Summary
שיטות פשוטות מתוארים על הפגנת הייצור של amyloids ציטוטוקסיות בעקבות זיהום של אנדותל ריאתי על ידי Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
חולים ששרדו דלקת ריאות רוממתם שיעורי התמותה בחודשים שלאחר השחרור החולים. זה היה שיערו כי דלקת של רקמת הריאה במהלך דלקת ריאות תוצאות בייצור של cytotoxins חיים ארוכים זה יכול להוביל לכשל איברים סיום עוקבות. פיתחנו במבחנה מבחני כדי לבדוק את ההשערה כי cytotoxins מיוצרים במהלך זיהום ריאתי. תאי אנדותל הריאות עכברוש מבודד, החיידק Pseudomonas aeruginosa משמשים מודל מערכות, והפגינו הייצור של cytoxins בעקבות זיהום של תאי אנדותל על ידי החיידקים היא באמצעות תרבית תאים ואחריו כימות ישירה באמצעות מבחני לקטט דהידרוגנאז שיטה מיקרוסקופיים ניצול טכנולוגיית ImageJ. מהות עמילואיד cytotoxins האלה הודגם על ידי מבחני הכריכה T thioflavin על ידי immunoblotting ו- immunodepletion באמצעות נוגדן נגד עמילואיד A11. ניתוחים נוספים באמצעות immunoblotting הפגינו טאו oligomeric ו- Aβ המיוצר ושוחרר על ידי תאי אנדותל בעקבות זיהום aeruginosa פ. שיטות אלה צריך להיות בקלות להתאמה ניתוחים של דגימות קליניות אנושי.
Introduction
חולים ששרדו דלקת ריאות. רוממתם שיעורי התמותה בחודשים שלאחר החולים פריקה1,2,3,4,5,6. ברוב המקרים, מוות מתרחשת על ידי סוג של כשל איברים סוף כולל כליות, ריאות, לב, או אירועים הכבד, כמו גם קו5,6. הסיבה שיעור התמותה גבוה באוכלוסיית חולים זו מעולם לא נקבעה.
דלקת ריאות מסווג כ להיות גם הקהילה רכשה או רכשה החולים (nosocomial), סוכנים שיכולים לגרום לדלקת ריאות כוללים חיידקים, וירוסים, פטריות וכימיקלים. אחד הגורמים העיקריים של דלקת ריאות nosocomial הוא החיידק Pseudomonas aeruginosa. Aeruginosa פ הוא אורגניזם גראם שליליים המשתמשת מערכת הפרשת סוג III להעברת מולקולות אפקטור שונים, הנקרא exoenzymes, ישירות אל הציטופלסמה של היעד תאים7,8. במהלך זיהום של תאי אנדותל הריאות, exoenzymes המטרה חלבונים תאיים שונים, לרבות צורת אנדותל הקשורים microtubule חלבון טאו9,10,11,12 , המוביל אל המכשול אנדותל התמוטטות וכתוצאה מכך בצקת ריאות חמורה, ירד תפקוד ריאתי ומוות, לעיתים קרובות,.
כאמור, חולים ששרדו ריאות הראשונית רוממתם שיעורי התמותה ב-12 החודשים הראשונים לאחר הפרשות חולים. מנגנון פוטנציאליים על ההסבר לתופעה זו הוא כי סוג כלשהו של רעל מאריכים נוצר במהלך זיהום ראשוני שמוביל לתוצאות המסכן. שתי תצפיות תומכים האפשרות הזו. ראשית, בתרבית ריאתי אנדותל תאים שטופלו בתחילה aeruginosa פ להיכשל להתרבות במשך שבוע לאחר החיידקים מומתים על ידי אנטיביוטיקה13. שנית, מאריכים prions וסוכנים עם מאפיינים פריון הוכחו מחלות האדם ושל בעלי החיים השונים, בעיקר מחלות הקשורות למערכת העצבים ה-14,15.
שיטות לבחינת פוטנציאל הייצור של סוכנים ציטוטוקסיות חיים ארוכים במהלך זיהום ריאתי לא תוארו. כאן סדרה של מבחני פשוטה במבחנה מתוארים שניתן להשתמש בו עבור חוקרים cytotoxin ייצור ופעילות בעקבות זיהום באמצעות סוכן גורם משותף דלקת ריאות, aeruginosa פ. מבחני אלה צריך להיות להתאמה בקלות לחקור אינדוקציה cytotoxin אפשרי בעקבות זיהום באמצעות חומרים אחרים הגורמים לדלקת ריאות, supernatants שנוצרו גם צריך להיות שימושי עבור חוקרים תופעות של cytotoxins כולה איברים או בעלי חיים. בסופו של דבר, מבחני המפורטות כאן ככל הנראה תהיה יכולת הסתגלות כדי לבדוק נוזלים ביולוגיים בעלי חיים ועל האדם לייצור cytotoxins במהלך דלקת ריאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים נבחנו, אושרה על ידי גופים מוסדיים ועדת אכפת לי חיה של אוניברסיטת דרום אלבמה, בוצעו בהתאם לתקנות הפדרלי, המדינה, והמקומיים כל. תרבויות העיקרי של עכברוש microvascular אנדותל תאי הריאות (PMVECs) התקבלו מהמתקן תא תרבות הליבה במרכז אוניברסיטת דרום אלבמה עבור ריאות ביולוגיה. תאים הוכנו באמצעות הליכים שתואר לעיל16.
1. דור של Supernatants ציטוטוקסיות
הערה: כאן, אנו משתמשים שני זנים שונים של aeruginosa פ: PA103, הכולל מערכת הפרשת השלישי סוג שלם מסוגל להעביר את exoenzymes ExoU, ExoT לתאי המטרה במהלך זיהום, ∆PcrV, אשר חסרה סוג מערכת הפרשת השלישי היא לא מסוגל העברת exoenzymes לתאי המטרה בעקבות חיסון.
- פסים חיידקים על פלטות אגר ווגל-בונר (VB)17 ולגדול בן לילה ב 37 º C.
- כדי להכין צלחות, להפוך את הפתרון מניות הבא (פוגל-בונר מלחי; מניות x 10): למדוד דור 2 MgSO4, 20 גרם חומצה ציטרית (חומצה חינם), 100 גרם K2PO4ו2פו ' NaH 35 g '4. להוסיף ddH2O 1 ליטר, תא לחץ למשך 15 דקות עם פליטה איטי.
- הניחו 7.5 גר' אגר 450 מ ל ddH2O ואת אוטוקלב כמפורט לעיל.
- בעקבות autoclaving, מקום שני פתרונות לתוך אמבט מים 50 ° C להתקרר.
- להוסיף 50 מ של x VB 10 מניות תמיסת מלח אגר.
- הוספת carbenicillin µg 400/mL (עבור הזנים של aeruginosa פ בשימוש) ומערבבים היטב על ידי מתערבל את הבקבוקון.
- מקום 5 מ"ל של הפתרון אגר VB לתוך מנות בודדות תרבות סטרילי, לאפשר את אגר לחזק ולאחר מכן לאחסן ב 4 ° C עד היום של זריעת חיידקים.
- ביום של זריעת חיידקים, לחמם צלחת 37 מעלות, ואז לרוץ בעירום חיידקים על צלחת באמצעות לולאה סטרילי. המקום הצלחת ב חממה 37 ° C בלילה
- לאמת PMVEC טוהר על ידי צביעת חיובית עם פלורסנט Griffonia simplicifolia לקטין, צביעת שלילי עם פלורסנט סליל pomatia לקטין (סמן תאי אנדותל עורקי). התאים aliquot, ההקפאה של חנקן נוזלי.
- לניסויים, לשמור על תאים בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 10% סרום שור עוברית, לגדל תאים חממה 37 ° C המכילה 5% CO2. להשתמש תאים פסוקים 5-15.
- בדור של supernatants ציטוטוקסיות, לוחית רישוי 2 x 106 תאים בודדים 150 ס"מ מנות ולגדול 3-4 ימים עד למפגש מושגת. השתמש שתי צלחות לכל ניסוי (ראו להלן).
- לניתוח של supernatants ציטוטוקסיות, צלחת צלחת עונה 1 פרק 105 תאים לתוך בארות בודדים של 6-באר ולגדול במשך ארבעה ימים עד למפגש מושגת.
- כדי לייצר תגובת שיקוע, לשטוף את אחת המנות שני 150 ס"מ של PMVECs מ שלב 1.3.1 בתמיסת באגירה פוספט, trypsinize, ואז לספור את התאים (אנחנו להשתמש מונה הניתן תא אוטומטית, בצע את הפרוטוקול של היצרן; ראה טבלה של חומרים). לשטוף את הצלחת אחרים של PMVECs מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק), ואז להדביק עם גם מזן aeruginosa פ -ריבוי של זיהום (MOI) של 20:1. זו מושגת כדלקמן:
- עבור aeruginosa פ, כמנת540 0.25 = 2 x 108 CFUs/mL. כדי להכין את הדילול, להוסיף 1 מ"ל HBSS cuvette חד פעמיות 1 מ"ל. לגרד מספיק חיידקים ממני הצלחת זה הוכן בשלב 1.1 עד OD540 של 0.25 מושגת כאשר נמדד באמצעות ספקטרופוטומטרים. השלב הבא יספק חישוב של כמה יהיה צורך חיידקים.
- אחרי מספר PMVECs בצלחת תרבות (שלב 1.4 לעיל), לקבוע את המספר המתאים של חיידקים כדי להוסיף למנה השנייה, אי-trypsinized תרבות המכיל את PMVECs. לדוגמה, אם נקבע כי המנה התרבות של PMVECs מכיל 1.3 x 107 תאים, אז היכונו 1.3 x 107 תאים x 20 חיידקים/תא x 1 mL/2 x 108 CFUs = 1.3 mL חיידקים.
- לדלל mL 1.3 של חיידקים לתוך HBSS נפח סופי של 20 מ ל, כך השטח כולו של מנה 150 ס"מ יכול להתכסות בנוזלים, ולאחר מכן להוסיף את החיידקים מדולל לצלחת של PMVECs.
- דגירה PMVECs מחוסן עם החיידק ב 37 ° C בחממה2 CO 5% עבור 4-5 שעות, עד פערים ניתן לראות מתבצעת טפט התא כאשר הצלחת נצפית ברמה המיקרוסקופית (ראה איור 1 עבור רמה נאותה של היווצרות פער).
- לאסוף את תגובת שיקוע ולאחר מכן צנטריפוגה 10 דקות ב g x 2,000 ומפרידה שולחן כדי להסיר את הלכלוך הסלולר.
הערה: כל צנטריפוגה מלמעלה בטבלה מסוגל g מספיק ביצירת לכפות הצניפה unlysed תאים, תא גדול שברי יכול לשמש בשלב זה. - שופכים את תגובת שיקוע לתוך מזרק בעל מסנן 0.2 µm מחוברת לקצה, ואז לעבור את תגובת שיקוע דרך המסנן כדי להסיר חיידקים.
- השתמש של aliquot של תגובת שיקוע סטרילי כדי לבדוק את cytotoxicity (ראה 2.1) ומקפיאים את שאר תגובת שיקוע ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
2. ניתוח של Supernatants ציטוטוקסיות
- Cytotoxicity Assay
- לגדול PMVECs במנות 6-ובכן עד למפגש. שטיפת בארות פעם עם HBSS, לאחר מכן להוסיף 1.5 מ של תגובת שיקוע מחוטא-מסנן (שנאסף או תאים PA103 - או ∆PcrV-מחוסן) וולס בודדים. להוסיף HBSS סטרילי טוב אחרת כפקד שלילי.
- למקם את הצלחת לתוך החממה2 CO עבור h 21-24, ולאחר מכן לצפות עבור תא הרג/cytotoxicity (ראה שלב הבא). להשתמש supernatants כי התערוכה cytotoxicity לניסויים נוספים, ולמחוק את אלה שאינם מציגים תא ההרג.
- כימות של הרג תא
- מדד לקטאט דהידרוגנאז (LDH) שחרור תאים מתים באמצעות ערכות Assay LDH זמינים מסחרית של היצרן המליץ הליכים.
- לחלופין, לכמת הרג תא ברמה המיקרוסקופית באמצעות תוכנת ImageJ. בשביל זה, להקליט תמונות מיקרוסקופיות ותחומי המנה תרבות המכיל תאים שלמים, ואז לכמת אזורי חסר תאים (מעיד על מוות של תאים ב- טפט) באמצעות מאקרו ImageJ (המכון הלאומי לבריאות) (ראה הקבצים המשלימים קידוד מותאם אישית ). אם רצונך בכך, לבצע את השלבים מאקרו באופן ידני כפי שמוצג להלן:
- קלט תמונות (בפורמט RGB או Tiff) לתוך המאקרו ולהתאים בניגוד ל- 15% רווי פיקסלים. לשכפל תמונות חדות מנוכים ולבצע את הפקודה "לחסר רקע" כדי לקבל תמונה בחדות גבוהה של שטח התא והן את הפער בתוך שדה הראייה.
- להחסיר את התמונה הזו התמונה המקורית ולשלב את התמונה המתקבלת עם התמונה המקורית באמצעות המחשבון תמונת הפונקציה "AND". להמיר את התמונה הנובעת שחור (רווחים) ומסכת לבן (תאים) עם הפונקציה הסף (מינימום 0, מקסימום 5), השתמש בפונקציה "בינארי לשחוק את" כדי להסיר רעש מתוך התמונה.
- למדוד את היחס בין שחור לבן פיקסלים בתוך התמונה תוצאות המדידה "אזור השבר". מגרש ולבטא את אזורי החלקי עבור כל נקודת זמן הטיפול אחוזים של אזור מרווח מקסימלי.
- אמצעים לחשב ולהשוות באמצעות חד-כיווני אנובה עם מבחן לאחר הוק של Tukey, עם ערכי p פחות מ- 0.05 נחשב משמעותי.
- השתמש immunoblot ניתוח להקים הנוכחות של עמילואיד, טאו oligomeric Aβ התרבות supernatants. לבצע ניתוח immunoblot באמצעות הליכים סטנדרטיים10,11,12, מלבד ריכוז supernatants התרבות 10-fold לפחות לפני אלקטרופורזה.
- להתרכז תגובת שיקוע, מקום 1-2 מ של תגובת שיקוע לתוך יחידה מסנן צנטריפוגה ממברנה אשר יש ניתוק של משקל מולקולרי של 10 kDa. אז, במקום יחידת מסנן לתוך צנטריפוגה מלמעלה בטבלה צנטריפוגה-2,000 x g עד מידת הריכוז הנדרש מושגת (בד כ 45-60 דקות).
- לקבוע את כמות חלבון מרוכז supernatant11 , לטעון כמויות שוות של מדגמים לתוך בארות בודדים של הג'ל.
- לבדוק תרביות, להעביר את החלבונים ניטרוצלולוזה ולאחר מכן בדיקה שהכלים עם נוגדן נגד עמילואיד A11, נוגדן אנטי oligomeric טאו T22 או נוגדן anti-Aβ MOAB2 ואחריו נוגדנים משניים המתאים. לפתח את שהכלים באמצעות הליכים chemiluminescence רגיל.
- כדי לבצע thioflavin T Assay, השתמש thioflavin T קרינה פלואורסצנטית (ThT) לכמת amyloids ב supernatants. עבור מדידות אלה, השתמש supernatants עיקור-מסנן.
- להכין פתרון מניות (50 x) של thioflavin T על ידי השעיית 8 מ ג thioflavin T (ThT) לתוך 10 מ ל תמיסת מלח פוספט buffered (PBS). לאחר ערבוב, לסנן את הפתרון דרך מסנן מיקרומטר 0.22 להסיר חלקיקים.
- למדידות, להוסיף µL 20 מניות ThT 1 מ"ל של PBS ב cuvette ספקטרופוטומטרים 1 מ"ל. למקם את הדגימה מדוללת spectrofluorimeter.
- למדוד פליטת קרינה פלואורסצנטית בסיסית באמצעות עירור nm 425 וסריקה של פליטת קרינה פלואורסצנטית מ 450-575 nm במרווחים של 2 ננומטר.
- בצע סריקה זמן לשגות באמצעות עירור nm 425 ונרכשה 482 פליטה ננומטר, עם נתונים כל 0.2 s 60 s.
- ה-20 הראשונית s של הסריקה זמן לשגות מודד קרינה פלואורסצנטית ב cuvette ריק. בגיל 20 s, להשהות את הסריקה ולהוסיף 10 µL של תגובת שיקוע עיקור מסנן cuvette. לערבב את cuvette על ידי היפוך ולאחר מכן מקם חזרה spectrofluorimeter.
- לחדש את הסריקה מבוססי-זמן, רכישת ה-40 הסופי s של נתונים.
- עם סיום הסריקה זמן לשגות, בצע סריקה ספקטרום פליטה פלורסצנטיות הסופי באמצעות הגדרות זהות, כמפורט 2.1.5.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assay פשוטה במבחנה פותחה כדי assay לנוכחות של cytotoxins ב supernatants של תאים נגועים החיידק aeruginosa פ. בעיקרון, האמצעי התרבות תאים נגועים נאסף 4 שעות לאחר תוספת חיידקים, החיידקים יוסרו על ידי מסנן עיקור של התרבות supernatant, ואז תגובת שיקוע סטרילי מתווסף אוכלוסיה חדשה של תאים. התאים ואז שנצפו 21-24 שעות לאחר התוספת של תגובת שיקוע, הרג תא הוא לכמת.
תוספת של aeruginosa פ לשכבות confluent של PMVECs גורם להיווצרות פערים בין התאים. In vivo, היווצרות פער מוביל בצקת ריאות ירד תפקוד ריאתי. היווצרות הפער שתואר וזמינותו, משמש כמצוין על-ידי הנוכחות של פערים להתחיל טופס ב- טפט תא כפי שמוצג הזמן-נקודת ההקרנה לשחרור cytotoxin לתוך התא תרבות supernatants ואת מספקת משך הדגירה עם PA103 איור 1. חיידקים ΔPcrV אל תגרום / תא הפערים בתנאים אלה הדגירה. לאחר זוהו פערים, תגובת שיקוע הוא נאסף, מסנן מחוטא, ולאחר מכן נוסף תמים PMVECs כדי להעריך את פעילות ציטוטוקסיות. PMVECs ב supernatants בהתאמה שלהם ואז הם ממוקמים בתוך אינקובטור עבור h 21-24, נצפתה ואז צילם. כפי שמוצג באיור2, תגובת שיקוע שנאספו PMVECs זה נדבק aeruginosa פ זן PA103 הכילה cytotoxins שהביאה למותו של תאים בתרבית מאת 21 h לאחר התוספת של תגובת שיקוע. לעומת זאת, אין מוות תאי נצפתה בתאים שליטה התייחס גם בינונית HBSS או עם תגובת שיקוע שנאסף מזן ΔPcrV Pseudomonas. ניתוח Immunoblot הפגינו מולקולות עמילואיד, כולל טאו oligomeric Aβ, נוצרים במהלך זיהום עם המתח PA103, בעוד amyloids לא מופקים על ידי המתח ΔPcrV בעקבות חיסון של PMVECs (איור 2). התפקיד של amyloids כמו cytotoxins ב assay זה אומת על-ידי immunodepletion של amyloids מ תגובת שיקוע לפני הוספת תאים בתרבית12. אמנם לא מוצג כאן, immunodepletion של תגובת שיקוע ציטוטוקסיות באמצעות נוגדן נגד עמילואיד A11 ונוגדן אנטי-טאו אוליגומר T22 לחלוטין מכלה ציטוטוקסיות פעילות של supernatants מיוצר בעקבות זיהום PA103 (Balczon. ואח 2017 12 , Balczon. et al., בהכנה).
פותחה שיטה הרומן, זול ופשוט של כימות של תאי ההרג. זה assay, ImageJ תוכנה כבר מותאם כדי לאפשר מדידה ישירה של אזורים בתוך שדה מיקרוסקופיים חוסר תאים (מרמז על הריגת תאים). האמינות של שיטה זו אומתה על ידי השוואה ישירה לשיטת ומבוססת מדידה תא להרוג, אשר היא שחרור LDH תאים. כפי שמוצג באיור3, ImageJ התוכנה ניתן להמיר אזורים של שדה מיקרוסקופיים המכילים תאים לבנים ואזורים חסרי תאים לשחור. לאחר מכן, יחס פשוטה של אזורים לבנים לשחור יכול לשמש כדי למדוד את תאי הרג. כאשר החל טפט confluent של תאים, בכל האזורים של השדה מיקרוסקופיים הם לבנים. אולם, מאת h 18 לאחר התוספת של supernatants המכיל cytotoxins, פערים טפט יכול להתגלות. כמות שטח של המנה תרבות ללא תאים ואז גדל באופן ליניארי עד 36 h שלאחר תוספת של תגובת שיקוע ציטוטוקסיות. כאשר מדידת LDH שחרור, התקבלו תוצאות זהות עם שחרורו LDH קודם להתגלות ב 18 h לאחר התוספת של תגובת שיקוע ציטוטוקסיות. LDH שחרור ואז גדל באופן ליניארי עד הרג תא מקסימלי נמדד ב- 36 h לאחר התוספת של תגובת שיקוע. מוות של תאים קטנים נמדדה ב תאים שטופלו תגובת שיקוע שנאספו מתאי ΔPcrV מחוסן (איור 3) או בתרבויות שטופלו HBSS עבור 36 h.
ניתן לכמת את כמות עמילואיד שוחררו תאים שטופלו חיידקים על ידי מדידת קרינה פלואורסצנטית ThT. איגוד של amyloids כדי ThT גורמת לשינוי הסתגלותי המולקולה ועלייה בעוצמתם זריחה. זה assay, thioflavin T נוספת של cuvette, זריחה בסיסית נמדד. ההקלטה פלורסצנטיות מופסק ואז בזמן aliquot קטן של דגימה נוספת. Cuvette ואז הוא חזר על fluorimeter, השינוי הוא פליטת קרינה פלואורסצנטית נרשם. כפי שמוצג באיור4, אסף תגובת שיקוע התאים היו מודגרות עם PA103 זן של עמילואיד aeruginosa פ הכיל כמצוין על-ידי עליית פליטת קרינה פלואורסצנטית. לעומת זאת, תגובת שיקוע של PMVECs מחוסן עם זן ΔPcrV חסרה amyloids, כמצוין על-ידי היעדרות של זריחה מוגברת.
איור 1. השפעות aeruginosa פ inolculation על מורפולוגיה PMVEC. חד שכבתי confluent של PMVECs לפני (א) ו- 4 שעות לאחר התוספת (B) של PA103 מזן aeruginosa פ. הפערים ניתן לראות בבירור טפט התא בתאים נגועים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. ניתוחים של ציטוטוקסיות supernatants. חלק [א]. תמונות נציג של תאים שטופלו ובקרה. PMVECs טופלו במשך 21 h עם תגובת שיקוע מתקבל מתאי מחוסן עם גם PA103 חיידקים (B) או זן ΔPcrV (ג). תאים שליטה היו מתפשט גם עבור h 21 עם מאגר HBSS (א). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. חלק [II]. אסף נציג immunoblots של supernatants ΔPcrV (א) או PA103 (B) נגוע PMVECs. שהכלים היו שנבדק עם נוגדנים נגד עמילואיד (A11) או oligomeric טאו (T22). Mr ב- kDa. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. כימות של הרג תא. (א) שדות מיקרוסקופ נציג של נקודות זמן שונות (ב h לאחר תוספת supernatant) בבאילו אזורים של השדה המכיל וחסרת תאים התגיירו לבן או שחור, בהתאמה, באמצעות תוכנת ImageJ. באותו שלב חדות התמונה לפני ההמרה גם מוצג. בר = 100 מיקרומטר. (B) השוואה של כימות של תא להרוג באמצעות תקן LDH שחרור assay ואת וזמינותו ImageJ. N = 4, * *p < 0.05, * * *p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. נציג ThT פלורסצנטיות assay נתונים. ריק וואקום המכיל ThT היו נרגשים-425 ננומטר ולאחר מכן פליטת קרינה פלואורסצנטית נמדדה ב- 482 ננומטר. רקע זריחה נאסף עבור 20 s, ולאחר מכן תגובת שיקוע מ או PA103 - או ΔPcrV-מחוסן PMVECs נוספה על כימיקלים. פליטת קרינה פלואורסצנטית הוקלט אז לרגע 40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
. הנה, שיטות פשוטות במבחנה מתוארים אשר מאפשרים הפגנה של הדור של amyloids ציטוטוקסיות במהלך זיהום עם דלקת ריאות גורמת האורגניזם. שיטות אלה כוללים תא תרבות cytotoxicity assay, immunoblotting, כימות של תא להרוג באמצעות שיטת מיקרוסקופיים הרומן, ThT מחייב. ניתוחים של הסוכנים ציטוטוקסיות הוכיחו כי הם עמילואיד בטבע (איור 2 , איור 4), מייצגים מאפיינים של פריון12. הדור של מולקולות פריון ציטוטוקסיות במהלך דלקת ריאות מספק הסבר שיעורי התמותה גבוהות שנמדדו ניצולים דלקת ריאות לאחר שחרורם חולים פוטנציאליים. ניסויים בביצוע בוחנים אפשרות זו.
האירוע מפתח עבור כל המחקרים המתואר הוא הדור של תגובת שיקוע ציטוטוקסיות, שני משתנים חשובים צריכים לקחת בחשבון. ראשית, בחולדה ניסויים מחולקת לרמות PMVECs שימשו עבור שני הצעד זיהום, וזמינותו cytotoxicity. אם סוגי תאים אחרים יכול לשמש לייצור cytotoxins לא נחקרו בפירוט, זה אפשרי כי תאים אחרים עשויים להיות מסוגלים להפיק supernatants ציטוטוקסיות לאחר הטיפול עם זנים שונים של aeruginosa פ. כפי שמוצג, cytotoxins עמילואיד בטבע וכוללים טאו oligomeric ו- Aβ. זה יכול להיות סביר לצפות כי סוגי תאים אחרים המבטאים חלבון טאו ו/או בטא עמילואיד עלול להיגרם ליצירת cytotoxins בעקבות חיסון חיידקי, למרות האפשרות הזו נשארת להיבדק. ההליכים מחולקת לרמות יכול לשמש לבחינת אם סוגי תאים אחרים יכולה להיגרם כדי לייצר amyloids ציטוטוקסיות בעקבות עלבונות שונים.
המשתנה החשוב השני דור של supernatants ציטוטוקסיות הוא משך הטיפול עם חיידקים. זה חיוני כי הדגירה של PMVECs יורשו התקדמות עד פערים ניתן לראות את טפט. זיהוי פערים טפט התא הוא exoenzymes אינדיקציה מוזרק על ידי חיידקים Pseudomonas לתוך הציטופלסמה התא המארח, כי exoenzymes הפעילים, והתוצאה היא הכחשה גבולות תא (איור 1). הניסיון שלנו הוא נקודת הזמן של משיכת גבולות תא מחוון אמין של שחרור cytotoxin לתוך תגובת שיקוע. . זה מפתה לשער כי שני האירועים קשורים כמו אחד amyloids ציטוטוקסיות ששוחרר הוא טאו oligomeric, ותוצאות שיבוש פעילות טאו depolymerization microtubule אשר תורמת שינויי הצורה תא בניסויים שבהם טיפולים כבר פחות מאשר משך הזמן הנדרש כדי לעודד היווצרות פער, זוהתה הקטן עמילואיד ציטוטוקסיות בוגרת.
וזמינותו cytotoxicity תיאר כתב יד זה היא פשוטה ואמינה. מוות תאי ניתן בקלות על ידי בדיקה מיקרוסקופית להקליט ולצפות במעשיהם לכמת ישירות מתוך תמונות מוקלטות מיקרוסקופיים. השיטות המתוארות כאן שימשו באופן בלעדי עבור הערכת ייצור cytotoxin בעקבות זיהום של תאי אנדותל הריאות עכברוש עם aeruginosa פ. סביר להניח כי ההליכים יכול להיות מותאם בקלות כדי להעריך אם amyloids ציטוטוקסיות מיוצרים לאחר ההדבקה עם אחרים דלקת ריאות גורמת סוכנים, כולל שני nosocomial-הקשורים חיידקים, חיידקים ווירוסים אחראי רכשה הקהילה סוגים של דלקת ריאות. יתר על כן, ההליכים דיווחו רק שימשו כדי לבחון ציטוטוקסיות עמילואיד דור במהלך זיהום של תאים בתרבית. תרבית תאים הוא מערכת מלאכותי, ההליכים המתוארים כאן סביר יכול להיות מותאם כדי להעריך את הדור של cytotoxins במהלך זיהום ריאתי של מודלים בעלי חיים והן בחולים אנושיים. אוסף של נוזלים ביולוגיים, כמו שטיפה bronchoalveolar, חיות נגועות או חולים יכול לשמש אותם סוגים של מבחני דיווח כאן כדי להעריך אם amyloids ציטוטוקסיות נוצרות במהלך תהליכי זיהום ויוו. ללא ספק, משך הזמן של דגירה עם חיידקים עשויה להיות שונה למדי כאשר מזריקים לתוך החיות ולאחר שטיפה bronchoalveolar צריך להיות שנאספו בנקודת זמן מרובים כדי לקבוע את משך הטיפול האולטימטיבי.
Immunoblot ניתוחים הוכיחו כי amyloids נמצאים ב- supernatants, כולל טאו oligomeric ו- Aβ (איור 3). למרות ההליכים immunoblot סטנדרטי, יש שלב מפתח זה חייב להתבצע לפני ייזום ניתוחים immunoblot. באופן ספציפי, זה קריטי כי supernatants להיות מרוכז לפחות כוחנו לפני immunoblotting כמו כמות עמילואיד ב תגובת שיקוע האו ם מרוכז הוא מתחת לגבול של זיהוי על ידי ניתוח immunoblot. כפי שדווח כאן, צנטריפוגה באמצעות צינורות מצויד עם מסנן היא השיטה בשימוש שגרתי בשלב זה ריכוז, אבל נראה סביר כי בשיטות אחרות, כגון משקעים TCA, יהיה פחות שימושי עבור שלב זה.
כימות של תא להרוג באמצעות תמונות מהווה מקדמה חשובה. כיום זמינים נהלי לכימות מוות תאי להסתמך על רכישת ערכות יקר למדי המאפשרים מדידה של LDH שחרור תאים מתים. וזמינותו המתוארים כאן כרוכה ללא עלות כפי ImageJ תכניות חופשיות להורדה מהאתר NIH. הסתגלות פשוטה של תוכניות ImageJ מאפשרת מדידה מדויקת למדי של תאי הרג. עם זאת, ראוי מדגישה כי כמה חפצים קטנים הם נתקל במהלך ביצוע של פרוטוקול מחולקת לרמות. הנושא העיקרי הוא כי שברי תאים, כגון אזורים של מגע מוקד, עשויים להישאר קשור עם המנה תרבות כמו תאים מתים. שברי תאים שיורית אלה ניתן להבחין באמצעות המצלמה ולתת אינדיקציה מלאכותי זה התאים נשארים על המנה. בתור שכזה, זה נדיר כי ערך של 100% תא הרג מתקבל באמצעות הליך זה.
חולשה של מערכת assay המדווחת היא כי amyloids cytotoxin בהכנת מעולם לא לגמרי הוגדרו. ככזה, כימות קשה. אליסה מבחני יכול לשמש כדי לספק רמות סך של amyloids שונים, מבלי לספק כל מידע מפורט על מינים בודדים כל הכנה. עד מבחני מדויקת יותר, כמו מסה או חוץ גופית בתוך מסונתז oligomers עמילואיד, ניתן לפתח, הכי טוב אחד יכול לעשות כיום כדי להתחיל ניסוי עם אותו מספר של תאים, תקופת דגירה של משך זהה, לאמת את זה cytotoxicity מתרחשת התעריפים כמו הכנות קודמות בהן השתמשו. וריאציה מכל הנורמות ומבוססת מציג אי-וודאות נוספת.
לסיכום, שיטות פשוטות במבחנה מתוארים על הפגנת הייצור של מולקולות רעילים עמילואיד על ידי תאי אנדותל הריאות בעקבות זיהום עם סוכן גורמי דלקת ריאות. מבחני אמין, סביר ניתן להתאים עבור אורגניזמים אחרים, לשימוש באמצעות נוזלים ביולוגיים המתקבל חיות נגועות, בחולים אנושיים. שיטות אלה יהיה שימושי עבור מחקרים חוקרת את התוצאות של דלקת ריאות, הקמת המנגנון המוביל אל סוף-האיבר כשל בקרב מטופלים לאחר הפרשות חולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא לדווח.
Acknowledgments
מחקר זה מומן חלקים על ידי NIH מענקים HL66299 TS, RB ו SL, HL60024 ל TS, HL136869 ל MF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
