоп и фототехники). Поместите чашку Петри, содержащие немного воды под микроскопом.
- Поместить несовершеннолетних в клетках (экспериментальная лаборатория работы)
- Использование пипетки Пастера для удаления одного человека от чашку Петри и осторожно поместите его в чашку Петри под микроскопом.
- Проверка личности фитнес, глядя в окуляр (~ 40 кратном).
Примечание: «Хорошо» фитнес означает, что человек движется, вращается из стороны в сторону, толкает подножия из оболочки и т.д. удаление мертвых или низкой фитнес лиц с Пастер Пипетка и поместите их в отдельную чашку Петри (FWPM несовершеннолетних с открытой оболочка, без движения, ноги не вытащил, раздробленной оболочка, несовершеннолетних, которые бесконтрольно плавают в воде, видимый разложение оболочки, частичная декальцинации). - Возьмите две фотографии FWPM отдельных показаны хороший фитнес, используя постоянное увеличение ~ 80 X. Смотреть дополнительный файл 1: д.5. Микроскоп и фототехники. Сохраните фотографии.
Примечание: Для хорошего измерения его длины, несовершеннолетних должны быть заложены продольно (боковой вид). Основная цель-это сфотографировать высокого качества максимальная оболочки длиной достаточно для того, чтобы дать картину анализа потом. - Вставьте несовершеннолетних в соответствующей палаты в клетке, как только будут сделаны снимки. Запишите номера фотографии и камеры.
- Повторите этот шаг с каждым человеком всех используемых камер в клетке сетки.
Примечание: увидеть дополнительный файл 1: S.1. Сетка клетки строительных. - После того как все используемые камеры жемчужины мидии, положить пластиковых сито на клетки, затем осторожно положил пластиковую крышку на и обеспечить всех частей вместе с орехами.
- В случае установки в hyporheic зону, пройти один из концов шланга одной из палат и исправить ее в этом положении, а затем принять против засорения сетки и привязать его на нижнем конце (см. дополнительный файл 1: S.1. Сетка клетки строительных).
- Магазин несовершеннолетних
- Поместите клетку в пластиковую коробку с речной водой, так что несовершеннолетних полностью погружены в воду и держать его в термобокс. Перед началом установки пусть несовершеннолетних адаптироваться в situ реки температуре воды на месте установки (постепенное охлаждение, Макс. 5 ° C в течение 24 часов).
- Установка сетки клетки
- Подготовить материал поля, включая сетка клетки с несовершеннолетних, стальных шипов, болты и гайки металлические, гаечный ключ, поле логеры температуры (см. Таблицу материалов и дополнительный файл 1: S.4.2. Замер воды), строка, камеры, поле Протокол, молоток и лопатой.
- Транспорт FWPM несовершеннолетних на сайт в поле термобокс (изолированные коробка), сохраняя стабильную температуру с вариациями < ~ 2 ° C. Положите термобокс с сеткой клеток в реку на сайте, чтобы позволить несовершеннолетних адаптироваться к местным условиям окружающей среды (pH, проводимость, и т.д.).
- Установка сетки клетке.
- Удалите из поля термобокс сетки клетке. Предоставить ей два стальных шипов и закрепите поле регистратор. Якорь клетке в среду обитания с типичными условиями для FWPMs в области исследования (например, на краю основной поток потока, не в прямой воды, не в стоячей воде, не в прямом солнечном свете).
- Для открытой воде, используя пару стальных шипов исправить клетки на дно реки; лежит он на его стороне и уровня дно реки, ниже по течению под углом 45° к потоку реки, к центру реки. Нижняя кромка горизонтального должно быть около 10-15 см выше поверхности дна реки. Минимальное расстояние 2 м между каждой клетки в одной местности (см. дополнительный файл 1: S.4. Клетки обслуживания).
- Для hyporheic зоны копать клетки в дно реки в перпендикулярных пейзаж перпендикулярно, поток воды, чтобы верхний край горизонтальной клетки параллельно поверхности дна реки и камеры расположены в hyporheic Глубина, которая должны быть проверены. Вынуть верхний конец резинового шланга на нижней поверхности возможность отбора проб воды в ходе эксперимента (см. дополнительный файл 1: S.4.2. Замер воды).
Примечание: Рекомендуется выполнять регулярные проверки и техническое обслуживание на клетки (см. дополнительный файл 1: с. 4. Клетки обслуживания).
- Удалите из поля термобокс сетки клетке. Предоставить ей два стальных шипов и закрепите поле регистратор. Якорь клетке в среду обитания с типичными условиями для FWPMs в области исследования (например, на краю основной поток потока, не в прямой воды, не в стоячей воде, не в прямом солнечном свете).
- Удаление клеток и перевозки несовершеннолетних после экспозиции. Для этого потяните клетки из воды, очистить их тонкой осадочного слоя, а также дрейфовал материал и поместить их в поле термобокс с речной водой. Транспортные клетки сразу в лабораторию и начать курс оценки смертности и роста.
Примечание: Увидеть дополнительный файл 1: д.3. Продолжительность воздействия. В случае разницы температуры более чем на 5 ° c клетки и лабораторных условиях это первый необходимые для выравнивания температуры. - Оценить этот эксперимент, проверяя жизни/Фитнес каждого несовершеннолетнего (см. шаги 1.5.2 и 1.5.3) и принимать 2 изображения каждого живых несовершеннолетних в чашке Петри, используя постоянное увеличение ~ 80 X. Запись фитнес и число камер и фотографии.
- Завершить эксперимент (общие для всех методов)
- Проводить измерения в программное обеспечение для анализа изображений. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для определения размера тела каждого вычисленного несовершеннолетних на обоих входных изображений (шаг 1.5.3) и вывода изображения (шаг 1.9). Использование длина максимальная общая оболочка записан на обеих фотографиях как тело размер значения ввода и вывода.
- Вставьте измеренных значений в таблице процессора и рассчитать приращение (%) для каждого выживших несовершеннолетних.
- Оцените выживания (%) в клетку сетки с использованием соотношения числа выживших лиц всех экспериментальных лицам в клетке сетки.
Примечание: После эксперимента, вернуть выживших Племенная программа
(см. дополнительный файл 1: S.6. Биологический материал).
2. Сэнди Кейдж
Примечание: Смотрите Рисунок 2.
- Подготовка материала
- Подготовка материала для части в лаборатории эксперимента: 2 чашки Петри (диаметр ~8.5 см), пипетки Пастера, сито, 25 Л воды реки, пластиковой коробке, сита (сетка размер 1 и 2 мм), большой пластиковый ящик (25 Л), песчаный клетке (см. дополнительных файлов 1 : Д.2. Сэнди клетки строительных), цифровой фотоаппарат, тринокулярные рассекает зум стерео Микроскоп, калибровка сетки (оборудование микроскопа), сортируются речной песок из области исследования (см. шаг 2.1.3) и протокол. Посмотреть таблицу материалов и дополнительный файл 1: S. 2. Сэнди клетки строительных.
- Подготовка материалов для изоляции процесса: раунд контейнеры (1 для каждой клетке плюс 1 дополнительный), 2 чашки Петри (диаметр ~ 14 см), пипетка Пастера, увеличительные стекла и 1 Л воды реки.
- Просеивать речной песок через сито 2 мм и затем через 1-мм сито получить размер зерна от 1-2 мм. сухой песок и сохранить его в сухой форме до тех пор, пока требуется.
- Возьмите несовершеннолетних (см. дополнительный файл 1: S.6. Биологический материал) из термобокс и положить их в чашке Петри. С помощью шприц бутылку и сито, просеивают через несовершеннолетних для очистки щебня.
- Микроскоп и камеры (см. дополнительный файл 1: S.5. Микроскоп и фототехники).
- Положите несовершеннолетних в клетках (экспериментальная лаборатория работы)
- Место песчаных Кейдж в пластиковой коробке. Разброс отсортированный песок (см. шаг 2.1.3) до одну треть высоты песчаных клетке. Налейте воду в поле. Убедитесь, что песок поверхности около 10 мм ниже уровня воды. Вставить песчаный Кейдж в поле 25 Л воды реки и подвергнуть его такая же температура как несовершеннолетних FWPMs (см. дополнительный файл 1: S.6.2. Хранения биологического материала) для 12 h. избежать какого-либо воздействия песка солнечного света.
- Взять чашку Петри с подготовленной FWPM подростками.
- Проверка отдельных лиц фитнес, глядя в окуляр (см. шаг 1.5.2).
- Выполняйте фотографической документации. Возьмите одну картину всех лиц, обнаружил (см. шаг 1.5.3) и выбрать 10 крупнейших частных лиц. Кроме того принимать фотографии всех несовершеннолетних вместе с низким увеличением (~ 40 X) для массовой оценки и выбрать 10 крупнейших особей. Сохранить все фотографии и записывать их числа.
- С помощью шприц бутылку, переместите FWPM несовершеннолетних в подготовленной песчаной клетку.
- Магазин несовершеннолетних
- Поместить клетку в большой пластиковый ящик с речной водой так, что клетки полностью погружен и держать его в термобокс. Пусть несовершеннолетних адаптироваться в situ реки температура воды (постепенное охлаждение, Макс. 5 ° C в течение 24 ч) до установки.
- Установить песчаных клетки
- Подготовить материал для установки поля: песчаных клетки, ~ 25-L поле Термобокс, плоский камень (минимальный вес 1 кг), нетто (сетка размер 10 x 10 мм), шприц бутылку, логеры температуры поля (см. Таблицу материалов и дополнительный файл 1: Измерение S.4.2. воды), лопату и поля протокола.
- Транспортные клетки с несовершеннолетних на сайт в поле Термобокс, сохраняя стабильное воды температуры (~ 2 ° C изменения). Положите термобокс поля с песчаным клетки в реку в поле сайт чтобы FWPM несовершеннолетних адаптироваться к местным условиям окружающей среды (pH, проводимость, и т.д.).
- Установите песчаных клетки в места обитания с типичными условиями для FWPMs (например, на краю основной поток потока в меандр, не в прямой воды, не в стоячей воде, не в прямом солнечном свете).
- Для открытой воды закрепите песчаных клетки для плоского камня, с использованием чистой и поместить его на дне реки. Убедитесь, что более крупные стороны каркаса образует угол 45 ° с потоком.
- Для Hyporheal копать клетки в дно реки, перпендикулярно поток воды, так что клетка крышка уровне с поверхностью дна реки.
Примечание: Рекомендуется выполнять регулярные проверки и техническое обслуживание на клетки (см. дополнительный файл 1: с. 4. 1. сайт проверки).
- Удаление клеток и транспорта несовершеннолетних после облучения
Примечание: увидеть дополнительный файл 1: д.3. Продолжительность воздействия.- Вытяните клетки из воды, очистить их дрейфовал материала и поместить их в поле термобокс с речной водой.
- Транспортные клетки в лабораторию и начать курс оценки смертности и роста.
Примечание: В случае разницы температуры более чем на 5 ° c клетки и лабораторных условиях, это необходимо для выравнивания температур.
- Отдельные FWPM несовершеннолетних от песка
- Подготовить круглый контейнер с водой глубиной 50 мм (для каждой клетке отдельно) и один дополнительный раунд контейнера. Передача песок из клетки в круглый контейнер. Используйте закрученного движения промыть легкие частицы в дополнительный контейнер.
- Образец содержимого из этого контейнера постепенно и поиска для несовершеннолетних, шаг за шагом, с помощью пипетки Пастера и увеличительное стекло. Поместите несовершеннолетних в чашке Петри с помощью пипетки Пастера. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока последний несовершеннолетних были обнаружены и затем еще 10 x после первого отрицательный вывод. После каждого мытья шаг добавьте чистый речной воды в оригинальный контейнер с песком.
Примечание: Особенно после первого мытья, должным образом изучить содержимое и очистить его балласта как штраф осадков и других наносов.
- Оценить этот эксперимент
- Проверка пригодности каждого несовершеннолетнего (см. шаги 2.4.3 и 1.5.2) и подсчитать количество выживших.
- Сфотографируйте (см. шаг 2.4.4.) каждого человека отдельно, хотя это означает Есть нет четких идентичности каждого человека. Кроме того принимать фотографии массовых и выбрать подмножество 10 лучших выросли лиц из окончательных результатов.
Примечание: Обе возможности иметь значение подобных отчетности. Возможность 1 имеет ограничение выше рабочей нагрузки, но и максимальном увеличении фото и таким образом также большей точности.
- Завершение эксперимента
- Выполнения измерений в программное обеспечение для анализа изображений. Завершить эксперимент, как это сделано в клетках сетки (см. шаг 1.10), со следующим исключением: не оценить темпы роста (%) каждого несовершеннолетнего, но оценить группы в целом в эксперименте песчаных клетке.
Примечание: После эксперимента, оставшиеся в живых должны быть возвращены Племенная программа
(см. дополнительный файл S.6.1. SEлекция биологического материала).
- Выполнения измерений в программное обеспечение для анализа изображений. Завершить эксперимент, как это сделано в клетках сетки (см. шаг 1.10), со следующим исключением: не оценить темпы роста (%) каждого несовершеннолетнего, но оценить группы в целом в эксперименте песчаных клетке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Четыре методы биоиндикации (открытой воды песчаный клетки, в течение кровать песчаных клетки, Открыть воду сетка клетки и в кровать сетка клетки) были применены для изучения пригодности состояния окружающей среды для FWPMs в верхнем Влтава бассейне реки (Богемский лес, чешский Республика). Эта река представляет один FWPM остаточной местности в пределах Центральной Европы19. Здесь мы представляем специально отобранных набор результатов, иллюстрирующие наиболее важные аспекты четырех методов. Подробности описаны в всеобъемлющее исследование, Černá и др. 13.
Река окружающей среды было изучено на двух уровнях:
Притоки загрязнения различных этапах (сайты R и V) и (I) профиль продольного реки был представлен основной поток населенных пунктов (сайты A - E). Населенные пункты были протестированы песчаных клетки и клетки сетки, установленной в воду, сыпучий. Кроме того, зона hyporheic гравий был проверен в постели Сэнди клетки в населенных пунктах B, C и D.
(II) в hyporheic среде был испытан в выбранной местности C. Пригодность разных субстратах (песок, гравий, камни) был проверен в рамках кровать сетка клетки.
Темпы роста и выживаемости > 1-год старый несовершеннолетних (см. дополнительный файл 1: S.6. Биологический материал) были протестированы. Эксперимент был проведен в полном объеме в лето 2014 и был повторен в меньшей степени в некоторых населенных пунктах летом 2015 года. В пределах уровня, (I), 2-6 Сэнди клетки с минимум 100 несовершеннолетних и 6 (2014) или 4 (2015) сетка клетки с 6 несовершеннолетних были применены в каждой местности, проверена в соответствующий метод. В пределах уровня (II) в каждой тестируемой среды были установлены 7 сетка клетки с 6 несовершеннолетних. Время экспозиции был один месяц для сетка клетки и через три месяца для песчаных клеток.
Статистический анализ проводился в R, версия 3.1.020. Были использованы тесты Крускала-Уоллиса, Крускала-Nemenyi и Вилкоксон-Манна-Уитни. Для данных с нормальным распределением была проведена линейной или квадратичной регрессии.
Населенные пункты могут быть четко отличать основанные на темпы роста в открытой воде сетка клетки несмотря на изменчивость высокий в клетки, даже в разные периоды роста благоприятные (рис. 3). В более благоприятных для роста экспозиции в 2015 году (темпы роста 19,3-41,8%) тенденция была обнаружена в продольного профиля, где темпы роста увеличились течению (Крускала-Уоллиса тест, p < 0,001). Важно отметить, что выживаемость составила соответствующе высокой в обоих сезонов (от 83%) (Рис. 4A).
С другой стороны, клетки открытой воды песчаный показали различные тенденции между городами основной поток в 2014: темпы роста увеличилось вниз по течению от местности (52%), через среднего местности C (153%) и затем снизилась до населенного пункта E (46%) (квадратичных регрессии роста абсолютного значения: r2adj = 0,77, F2,13 = 25.66, д.ф. = 16, p < 0,001). Эта тенденция также было подтверждено в 2015 году, когда наибольший прирост был записан в районе средней C снова. Кроме того значения интенсивности абсолютного роста не намного отличаются между 2014 и 2015 годах. С другой стороны выживаемость отличались между годами, будучи намного выше в 2015 году (с 48% до 72%), чем в 2014 году (около 25%) (Рис. 4В).
Эффект двух различных воздействия методов хорошо видна в загрязненных приток (населенный пункт V). Песчаных клетки, подвергается здесь в течение трех месяцев показали выживания 0%, в то время как 83% выживаемости с некоторый рост был записан по открытой воде сетка клетки экспозиции здесь в течение 30 дней.
Результаты от в пределах кровати песчаных клетки иллюстрируют различные условия в hyporheic среде по сравнению с открытой воды в соответствующих населенных пунктах. Темпы роста всегда была ниже в hyporheal сайтов, чем в открытой воде, и выживаемость была гораздо больше переменной (от почти 50% до 0%, рис. 4B).
Исследование hyporheic микросреды, используя клетки сетки в постели показало значительное влияние состава субстрата на несовершеннолетних выживания. Лучшие условия были записаны снизу кислорода насыщенный каменистых (выживаемость близка к 100%) в то время как худшие (< 40% выживаемости) были указаны в плохо кислородом песка, где был также обнаружен очень высокая изменчивость в живых. Hyporheic воды кислородом, который неоднократно был измерен в ходе эксперимента, объясняет эту тенденцию (рис. 5).
Рисунок 1. Биоиндикация сетки каркаса с отдельных камер. Просмотреть Дополнительные файл 1 для получения более подробной информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Биоиндикация песчаных Кейдж. Просмотреть Дополнительные файл 1 для получения более подробной информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Индивидуальная изменчивость темпов роста несовершеннолетних записано сетка клетки открытой воды в населенных пунктах B и E в течение двух сезонов. Для каждой сетки клетке описаны средства и стандартное отклонение. Значения основаны на измерение 6 несовершеннолетних (или 4-5 несовершеннолетних если смертности > 0%), в каждой клетке сетки.
Рисунок 4. Пример результатов от поля биоиндикации экспериментировать с сеткой и Сэнди клетки. (A) Эта группа показывает пример результатов от биоиндикации полевой эксперимент с сеткой клеток. В общей сложности 6 населенных пунктов (B, C, D, E, R и V) в пределах водосбора реки Влтава были протестированы на 2 отдельных случаях (в 2014 и 2015). Время экспозиции было 30 дней в течение летнего сезона. Населенные пункты B - E представляют (в порядке) продольный профиль приблизительно 20 км участке реки в основной поток. R и V представляют профили 2 притоков. Столицах Марк же местности в панель (A) и (B). Все населенные пункты были протестированы с открытой воде сетка клетки. Кроме того, населенный пункт C также был испытан, используя клетки сетки в кровати установлены в 3 различных типов русла реки (Cs = песок, Cg = гравий, КНТ = камни) в 2014 году. Клетки были установлены в 4-7 репликаций на каждом сайте. 6 несовершеннолетних жемчужница 1 + лет были использованы за сетки клетке. Средние темпы роста были отмечены для 3 крупнейших частных лиц (Макс. 3) из всех протестированных сетки клетке (колонны, левая ось) и средняя выживаемость за сетки клетке (синий точек, правая ось). (B) Этот пример показывает панель результатов из поля биоиндикации экспериментировать с песчаными клетки. Общая of7 населенные пункты (A, B, C, D, E, R и V) в пределах водосбора реки Влтава были протестированы над на 2 отдельных случаях (в 2014 и 2015). Время экспозиции было 3 месяца во время летнего сезона. Сайты - E представляют (в порядке) продольного профиля примерно в 30-км участок реки основной поток. Сайты, R и V представляют профили 2 притоков. Столицах Марк той же местности, как в этой, так и в предыдущей группы. Все населенные пункты были протестированы с открытой воды песчаный клетки. Кроме того населенных пунктов, B, C и D также были протестированы с использованием внутри кровать песчаных клетках, установленных в молоток реки постели субстрата (Bg, Cg и ГД) в 2014 году. Клетки были установлены в 2-4 репликаций на каждом сайте. По крайней мере 100 жемчужница несовершеннолетних были представлены в каждом песчаных клетке. Средние темпы роста для 10 крупнейших особей (Макс. 10) из всех протестированных песчаных Кейдж (колонны, левая ось) и средняя выживаемость в песчаных Кейдж (синий точек, правая ось) помечены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Насыщение кислородом. Эта панель показывает связь между минимальные значения насыщенности кислородом свыше 30 дней сетка клетки воздействия сохранившихся стоимость Кейдж в клетках сетки внутри кровать воздействию и в различных кровать микросреды в 2014 году. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| 2014 | к 2015 году | |||
| населенный пункт | 3-месячный воздействия песчаных клеток | 1-месячный экспозиции клеток сетки | 3-месячный воздействия песчаных клеток | 1-месячный экспозиции клеток сетки |
| A | 13,9 | - | - | - |
| B | 14.4 | 13.4 | 13,9 | 17.5 |
| C | 15 | 13,8 | 14.4 | 18.3 |
| D | 15 | 13,8 | 14.3 | 18.3 |
| E | 15.5 | 14 | - | 18,7 |
| R | 13.5 | 12,8 | - | - |
| V | 14 | 13.2 | - | - |
Таблица 1. Средняя поверхностная температура воды (° C) в населенных пунктах во время экспозиции в 2014 и 2015 годах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Время экспозиции:
Даже один месяц подвергается сетка клетки шоу видимого роста, отражающие различия между городами (рис. 3), поэтому они очень удобный для быстрого и легкого обнаружения характеристику местности. Тем не менее актуальность результатов зависит от краткосрочных состояния условий, которые могут колебаться. В частности короткие осадков могут играть определенную роль. В отличие от непредсказуемых эпизодические загрязнения могут не всегда быть записаны. В населенном пункте V (рис. 4A) анализ химии воды обнаружено короткие волны сильного аммония увеличение13. Это вероятно отвечал за смертности в клетках подвергаются песчаных, три месяца, но не влияет на 30-дневный подвергаются сетка клетки.
Колебания температуры может также повлиять на краткосрочные результаты воздействия. Один месяц средняя температура во время экспозиции сетки клетке отличается между годами (Таблица 1). Темпы роста также варьируется, где более высокие температуры сопровождались более высокие темпы роста (Крускала-Уоллиса тест p < 0,001). С другой стороны, средняя температура воды в же местах во время экспозиции три месяца песчаных Кейдж был очень похож на обоих лет (Таблица 1) и темпы роста существенно не отличается (рис. 4В).
Преимущества и недостатки из описанных методов:
Открытой воды воздействия сравнительно легко выполнить, но имеет ограниченную ценность для Хабитат биоиндикации. Метод открытой воде сетка клетки относительно старых16 и неоднократно использовалась с незначительными изменениями10,11,12,13,,2122 , 23. Тем не менее, эти клетки не ограничиваются кислорода, чей дефицит вероятно отвечает за многих несовершеннолетних смертей в hyporheic условиях. Таким образом, открытой воде сетка клетки может показать хорошее развитие даже в местах с повышенной смертности и снижение темпов роста в открытой воде песчаных клетках (населенный пункт E) или 100% смертность в постели песчаных клетки, как на населенный пункт D в 2014 (рис. 4В). По-видимому сетка клетки открытой воды показать потенциал роста местности, но это может оказаться нереалистичным, поскольку это зависит от реального наличия hyporheic микросреды в данной местности. Потому что открытой воде сетка клетки имеют способность высокой выживаемости (рис. 4A), даже до 100% выживание ставки13, они могут служить также для биоиндикации хронической токсичности (или острой токсичности, если ожидается, что в данный момент). Кроме того они могут быть присутствие источника полезной пищи, тестирование в некоторой степени.
Как новый и необычный метод открытой воды песчаный клетки лучше имитировать условий обитания hyporheic. В этот аппарат, который помогает уменьшить рост биопленки на оболочке несовершеннолетних возможна движение несовершеннолетних между песчинки. Дефицит кислорода hyporheic может быть вызвано активность микробов, колонизируя песчинок; Этот эффект может также частично происходят в клетках, расположенных выше дна реки. Тем не менее из-за необходимости периодической очистки засорение дрейфующих материал из клетки, тонкой отложений удаляются также и таким образом условия изменились по сравнению с естественной hyporheic обитания. Таким образом темпы роста может также рассматриваться как населенный пункт роста потенциал в открытой воде песчаных клетках. Однако это ближе к реальной местности пригодности, чем в открытой воде сетка клетки. Таким образом градиенты скорость продольного роста, записанная песчаных клетками (рис. 4B) также, как представляется, быть более правдоподобным и указывают на более подходящий участок реки. Кроме того в клетках, песчаный, несовершеннолетних и subadults, разводить до половой зрелости является возможность проверенной9, поэтому песчаных клетки может одновременно служить безопасный метод размножения и биомониторинга.
Сэнди клетки и сетка клетки в положении в постели ближе к реальным условиям в мелкой hyporheal. Позволяя движение несовершеннолетних, песчаных клетки, в частности, предлагают им обоим вертикальный и горизонтальный градиент несколько сантиметров в масштабе. Эта способность двигаться может быть очень важным для побега от временного недостатка кислорода микро зон. Эта возможность отсутствует в постели в течение сетка клетки. Таким образом относительно большое количество единиц биоиндикации необходим, потому что hyporheic условия являются очень перемеююый13,24 (рис. 5) и потери из-за неподходящих местоположение являются общими.
В целом биоиндикация методы, используемые в данном исследовании соответствуют с предположительно несовершеннолетних природные условия в следующем порядке:
1. Откройте воду сетка клетки,
2. Откройте воду песчаных клетки,
3. в рамках кровать сетка клетки,
4. в рамках кровать песчаных клетки.
Нагрузка на единицу увеличивается в том же порядке. Кроме того несовершеннолетних число необходимых для статистической проверки результатов получено увеличение воздействия в течение кровати тоже. Кажется, что в постели песчаных клетки представляют более дорогой, но точная биоиндикации метод. Этот новый метод нуждается больше в будущем тестирование и сравнение с другими видами hyporheic исследований на основе Пьезометр измерения25,26. В частности существует необходимость изучить степень схожести с помощью прямого зонда измерения физико-химических условий в клетках и в окружающей среде hyporheic.
Количество лиц, измеренных в одной клетке:
По сравнению с сетка клетки, это не возможно измерить приращение конкретных несовершеннолетних в песчаных клетках, как нет никакой информации, о котором человек из входного набора является какой в выходных данных. Это необходимо для работы с среднее значение. Если посчитать для всех лиц, это значение может быть очень низким из-за ряда очень медленно растущей образцов; Однако, несколько лиц могут расти очень быстро (рост перемычки). Такие неравномерный рост характерен для мидии27. Изменчивость роста среди несовершеннолетних возрастает с увеличением времени экспозиции и большие различия могут возникать, особенно в рост благоприятные сезоны. Кроме того, долго воздействия приводит к крупным смертности в клетках сетки (для обзора см. Lavictoire, Moorkens, Рэмси, Синклер и Свитинг28), так что мы можем работать с значительно меньшее количество лиц в конце эксперимента по сравнению с входной набор несовершеннолетних. Измерение только несколько наиболее растущих несовершеннолетних является возможный метод.
Опыт разведения FWPM в рамках плана действий Чешской Республики пресноводные жемчужины мидии9,29, а также результаты экспериментов на морских двустворчатых30,31, свидетельствует о том, что рост недостаточным несовершеннолетних двустворчатые моллюски имеют высокий уровень смертности, и есть только незначительный шанс их жизни до погашения. В отличие от роста перемычки имеют более высокую выживаемость, и они имеют решающее значение для восстановления населения. Значение параметра 10 Макс (10 наиболее быстро растущих частных лиц) учитывает рост перемычки и может увеличить информативность эксперимента, даже если высокой смертности происходит (рис. 4б, сезона 2014). Следует отметить, что рост оценки, полученные этим методом может быть ложным позитвом. Это может только быть слегка недооценены потому, что многие из крупнейших несовершеннолетних в конце эксперимента вырос бы немного больше в этом случае. Кроме того Рабочая нагрузка меньше, если только 10 лица оцениваются. Аналогично измерения трех максимально растущий человек (Макс. 3) оказалось целесообразным в клетках сетки, устраняя влияние медленно растущих, без перспективы лиц, которые могут исказить реальный образ сайта потенциал роста.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Михал Bílý и Ондржей P. Simon были поддержаны грантов от чешского университета наук о жизни [внутренней гранта Агентства из факультет экологических наук, CULS Прага (42110 1312 3175 (20164236))]. Поддержка Karel Douda пришли из Чешской научного фонда (13-05872S). В ходе осуществления плана действий Чешской для пресной воды жемчужина мидии агентством охраны природы Чешской Республики, который финансируется правительством были собраны данные о биоиндикации и настоящем проявление жемчужины мидии Чешская Республика и доступен на
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| biological material maintenance and care | |||
| Freshwater pearl mussel juveniles | any | NA | from a FWPM breeding programme |
| plastic boxes | any | NA | |
| thermobox | MERCI | 212,070,600,030 | There are many possibilities. This is one example only. |
| field thermobox (ca25 l) | any | NA | cold box (insulated box) commonly used for food transport |
| river water | any | NA | |
| Petri dishes | any | NA | |
| plastic Pasteur pipettes with balloon bulb (droppers) | any | NA | hole diameter 1 mm |
| hydrogen peroxide | any | NA | |
| plastic container (ca 50 l) for river water | any | NA | |
| plastic tea strainer | any | NA | commonly used in kitchen |
| mesh cages construction | |||
| main plastic bodies | any | NA | |
| plactic covers | any | NA | |
| special technical sieves 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| special technical sieves 100 µm | Silk &Progress | UHELON 67 M | |
| rubber hose (diameter 5.5 mm) | any | NA | |
| steel bolts | any | NA | |
| steel nuts | any | NA | |
| spanner | any | NA | |
| steel spikes | any | NA | |
| pliers | any | NA | |
| beakers | any | NA | |
| plastic dishes (ca. 25x15x3-5cm) | any | NA | |
| squirt bottle | any | NA | |
| field protocols | any | NA | |
| stationery | any | NA | |
| plastic container | any | NA | |
| string | any | NA | |
| hammer | any | NA | |
| sandy cages construction and use | |||
| sieve 1 mm | any | NA | |
| sieve 2 mm | any | NA | |
| special technical sieves 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| plastic boxes with tight-fitting lid | any | NA | |
| hot melt adhesive | any | NA | |
| plastic box (ca 250 x 150 x 100 cm) | |||
| big plastic box (ca 25 l) | any | NA | |
| flat stone | any | NA | |
| net | any | NA | |
| river sand | any | NA | |
| round containers | any | NA | |
| magnifying glasses | Carson | Carson CP 60 | There ar many possibilities. This is one example only |
| cages installation and maintenance | |||
| field temperature dataloggers | ONSET | UA-001-64 | http://www.onsetcomp.com/products/data-loggers/ua-001-64 |
| spade | any | NA | |
| toothbrush | any | NA | |
| experiment evaluation | |||
| trinocular dissecting zoom stereo microscope | Bresser optic | ICD 10x-160x | There are many possibilities. This is one example only. |
| digital camera/ electronic eyepiece | Bresser optic | MikroCamLab 5M | There are many possibilities. This is one example only. |
| Calibration gird | Am Scope | SKU: MR100 | There are many possibilities. This is one example only. |
| external power source with two movable light guides | Arsenal | K1309010150021 | There are many possibilities. This is one example only. |
| Image software | ImageJ software | There are many possibilities. This is one example only. | |
| table processor | MS excel | There are many possibilities. This is one example only. |
References
- Goldberg, E. D. The mussel watch-a first step in global marine monitoring. Marine Pollution Bulletin. 6 (7), 111-114 (1975).
- Vaughn, C. C. Ecosystem services provided by freshwater mussels. Hydrobiologia. , In Press (2017).
- Lopes-Lima, M., et al. Conservation status of freshwater mussels in Europe: state of the art and future challenges. Biological Reviews. 92 (1), 572-607 (2017).
- Strayer, D. L., Malcom, H. M. Causes of recruitment failure in freshwater mussel populations in southeastern New York. Ecological Applications. 22 (6), 1780-1790 (2012).
- Douda, K. Effects of nitrate nitrogen pollution on Central European unionid bivalves revealed by distributional data and acute toxicity testing. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 20 (2), 189-197 (2010).
- Modesto, V., et al. Fish and mussels: importance of fish for freshwater mussel conservation. Fish and Fisheries. , In Press (2017).
- Ecology and evolution of the freshwater mussels Unionoida. Bauer, G., Wächtler, K. 145, Ecological Studies. 1-394 (2001).
- Neves, R. J., Widlak, J. C. Habitat ecology of juvenile fresh-water mussels (Bivalvia, Unionidae) in a headwater stream in Virginia. American Malacological Bulletin. 5, 1-7 (1987).
- Švanyga, J., Simon, O. P., Mináriková, T., Spisar, O., Bílý, M. Záchranný program pro perlorodku říční v ČR (Action plan for the endangered freshwater pearl mussel in the Czech Republic). , NCA CR. Prague, Czech Republic. (2013).
- Schmidt, C., Vandré, R. Ten years of experience in the rearing of young freshwater pearl mussels (Margaritifera margaritifera). Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 20 (7), 735-747 (2010).
- Gum, B., Lange, M., Geist, J. A critical reflection on the success of rearing and culturing juvenile freshwater mussels with a focus on the endangered freshwater pearl mussel (Margaritifera margaritifera L.). Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 21 (7), 743-751 (2011).
- Denic, M., Taeubert, J. E., Lange, M., Thielen, F., Scheder, C., Gumpinger, C., Geist, J. Influence of stock origin and environmental conditions on the survival and growth of juvenile freshwater pearl mussels (Margaritifera margaritifera) in a cross-exposure experiment. Limnologica. 50, 67-74 (2015).
- Černá, M., Simon, O. P., Bílý, M., Douda, K., Dort, B., Galová, M., Volfová, M. Within-river variation in growth and survival of juvenile freshwater pearl mussels assessed by in situ exposure methods. Hydrobiologia. , In Press (2017).
- Denic, M., Taeubert, J. E. Trophic relationships between the larvae of two freshwater mussels and their fish hosts. Invertebrate Biology. 134 (2), 129-135 (2015).
- Douda, K. Host-dependent vitality of juvenile freshwater mussels: implications for breeding programs and host evaluation. Aquaculture. 445, 5-10 (2015).
- Buddensiek, V. The culture of juvenile freshwater pearl mussels Margaritifera margaritifera L. in cages: a contribution to conservation programmes and the knowledge of habitat requirements. Biological Conservation. 74 (1), 33-40 (1995).
- Hruška, J. Experience of semi-natural breeding program of freshwater pearl mussel in the Czech Republic. Die Flussperlmuschel in Europa: Bestandssituation und Schutzmaßnahmen. , Albert-Ludwigs Universität: Freiburg. Kongressband. WWA Hof 69-75 (2001).
- Barnhart, M. C. Buckets of muckets: a compact system for rearing juvenile freshwater mussels. Aquaculture. 254 (1), 227-233 (2006).
- Simon, O. P., Vaníčková, I., Bílý, M., Douda, K., Patzenhauerová, H., Hruška, J., Peltánová, A. The status of freshwater pearl mussel in the Czech Republic: several successfully rejuvenated populations but the absence of natural reproduction. Limnologica. 50, 11-20 (2015).
- R Core Team. A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2013).
- Hastie, L. C., Yang, M. R. Conservation of the freshwater pearl mussel I: captive breeding techniques. 2, Natural England. Peterborough, UK. Conserving Natura 2000 Rivers Conservation Techniques Series No. 2 (2003).
- Hruška, J. Nahrungsansprüche der Flußperlmuschel und deren halbnatürliche Aufzucht in der Tschechischen Republik. Heldia. 4 (6), 69-79 (1999).
- Scheder, C., Lerchegger, B., Jung, M., Csar, D., Gumpinger, C. Practical experience in the rearing of freshwater pearl mussels (Margaritifera margaritifera): advantages of a work-saving infection approach, survival, and growth of early life stages. Hydrobiologia. 735 (1), 203-212 (2014).
- Braun, A., Auerswald, K., Geist, J. Drivers and spatio-temporal extent of hyporheic patch variation: implications for sampling. PLoS ONE. 7 (7), e42046 (2012).
- Franken, R. J. M., Storey, R. G., Williams, D. D. Biological, chemical and physical characteristics of downwelling and upwelling zones in the hyporheic zone of a north-temperate stream. Hydrobiologia. , 183-195 (2001).
- Roley, S. S., Tank, J. L. Pore water physicochemical constraints on the endangered clubshell mussel (Pleurobema clava). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (12), 1712-1722 (2016).
- Larson, J. H., Eckert, N. L., Bartsch, M. R. Intrinsic variability in shell and soft tissue growth of the freshwater mussel Lampsilis siliquoidea. PLoS ONE. 9 (11), e112252 (2014).
- Lavictoire, L., Moorkens, E., Ramsey, A. D., Sinclair, W., Sweeting, R. A. Effects of substrate size and cleaning regime on growth and survival of captive-bred juvenile freshwater pearl mussels, Margaritifera (Linnaeus, 1758). Hydrobiologia. 766 (1), 89-102 (2015).
- Hruška, J. Experience of semi-natural breeding programme of freshwater pearl mussel in the Czech Republic. Die Flussperlmuschel in Europa: Bestandssituation und Schutzmassnahmen. , 69-75 (2000).
- Bayne, B. L. Physiological components of growth differences between individual oysters (Crassostrea gigas) and a comparison with Saccostrea commercialis. Physiological and Biochemical Zoology. 72 (6), 705-713 (1999).
- Tamayo, D., Azpeitia, K., Markaide, P., Navarro, E., Ibarrola, I. Food regime modulates physiological processes underlying size differentiation in juvenile intertidal mussels Mytilus galloprovincialis. Marine Biology. 163 (6), (2016).
