Summary
Bioindications in situ permiten la determinación de la idoneidad de un medio ambiente para las especies en peligro de extinción del mejillón. Describimos dos métodos basados en la exposición juvenil de agua dulce mejillones de perla en jaulas a hábitats oligotróficos río. Ambos métodos están implementados en variantes para aguas abiertas y ambientes de agua hiporréica.
Abstract
Conocimiento de la aptitud de hábitat para mejillones de agua dulce es un paso importante en la conservación de este grupo de especies en peligro de extinción. Se describe un protocolo para llevar a cabo en situ pruebas de exposición juvenil dentro de cuencas de río oligotrófico sobre períodos de un mes y tres meses. Se presentan dos métodos (en ambas modificaciones) para evaluar la tasa de crecimiento y supervivencia juvenil. Los métodos y modificaciones difieren en valor de la bioindicación de la localidad y cada uno tiene sus beneficios, así como limitaciones. El método de jaula de arena funciona con un conjunto grande de individuos, pero sólo algunas de las personas se miden y se evalúan los resultados a granel. En el método de la jaula de malla, los individuos se guardan y se mide por separado, pero bajo número individual es evaluado. La modificación de la exposición de aguas abiertas es relativamente fácil de aplicar; se muestra el crecimiento menores potenciales de sitios y también puede ser eficaz para pruebas de toxicidad de agua. La modificación de la exposición dentro de la cama necesita una alta carga de trabajo pero está más cerca de las condiciones de un ambiente juvenil natural y es mejor por informar de la conveniencia real de localidades. Por otra parte, se necesitan más repeticiones en esta modificación debido a su variabilidad de ambiente alta hiporréica.
Introduction
La exposición de organismos experimentales en situ con la subsecuente evaluación de su condición es una manera posible de obtener información sobre la calidad ambiental y (especialmente) la idoneidad del sitio para una especie. Dentro de los animales, tal bioindicación es aplicable sobre todo para los pequeños invertebrados que son capaces de vivir en un espacio acotado limitado. Las etapas jóvenes de bivalvos (Bivalvia) son un tal organismo conveniente grupo1.
Bivalvos de la familia Unionidae son un componente muy importante de los ecosistemas acuáticos2. Sin embargo, estas especies son a menudo de extinción, especialmente en arroyos y ríos. Algunos de ellos son caracterizados como 'especie de paraguas' cuya conservación está estrechamente relacionada con la conservación del biotopo de toda corriente y que requieren un amplio enfoque3. Estos animales tienen un ciclo de vida asociado con muchos componentes del medio ambiente, del agua química4,5 a los cambios en las poblaciones de peces que sirven de anfitriones de larvas de mejillón6. Porque los juveniles de mejillón a menudo representan una fase crítica del ciclo de vida del mejillón, la idoneidad del sitio para su desarrollo en esta etapa es crucial para un desarrollo de la población de especies exitosas en una localidad.
El mejillón de agua dulce perla (FWPM, Margaritifera margaritifera; Unionida, Bivalvia) es un bivalvo críticamente en peligro de extinción que ocurren en oligotróficas corrientes europeas. Sus números han caído drásticamente durante los 20 del sigloXX a través del área de ocurrencia. Parece que la actual caída en la reproducción de especies en la mayoría de las poblaciones Europa central es principalmente causada por muy baja a cero la supervivencia de los alevines durante los primeros años de su vida. Se supone que FWPMs juveniles vivan muchos años en el superficial hiporréica zona7, que las condiciones y su variabilidad todavía no están bien descritas. Por otra parte, hasta su segundo año de vida, los juveniles sólo tienen una dimensión de hasta 1 mm, por lo que son muy difíciles de encontrar en grandes volúmenes de sedimentos bajo condiciones naturales8. Por lo tanto, experimentos con jóvenes cautivos son necesarios para el estudio de su ecología.
Dentro de la Checa Plan de acción para el mejillón de agua dulce perla9, hay miles de juveniles de levantamiento cada año a partir de un programa de crianza seminaturales. Sin embargo, hay una pregunta que lugares y hábitats son convenientes para población exitosa apoyo por estos menores o para la reintroducción de especies posibles. En situ bioindications presentan una forma de encontrar la respuesta.
A pesar de que las tasas de supervivencia inconsistente de mejillones juveniles en jaulas de exposición se observaron en algunos trabajos anteriores que cuestionaba la idoneidad de mejillones juveniles como bioindicadores10, varios estudios recientes han confirmado la aplicabilidad de los métodos de exposición juvenil para calidad del agua prueba11,12,13. Además, se ha demostrado que varios factores necesitan ser considerados al interpretar los resultados de estos estudios particulares, como el origen común14 y los efectos persistentes de larvas condiciones15.
Surge la pregunta de cómo instalar experimentales juveniles en las localidades de prueba y evaluar más eficazmente su condición. La primera aplicación rigurosa del situ exposición métodos con FWPMs juveniles fue publicada por Buddensiek16. Personas FWPM menores se mantuvieron en jaulas de hoja, expuestos en el flujo libre de agua de arroyos, y su supervivencia y crecimiento se cuantificaron después de varias semanas de exposición. El método fue desarrollado originalmente como un método de cría semi artificial, pero el autor también ha destacado su aplicabilidad para la evaluación de los requerimientos de hábitat y calidad del agua. Aunque la supervivencia de juveniles de FWPM es naturalmente muy baja en una escala de meses/años y sólo un muy pequeño número de animales a sobrevivir, la tasa de supervivencia puede ser un buen marcador del efecto ambiental en una escala de varias semanas16. En años de investigación, se desarrollaron métodos de exposición a hábitats de retención experimental mejillones juveniles en secuencia y para evaluar sus tasas de crecimiento y supervivencia; Estos incluyen cajas de arena17, silos de mejillón basados en una surgencia principio18y varios otros exposición jaulas (resumidos por goma de mascar y colegas)11. Porque los juveniles ocurren naturalmente en hiporréica superficial zona7, la aplicación de dispositivos experimentales dentro de la parte inferior de la corriente es muy deseable.
En nuestro artículo, describimos el uso de dos dispositivos de exposición de FWPMs: i) modificado Buddensiek jaulas de hoja ("jaulas de malla") que permite bioindicación pruebas en condiciones de hyporheal; y ii) cajas de arena Hruška ("jaulas de arena"). El protocolo describe la aplicación de ambos métodos en condiciones de agua e hiporréica abiertas (es decir, cuatro variantes de la exposición se describen). Los métodos fueron gradualmente modificados y ampliados en más de 15 años de aplicación en el Plan de acción de Checa para mejillón de agua dulce perla9 y verificados por una serie de experimentos.
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Protocol
1. jaula de malla
Nota: Vea la figura 1.
- Preparar material
- Preparar el material para la parte de laboratorio del experimento: ~ 1-2 L del río del agua por jaula de malla, jaulas de malla (1 carrocería de plástico, 2 cubiertas de plástico, 2 hojas de tamices técnicos especiales con 340 μm poros, 4 tornillos y 4 tuercas por jaula), alicates , una llave, Pipetas Pasteur, un colador, una cámara digital, un trinocular microscopio estéreo del zumbido, una cuadrícula de calibración (equipo de microscopio), 5 placas de Petri de 50 mm de diámetro, vasos, 2 platos de plástico de disección (~ 25 cm x 15 cm x 3 - 5 cm) y una caja de plástico.
- Para realizar la instalación de hyporheal, preparar un tubo de goma y una malla de 100 μm de poro y una botella de squirt. Para la construcción del dispositivo, consulte archivo complementario 1: S.1. Construcción de jaulas de malla.
- Montar la parte inferior y la parte central de las jaulas de malla. Montar la parte de la jaula que encierra a los individuos. Inserte en primer lugar, una cubierta de plástico y una hoja del plástico tamiz, finalmente la cañería del cuerpo en la parte superior. Utilice cuatro tornillos para sujetarla.
- Preparación de material biológico
- Poner la jaula de malla en el plato de plástico que contiene agua del río. Asegúrese de que las cámaras están medio llenos. Tomar los juveniles FWPM (ver 1 archivo complementario: S.6. Material biológico) fuera de la caja aislada térmicamente y ponerlos en la caja Petri.
Nota: Asegúrese de que los cambios bruscos de temperatura no excedan ~ 2 ° C. - Usando un frasco rociador y un colador, tamizar a través de los juveniles para eliminar los detritus.
- Poner la jaula de malla en el plato de plástico que contiene agua del río. Asegúrese de que las cámaras están medio llenos. Tomar los juveniles FWPM (ver 1 archivo complementario: S.6. Material biológico) fuera de la caja aislada térmicamente y ponerlos en la caja Petri.
- Configurar el microscopio y la cámara. Realizar una calibración de los instrumentos (ver complementaria archivo1: S. 5. Microscopio y fototécnica). Coloque una placa de Petri que contiene un poco de agua bajo el microscopio.
- Poner a los juveniles en jaulas (trabajo experimental de laboratorio)
- Utilice una pipeta Pasteur para quitar a un individuo de una placa Petri y colóquelo con cuidado en la placa Petri al microscopio.
- Comprobar aptitud del individuo dentro del ocular (~ 40 aumentos).
Nota: Gimnasio "Bueno" significa que el individuo se mueve, gira de lado a lado, empuja el pie fuera de la cáscara, etc. quitar muerto o baja aptitud individuos con un Pasteur pipeta y coloque en una placa Petri separadas (FWPM en aves jóvenes con un abierto Shell, sin movimiento, el pie no está hacia afuera, una cáscara fragmentada, juveniles que flotan descontroladamente en el agua, una visible descomposición de la cáscara, descalcificación parcial). - Tomar dos fotografías de un FWPM individual mostrando buena aptitud mediante un aumento constante de ~ 80 X. Ver archivo adicional 1: S.5. Microscopio y fototécnica. Guardar las fotos.
Nota: Para una buena medida de su longitud, el menor debe colocarse longitudinalmente (vista lateral). El objetivo principal es tomar una fotografía de alta calidad de la longitud máxima de cáscara lo suficientemente bueno para hacer un análisis de la imagen después. - Inserte al juvenil en la cámara apropiada en la jaula tan pronto como se toman las imágenes. Registrar los números de las fotos y la cámara.
- Repita este paso con cada uno individual para todas las cámaras usadas en la jaula de malla.
Nota: vea archivo complementario 1: S.1. Construcción de jaulas de malla. - Una vez todas las cámaras usadas mejillones perla, poner el tamiz plástico de la jaula, luego suavemente colocar la tapa de plástico y fijar todas las piezas junto con las tuercas.
- En el caso de una instalación en una zona hiporréica, pasar uno de los extremos de la manguera a través de una de las cámaras y fijarlo en esta posición, luego tomar la malla antiobstrucción y atar en el extremo inferior (ver 1 archivo complementario: S.1. Construcción de jaulas de malla).
- Juveniles de la tienda
- Poner la jaula en la caja de plástico con el agua del río, para que los juveniles se sumergen totalmente y mantienen en el envase térmico. Antes de la instalación, deje que los juveniles se adaptan a la en situ río temperatura del agua en el lugar de instalación (gradual enfriamiento, máx. 5 ° C en 24 h).
- Instalar jaulas de malla
- Preparar el material de campo, incluyendo las jaulas de malla con los juveniles, picos de acero, pernos y tuercas de metal, una llave, dataloggers de temperatura de campo (ver Tabla de materiales y archivo complementario 1: S.4.2. Medición del agua), una cadena, una cámara, el protocolo de campo, un martillo y una pala.
- Transporte de los juveniles FWPM al sitio en un envase térmico de campo (caja aislada), manteniendo una temperatura estable con variaciones < ~ 2 ° C. Poner el envase térmico con las jaulas de malla en el río en el sitio para dejar los juveniles se adaptan a las condiciones ambientales locales (pH, conductividad, etc.).
- Instale la malla de la jaula.
- Quite la jaula del acoplamiento de envase térmico del campo. Proporcionar con dos espigas de acero y fijar el registrador de datos de campo. Anclar la jaula en un hábitat con condiciones típicas para FWPMs en el área de estudio (por ejemplo, en el borde del flujo de la corriente principal, no en el flujo directo de agua, no en agua estancada, no en luz directa del sol).
- Para aguas abiertas, con un par de picos de acero, fijar la jaula hasta el fondo del río; pone a su lado y el nivel con el fondo del río, aguas abajo en un ángulo de 45° al caudal del río, hacia el centro del río. El borde horizontal inferior debe ser unos 10-15 cm por encima de la superficie del fondo del río. Mantener una distancia mínima de 2 m entre cada jaula en una localidad (ver 1 archivo complementario: S.4. Jaulas de mantenimiento).
- Para la zona hiporréica, cavar las jaulas en el fondo del río en una posición perpendicular del paisaje, perpendicular a la corriente de agua, para que el borde horizontal superior de la jaula es paralelo a la superficie del fondo del río y las cámaras se encuentran en el hiporréica profundidad que debe ser probada. Saque el extremo superior de la manguera de goma sobre la superficie inferior de la posibilidad de toma de muestras de agua durante el experimento (ver 1 archivo complementario: S.4.2. Medición del agua).
Nota: Se recomienda realizar controles periódicos y el mantenimiento de las jaulas (ver 1 archivo complementario: S. 4. Jaulas de mantenimiento).
- Quite la jaula del acoplamiento de envase térmico del campo. Proporcionar con dos espigas de acero y fijar el registrador de datos de campo. Anclar la jaula en un hábitat con condiciones típicas para FWPMs en el área de estudio (por ejemplo, en el borde del flujo de la corriente principal, no en el flujo directo de agua, no en agua estancada, no en luz directa del sol).
- Desinstalar las jaulas y transporte de los juveniles después de la exposición. Para esto, tire las jaulas fuera del agua, limpiar de sedimentos finos y a partir de material reflotada y ponerlos en el campo Envase térmico llenado de agua del río. Transporte de las jaulas inmediatamente al laboratorio e iniciar la evaluación de tasa de mortalidad y el crecimiento.
Nota: Consulte el archivo complementario de 1: S.3. Duración de la exposición. En el caso de una diferencia de temperatura de más de 5 ° C entre las jaulas y el entorno de laboratorio, es necesario para nivelar la temperatura. - Evaluar el experimento de comprobación de la aptitud / de la vida de cada menor (ver pasos 1.5.2 y 1.5.3) y 2 imagenes de cada menor directo en una placa Petri con un aumento constante de ~ 80 X. Grabar la aptitud y los números de las fotos y cámaras.
- Completar el experimento (común a todos los métodos)
- Realizar las mediciones en software de análisis de imagen. Utilizar software de análisis de imagen para la determinación de tamaño de cuerpo de cada menor evaluado en tanto las imágenes de entrada (paso 1.5.3) y en las imágenes de salida (paso 1.9). Uso la longitud máxima total shell registró en ambas fotografías como valores de tamaño de cuerpo en la entrada y salida.
- Introduzca los valores medidos en el procesador de la tabla y calcular el crecimiento incremento (%) para sobrevivir a cada juvenil.
- Estimar la tasa de supervivencia (%) por jaula de malla utilizando el cociente entre el número de individuos sobrevivientes a todos los individuos experimentales en la jaula de malla.
Nota: Después del experimento, volver a los sobrevivientes para el programa de mejoramiento
(ver 1 archivo complementario: S.6. Material biológico).
2. Sandy Cage
Nota: Véase la figura 2.
- Preparar material
- Preparar el material para la parte de laboratorio del experimento: 2 platos de Petri (diámetro ~8.5 cm), Pipetas Pasteur, un colador, 25 L de agua del río, una caja de plástico, tamices (malla de tamaño 1 y 2 mm), una caja de plástico grande (25 L), una jaula arena (véase archivo complementario 1 : S.2. Jaulas de arena construcción), ordenados de una cámara digital, un trinocular disección microscopio estéreo del zumbido, una cuadrícula de calibración (equipo de microscopio), arena del río de la zona de estudio (ver paso 2.1.3) y el protocolo. Véase tabla de materiales y archivo complementario 1: S. 2. Jaulas de arena construcción.
- Preparar el material para el proceso de aislamiento: Ronda de contenedores (1 por cada jaula más 1 extra), 2 placas de Petri (diámetro ~ 14 cm), una pipeta de Pasteur, lupas y 1 L de agua del río.
- Tamizar la arena de río a través de un tamiz de 2 mm a través de un tamiz de 1 mm para obtener una granulometría de 1-2 mm. secar la arena y se puede guardar en una forma seca hasta que se.
- Tomar los juveniles (ver 1 archivo complementario: S.6. Material biológico) del envase térmico y ponerlos en la caja Petri. Usando un frasco rociador y un colador, tamizar a través de los juveniles para eliminar los detritus.
- Configurar el microscopio y la cámara (ver 1 archivo complementario: S.5. Microscopio y fototécnica).
- Poner a juveniles en jaulas (trabajo experimental de laboratorio)
- Coloque la jaula arena en la caja de plástico. Esparcir la arena clasificada (ver paso 2.1.3) hasta un tercio de la altura de la caja de arena. Vierta agua en la caja. Asegúrese que la superficie de la arena unos 10 mm por debajo del nivel de agua. Inserte la caja de arena en la caja de 25 L de agua del río y exponerlo a la misma temperatura que el FWPMs juveniles (ver complementaria 1 archivo: S.6.2. Almacenamiento de material biológico) por 12 h. evitar cualquier exposición de la arena al sol.
- Tomar la placa de Petri con los juveniles FWPM preparados.
- Comprobar la aptitud de los individuos dentro del ocular (ver paso 1.5.2).
- Realizar la documentación fotográfica como sigue. Tomar una fotografía de todos los individuos descubiertos (ver paso 1.5.3) y elegir 10 de las personas mayores. Alternativamente, tomar fotos de todos los menores junto con bajo aumento (40 X) para una evaluación a granel y elegir a las 10 personas más. Guardar todas las fotos y registre sus números.
- Usando un frasco rociador, mover a los juveniles FWPM en la caja de arena preparada.
- Juveniles de la tienda
- Poner la jaula en la caja grande de plástico con agua del río para que la jaula se sumerge completamente y mantener en el envase térmico. Que los juveniles se adaptan a la en situ río temperatura del agua (gradual enfriamiento, máx. 5 ° C por 24 h) antes de la instalación.
- Instalar jaulas de arena
- Preparar el material para la instalación de campo: jaulas de arena, un envase térmico de campo ~ 25-L, una piedra plana (mínimo 1 kg de peso), una red (malla calibre 10 x 10 mm), una botella de squirt, dataloggers de temperatura de campo (véase Tabla de materiales y archivo complementario 1: Medición de agua S.4.2.), una espada y el protocolo de campo.
- Transporte de las jaulas con los juveniles en el sitio en el campo Envase térmico, manteniendo una temperatura estable (cambio de ~ 2 ° C). Poner el campo Envase térmico con las jaulas de arena en el río en el sitio de campo para dejar los juveniles FWPM adaptarse a las condiciones ambientales locales (pH, conductividad, etc.).
- Instalar las jaulas de arena en hábitats con condiciones típicas para FWPMs (p. ej., en el borde del flujo de corriente principal en un meandro, no en el flujo de agua directo, no en agua estancada, no en luz directa sol).
- Para aguas abiertas, sujetar las jaulas de arena a una piedra plana con una red y colocarlo en el fondo del río. Asegúrese de que el lado más grande de la jaula forma un ángulo de 45° con el flujo.
- Para Hyporheal, cavar las jaulas en el fondo del río perpendicular al flujo de agua para que la tapa de la jaula esté nivelado con la superficie del fondo del río.
Nota: Se recomienda realizar controles periódicos y el mantenimiento de las jaulas (ver 1 archivo complementario: S. 4. 1. controles del sitio).
- Desinstalar jaulas y transporte menores después de la exposición
Nota: vea archivo complementario 1: S.3. Duración de la exposición.- Tire las jaulas fuera del agua, limpiar de material reflotada y ponerlos en el campo Envase térmico llenado de agua del río.
- Transporte de las jaulas al laboratorio e iniciar la evaluación de tasa de mortalidad y el crecimiento.
Nota: En el caso de una diferencia de temperatura de más de 5 ° C entre las jaulas y el entorno de laboratorio, es necesario nivelar la temperatura.
- Independientes menores FWPM de arena
- Preparar un recipiente redondo con una profundidad de agua de 50 mm (para cada jaula por separado) y un contenedor extra redondo. Trasvasar la arena de la caja de envase redondo. Use un movimiento de remolino para lavar las partículas más ligeras en un contenedor extra.
- El contenido de este envase de la muestra poco a poco y buscar juveniles paso a paso usando una pipeta Pasteur y una lupa. Poner a los juveniles en la caja Petri con la pipeta de Pasteur. Repita este paso hasta que el último juvenil se ha encontrado y luego otra 10 veces después del primer hallazgo negativo. Después de cada paso del lavado, agregar agua limpia al envase original con la arena.
Nota: Especialmente después del primer lavado, correctamente examinar el contenido y limpiar de lastre tales como sedimentos finos y otros aluviones.
- Evaluar el experimento
- Comprobar la aptitud de cada menor (ver pasos 2.4.3 y 1.5.2) y contar el número de sobrevivientes.
- Tomar una foto (ver paso 2.4.4.) de cada individuo por separado, aunque esto significa que hay sin identidad clara de cada individuo. Como alternativa, tomar fotos a granel y elegir un subconjunto de los 10 individuos más crecidos los resultados finales.
Nota: Ambas posibilidades tienen un valor similar de presentación de informes. Posibilidad 1 tiene una limitación de una mayor carga de trabajo pero también el beneficio de la mayor ampliación de la foto y así también una mayor precisión.
- Completa el experimento
- Realizar mediciones en software de análisis de imagen. Completar el experimento como en las jaulas de malla (ver paso 1.10) con las siguientes excepciones: evaluar la tasa de crecimiento (%) de cada menor pero evaluar el grupo como un todo en el experimento de la jaula arena.
Nota: Después de la experiencia, los sobrevivientes deben devolverse para el programa de mejoramiento
(ver S.6.1 archivo complementario. Selección de un material biológico).
- Realizar mediciones en software de análisis de imagen. Completar el experimento como en las jaulas de malla (ver paso 1.10) con las siguientes excepciones: evaluar la tasa de crecimiento (%) de cada menor pero evaluar el grupo como un todo en el experimento de la jaula arena.
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Representative Results
Los cuatro métodos de bioindicación (aguas abiertas arena jaulas, jaulas de arena dentro de la cama, abrir jaulas de malla de agua y jaulas de malla dentro de la cama) se aplicaron para investigar la idoneidad de condiciones de entorno para FWPMs en la cuenca alta del Vltava río (selva de Bohemia, Checo República). Este río representa un lugar residual FWPM en Europa central19. Aquí, presentamos un conjunto de resultados que ilustran los aspectos más importantes de los cuatro métodos especialmente seleccionado. Más detalles se describen en un estudio amplio por Černá et al. 13.
El entorno del río se estudió a dos niveles:
() Un perfil longitudinal del río estaba representado por localidades (sitios A - E) de la corriente principal y afluentes de contaminación diferentes etapas (sitios R y V). Las localidades fueron probadas tanto por arena jaulas y jaulas de malla instalados en el flujo libre de agua. Además, ha sido una zona hiporréica de grava dentro de la cama sandy jaulas en lugares B, C y D.
(II) un entorno hiporréica fue probado en la localidad seleccionada C. La idoneidad de los diferentes sustratos (arena, grava, piedras) fue probada por jaulas de malla dentro de la cama.
La tasa de crecimiento y tasa de supervivencia de > los menores de 1 año de edad (ver 1 archivo complementario: S.6. Material biológico) fueron probados. El experimento se llevó a cabo en toda su extensión en el verano de 2014 y se repitió en menor medida en algunas localidades en el verano de 2015. De nivel (I), 2-6 sandy jaulas con un mínimo de 100 juveniles y 6 (2014) o 4 (2015) jaulas de malla con 6 juveniles se aplicaron en cada localidad por el método apropiado. Dentro de nivel (II), jaulas de malla de 7 con 6 juveniles fueron instalados en cada entorno de prueba. El tiempo de exposición fue de un mes para las jaulas de malla y tres meses para las jaulas de arena.
Se realizó el análisis estadístico r, versión 3.1.020. Se utilizaron pruebas de Kruskal-Wallis, Nemenyi Kruskal y Wilcoxon-Mann-Whitney. Para datos con una distribución normal, se realizó la regresión lineal o cuadrática.
Las localidades pueden distinguirse claramente basado en la tasa de crecimiento en las jaulas de malla de aguas abiertas a pesar de la variabilidad de alta dentro de la jaula, incluso en periodos de crecimiento favorable (figura 3). En la exposición más favorable crecimiento en el año 2015 (crecimiento tasa 19.3-41,8%), se descubrió una tendencia significativa en el perfil longitudinal, donde la tasa de crecimiento aumenta aguas abajo (prueba de Kruskal-Wallis, p < 0.001). Lo importante, la tasa de supervivencia era equivalente alta en ambas épocas (desde el 83%) (Figura 4A).
Por otro lado, las jaulas de arena de aguas abiertas mostraron una tendencia diferente entre las localidades de corriente principal en 2014: la tasa de crecimiento aumentó aguas abajo de la localidad (52%) a través de la localidad media C (153%) y después disminuye otra vez hasta la localidad E (46%) (una regresión cuadrática de los valores de crecimiento absoluto: r2adj = 0.77, F2, 13 = 25.66, d.f. = 16, p < 0.001). Esta tendencia fue confirmada también en 2015, cuando se registró la mayor tasa de crecimiento en la localidad de media C otra vez. Además, los valores de la tasa de crecimiento absoluta no difieren mucho entre 2014 y 2015. Por otra parte, la tasa de supervivencia difiere entre años, siendo mucho mayor en 2015 (de 48% a 72%) que en el 2014 (alrededor del 25%) (Figura 4B).
Un efecto de dos métodos diferentes de exposición también es claramente visible en el afluente contaminado (localidad V). Las jaulas de arena aquí expuestas durante los tres meses mostraron supervivencia de 0%, mientras que una tasa de supervivencia del 83% con crecimiento fue grabada por exposición al agua abierta malla jaulas aquí durante los 30 días.
Resultados de la cama dentro de jaulas de arena ilustran diferentes condiciones en el entorno de hiporréica en comparación con el agua en los lugares pertinentes. La tasa de crecimiento fue siempre menor en los sitios de hyporheal que en aguas abiertas, y la tasa de supervivencia fue mucho más variable (de casi 50% a 0%, Figura 4B).
Un estudio de microhábitats hiporréica usando las jaulas de malla dentro de la cama mostró un efecto significativo de la composición del sustrato sobre la supervivencia de juveniles. Las mejores condiciones se registraron desde el fondo pedregoso saturada de oxígeno (una tasa de supervivencia cercana al 100%) mientras que lo peor (una tasa < 40% supervivencia) indicaron en arena pobremente oxigenada donde también se detectó una muy alta variabilidad en sobrevivir. Hiporréica oxigenación de agua, que se midió varias veces durante el experimento, explica esta tendencia (figura 5).
Figura 1. Jaula de malla de bioindicación con compartimientos individuales. Ver archivo adicional 1 para más detalles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Jaula de arena de bioindicación. Ver archivo adicional 1 para más detalles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Variabilidad individual en la tasa de crecimiento de juveniles registrado por jaulas de malla de aguas abiertas en localidades B y E durante dos temporadas. Los medios y la desviación estándar se describen para cada malla de la jaula. Los valores se basan en la medición de 6 menores de edad (o menores de 4-5 si la mortalidad tasa > 0%) en cada jaula de malla.
Figura 4. Resultados de ejemplo de un campo de bioindicación experimentan con jaulas de malla y arena. (A) este panel muestra los resultados de ejemplo de un experimento de bioindicación de campo con jaulas de malla. Se analizaron un total de 6 localidades (B, C, D, E, R y V) dentro de la cuenca del río Vltava en 2 ocasiones (en 2014 y 2015). El tiempo de exposición fue de 30 días durante la temporada de verano. Las localidades B - E representan (en orden) un perfil longitudinal de un tramo de aproximadamente 20 km de la corriente principal del río. Lugares R y V representan perfiles de 2 tributarios. Marcan de capitales de la misma localidad en el panel (A) y (B). Todos los lugares se probaron con jaulas de malla de aguas abiertas. Además, localidad C también fue probado utilizando jaulas de malla dentro de la cama instaladas en 3 diferentes tipos de lecho del río (Cs = arena, Cg = grava, Cst = piedras) en 2014. Las jaulas se instalaron en 4-7 repeticiones en cada sitio. 6 juveniles de mejillón de agua dulce perla de 1 + años de edad fueron utilizados por la jaula del acoplamiento. Las tasas de crecimiento promedio están marcadas para los 3 individuos más grandes (máximo 3) de cada jaula del acoplamiento probado (columnas, eje izquierdo) y la tasa de supervivencia promedio por jaula de malla (puntos azules, eje de la derecha). Resultados (B) este panel muestra ejemplo de un campo de bioindicación experimentan con jaulas de arena. Se analizaron un total of7 localidades (A, B, C, D, E, R y V) dentro de la cuenca del río Moldava sobre en 2 ocasiones (en 2014 y 2015). El tiempo de exposición fue de 3 meses durante la temporada de verano. A - E los sitios representan (en orden) un perfil longitudinal de un tramo largo de aproximadamente 30 km de la corriente principal del río. Sitios de R y V representan perfiles de 2 tributarios. Capitales de marcan de la misma localidad en este y en el panel anterior. Todos los lugares se probaron con jaulas de arena de aguas abiertas. Además, localidades, B, C y D también se probaron utilizando dentro de camas jaulas arena instalados en sustrato de cama de río mazo (Bg, Cg y Dg) en 2014. Las jaulas fueron instaladas en 2-4 repeticiones en cada sitio. Al menos 100 menores de mejillón de agua dulce perla estuvieron presentes en cada jaula arena. La tasa de crecimiento promedio para los 10 individuos más grande (máximo 10) de cada jaula arena probado (columnas, eje izquierdo) y la tasa de supervivencia promedio por jaula arena (puntos azules, eje de la derecha) están marcados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Saturación de oxígeno. Este panel muestra la relación entre los valores mínimo de saturación de oxígeno más de 30 días de la exposición de jaulas de malla y la tasa de sobreviviente por jaula en jaulas de malla dentro de la cama expuestos en microhábitats diferentes cama en 2014. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 2014 | 2015 | |||
| localidad | exposición de 3 meses de jaulas de arena | 1 mes exposición de jaulas de malla | exposición de 3 meses de jaulas de arena | 1 mes exposición de jaulas de malla |
| A | 13.9 | - | - | - |
| B | 14.4 | 13.4 | 13.9 | 17.5 |
| C | 15 | 13.8 | 14.4 | 18.3 |
| D | 15 | 13.8 | 14.3 | 18.3 |
| E | 15.5 | 14 | - | 18.7 |
| R | 13.5 | 12.8 | - | - |
| V | 14 | 13.2 | - | - |
Tabla 1. Temperatura del agua superficial promedio (° C) en las localidades durante la exposición en 2014 y 2015.
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Discussion
Tiempo de exposición:
Incluso un mes expuesto malla jaulas mostrar un crecimiento visible que refleja las diferencias entre localidades (figura 3), por lo que son muy útiles para la detección fácil y rápida de una caracterización de la localidad. Sin embargo, la relevancia de los resultados depende del estado a corto plazo de las condiciones, que puede oscilar. En particular, eventos de precipitación corta pueden desempeñar un papel. Por el contrario, contaminación episódica impredecible puede no siempre será registrada. En la localidad de V (Figura 4A), agua química análisis detectó una onda corta de amonio fuerte aumento de13. Esto era probablemente responsable de la mortalidad en las jaulas de arena expuestas tres meses pero no afectó a las jaulas de malla expuesta 30 días.
Las fluctuaciones de temperatura también pueden afectar los resultados de exposición a corto plazo. La temperatura media de un mes durante la exposición de jaula de malla difiere entre los años (tabla 1). La tasa de crecimiento también varía en temperaturas más altas fueron acompañados por mayores tasas de crecimiento (prueba de Kruskal-Wallis p < 0.001). Por otro lado, la temperatura media del agua en los mismos lugares durante la exposición de jaula de arena de tres meses fue muy similar en ambos años (cuadro 1) y la tasa de crecimiento no difirió significativamente (Figura 4B).
Beneficios y deficiencias de los métodos descritos:
Una exposición de aguas abiertas es relativamente fácil de realizar pero es de valor limitado para hábitat bioindicación. El método de jaulas de malla de aguas abiertas es relativamente viejo16 y ha sido utilizado varias veces con pequeñas modificaciones10,11,12,13,21,22 , 23. sin embargo, estas jaulas no están limitadas por el oxígeno, cuya deficiencia es probablemente responsable de muchas muertes menores en condiciones de hiporréica. Así, jaulas de malla de agua pueden mostrar buen desarrollo incluso en lugares con mayor mortalidad y una disminución de la tasa crecimiento en jaulas de agua arena (lugar E) o una tasa de mortalidad de 100% en la en-cama arena jaulas, como en la localidad D en 2014 (Figura 4B). Al parecer, las jaulas de malla de agua muestran potencial crecimiento de la localidad, pero esto no puede ser realista ya que es dependiente de la real disponibilidad de microhábitats hiporréica dentro de una localidad. Debido a las jaulas de malla de agua tienen la capacidad de supervivencia alta (Figura 4A), hasta un 100% de supervivencia tasa13, pueden servir para la bioindicación de toxicidad crónica (o toxicidad aguda si se espera en un momento dado). También, pueden ser una presencia de fuente de alimento útil prueba hasta cierto punto.
Como un método nuevo y raro, las jaulas de arena de aguas abiertas simulan mejor las condiciones del hábitat hiporréica. Movimiento de los juveniles entre granos de arena es posible en este aparato, que ayuda a reducir el crecimiento de biofilm en la cáscara de juvenil. Una deficiencia de oxígeno hiporréica puede ser causada por la actividad de los microbios que colonizan los granos de arena; Este efecto puede ocurrir también parcialmente en jaulas que se colocan sobre un fondo del río. Sin embargo, debido a la periódica limpieza necesaria de obstrucción material deriva de una jaula, también se eliminan los sedimentos finos y así se cambian las condiciones en comparación con el hábitat natural hiporréica. Por lo tanto, la tasa de crecimiento puede también considerarse como crecimiento de la localidad potencial en jaulas de arena de aguas abiertas. Sin embargo, esto está más cercano de la conveniencia real de la localidad de jaulas del acoplamiento en aguas abiertas. Por lo tanto, los gradientes de velocidad de crecimiento longitudinal grabados por jaulas de arena (Figura 4B) también parecen ser más plausible e indicar un tramo de río más conveniente. Por otra parte, en las jaulas de arena, la posibilidad de juveniles y subadultos de cría hasta la madurez sexual es verificado9, para que jaulas de arena pueden servir como un método seguro de crianza y control biológico al mismo tiempo.
Sandy jaulas y jaulas de malla colocados en la posición dentro de-cama son más cercanos a las condiciones reales en un hyporheal superficial. Por que permite el movimiento del menor, jaulas de arena, en particular, los dos ofrecen un gradiente vertical y horizontal de varios centímetros en escala. Esta capacidad de moverse podría ser muy importante para escapar del temporales deficientes micro-zonas. Esta posibilidad no existe en la cama dentro de jaulas de malla. Por lo tanto, un número relativamente alto de unidades de la bioindicación es necesario, porque las condiciones hiporréica son muy variables13,24 (figura 5) y las pérdidas debido a una inadecuada ubicación son comunes.
En Resumen, los métodos de bioindicación utilizados en esta investigación corresponden con presuntos menores condiciones naturales en el siguiente orden:
1. abrir jaulas de malla de agua,
2. abrir jaulas de agua arena,
3. jaulas de malla de dentro de la cama,
4. en el lecho de arena jaulas.
La carga de trabajo por unidad aumenta en el mismo orden. Por otra parte, el número de menores para una prueba estadística de los resultados obtenidos aumenta en exposiciones dentro de la cama también. Parece ser que la dentro de la cama arena jaulas representan una más costosa pero método de bioindicación precisa. Este nuevo método necesita más pruebas en el futuro y comparación con otros tipos de estudios hiporréica basado en el piezómetro medidas25,26. En particular, es necesario estudiar el grado de similitud utilizando una sonda directa de medición de las condiciones fisicoquímicas en las jaulas y en el entorno de hiporréica.
El número de individuos en una jaula:
En comparación con jaulas de malla, no es posible medir el incremento de crecimiento de los juveniles específicos en jaulas de arena como no hay información en el cual individuo del conjunto de entrada es que en la salida. Es necesario trabajar con un valor medio. Si para todos los individuos, este valor puede ser muy bajo debido a un número de ejemplares muy lentamente crecientes; sin embargo, un par de personas puede crecer muy rápidamente (puentes de crecimiento). Ese crecimiento desigual es típico para mejillones27. La variabilidad del crecimiento entre los jóvenes aumenta con el aumento del tiempo de exposición y pueden producirse grandes diferencias, especialmente en temporadas de crecimiento favorable. Además, una exposición prolongada conduce a mayor mortalidad en las jaulas de malla (para una revisión véase Lavictoire, Moorkens, Ramsey, Sinclair y Sweeting28), así que podemos trabajar con un número significativamente menor de personas al final del experimento en comparación con el entrada conjunto de juveniles. Medir a solamente los varios juveniles más crecientes es un método posible.
La experiencia de cría de FWPM dentro del Plan de acción de la checa de mejillón de agua dulce perla9,29, así como los resultados de experimentos en30,de bivalvos31de mar, sugiere esa deficiencia de crecimiento juvenil bivalvos tienen una alta tasa de mortalidad, y hay sólo una posibilidad insignificante de su vida a la madurez. En cambio, puentes de crecimiento tienen una mayor tasa de supervivencia y son cruciales para una recuperación de la población. El parámetro 10 MAX (las 10 más rápidamente creciente de personas) los puentes de crecimiento tiene en cuenta y puede aumentar el valor informativo del experimento, aunque alta mortalidad ocurre (Figura 4B, temporada 2014). Cabe señalar que la estimación de crecimiento obtenida por este método no puede ser un falso positivo. Se puede sólo ser ligeramente subestimada porque muchos de los juveniles más grande al final del experimento habría crecido un poco más en este caso. Además, la carga de trabajo es menor si sólo se evalúan 10 individuos. Del mismo modo, una medida de tres personas máximo crecientes (máximo 3) demostró para ser adecuada en jaulas de malla, eliminando la influencia de individuos lentamente crecientes, sin perspectiva, lo que podría sesgar la imagen real sitio potencial de crecimiento.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Michal Bílý y Ondřej P. Simon fueron apoyados por becas de la Universidad Checa de Ciencias vida [interna beca Agencia de Facultad de ciencias ambientales, CULS Praga (42110 1312 3175 (20164236))]. Apoyo Karel Douda provino de la Fundación de la ciencia Checa (13-05872S). Se recogieron datos sobre la bioindicación y presente ocurrencia de mejillones de perla durante la implementación del Plan de acción de Checa de mejillones de agua dulce perla gestionado por la Agencia de conservación de la naturaleza de la República Checa, que está financiado por el gobierno de la República Checa y está disponible en
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| biological material maintenance and care | |||
| Freshwater pearl mussel juveniles | any | NA | from a FWPM breeding programme |
| plastic boxes | any | NA | |
| thermobox | MERCI | 212,070,600,030 | There are many possibilities. This is one example only. |
| field thermobox (ca25 l) | any | NA | cold box (insulated box) commonly used for food transport |
| river water | any | NA | |
| Petri dishes | any | NA | |
| plastic Pasteur pipettes with balloon bulb (droppers) | any | NA | hole diameter 1 mm |
| hydrogen peroxide | any | NA | |
| plastic container (ca 50 l) for river water | any | NA | |
| plastic tea strainer | any | NA | commonly used in kitchen |
| mesh cages construction | |||
| main plastic bodies | any | NA | |
| plactic covers | any | NA | |
| special technical sieves 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| special technical sieves 100 µm | Silk &Progress | UHELON 67 M | |
| rubber hose (diameter 5.5 mm) | any | NA | |
| steel bolts | any | NA | |
| steel nuts | any | NA | |
| spanner | any | NA | |
| steel spikes | any | NA | |
| pliers | any | NA | |
| beakers | any | NA | |
| plastic dishes (ca. 25x15x3-5cm) | any | NA | |
| squirt bottle | any | NA | |
| field protocols | any | NA | |
| stationery | any | NA | |
| plastic container | any | NA | |
| string | any | NA | |
| hammer | any | NA | |
| sandy cages construction and use | |||
| sieve 1 mm | any | NA | |
| sieve 2 mm | any | NA | |
| special technical sieves 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| plastic boxes with tight-fitting lid | any | NA | |
| hot melt adhesive | any | NA | |
| plastic box (ca 250 x 150 x 100 cm) | |||
| big plastic box (ca 25 l) | any | NA | |
| flat stone | any | NA | |
| net | any | NA | |
| river sand | any | NA | |
| round containers | any | NA | |
| magnifying glasses | Carson | Carson CP 60 | There ar many possibilities. This is one example only |
| cages installation and maintenance | |||
| field temperature dataloggers | ONSET | UA-001-64 | http://www.onsetcomp.com/products/data-loggers/ua-001-64 |
| spade | any | NA | |
| toothbrush | any | NA | |
| experiment evaluation | |||
| trinocular dissecting zoom stereo microscope | Bresser optic | ICD 10x-160x | There are many possibilities. This is one example only. |
| digital camera/ electronic eyepiece | Bresser optic | MikroCamLab 5M | There are many possibilities. This is one example only. |
| Calibration gird | Am Scope | SKU: MR100 | There are many possibilities. This is one example only. |
| external power source with two movable light guides | Arsenal | K1309010150021 | There are many possibilities. This is one example only. |
| Image software | ImageJ software | There are many possibilities. This is one example only. | |
| table processor | MS excel | There are many possibilities. This is one example only. |
References
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