Summary
簡単な方法は、緑膿菌による肺血管内皮細胞の感染細胞傷害性のアミロイドの生産の「論証の説明します。
Abstract
生き残る肺炎患者は、退院後数ヶ月で死亡率を上昇しています。肺炎肺組織の感染結果後続エンド臓器不全につながることができる長寿命の cytotoxins の生産をえられています。肺感染症の中に cytotoxins が生産されている仮説をテストするための in vitroアッセイを開発しました。ラット肺血管内皮細胞と細菌緑膿菌をモデル システムとして使用され、続いて細胞培養を用いた細菌による内皮細胞の伝染に続く cytoxins の生産を示す乳酸脱水素酵素アッセイと ImageJ 技術を活用した新規顕微鏡法を用いた直接定量から。これらの cytotoxins のアミロイドの性質を示した thioflavin T 結合の試金、イムノブロットおよび A11 抗アミロイド抗体を用いた immunodepletion。イムノブロット分析は、オリゴマー タウと a β が制作され膿によって感染内皮細胞が発表したことを示した。これらのメソッドは、ひと臨床サンプルの解析に容易に適応する必要があります。
Introduction
肺炎を生き残るための患者は次の病院退院1,ヶ月で死亡率を上昇している2,3,4,5,6。ほとんどの場合、死は、ストローク5,6と同様、腎、肺、心臓を含むエンド臓器不全や肝のイベントのいくつかのタイプで発生します。この患者集団で高い死亡率の原因は確立されていません。
肺炎がコミュニティ買収されるどちらかとして分類されるまたは院内 (院内)、および肺炎を引き起こすことができるエージェントは、細菌、ウイルス、菌類および化学薬品。院内肺炎の主要な原因の 1 つは緑膿菌です。膿はタイプ III の分泌システムを使用して、ターゲット セル7,8の細胞質に直接 exoenzymes と呼ばれる、様々 なエフェクター分子を転送するグラム陰性生物です。肺血管内皮細胞の感染、時に、exoenzymes は微小管関連蛋白タウ9,10、11,12 の内皮のフォームを含む、各種の細胞内タンパク質をターゲットします。、肺機能と、多くの場合、死に低下した重度の肺浮腫の結果血管内皮バリア破壊に至る、です。
前述したように、初期の肺炎を生き残るための患者は退院後最初の 12 ヶ月で死亡率を上昇しています。この現象を説明するための潜在的なメカニズムは、長期的な予後につながる初期の感染時に長命毒素のいくつかの種類が生成されることです。2 つの観測は、この可能性をサポートします。膿と最初に扱われる最初、培養肺血管内皮細胞は、細菌が抗生物質13によって殺された後の週までの増殖に失敗します。第二に、長命のプリオンとプリオンの特性を持つエージェントは、様々 な人間や動物疾患、特に病気に関連付けられている神経系14,15で実証されています。
肺感染症の中に長寿命の細胞毒性薬の潜在的な生産の調査の方法を記載されていること。ここで簡単な生体外の試金のシリーズのとおりグリコプロテイン生産と一般的なエージェントの肺炎原因、膿を使用して感染活動を調査するために使用できます。これらの試金は調査可能グリコプロテイン誘導感染、肺炎を引き起こす他のエージェントを使用して、次に容易に適応する必要があり、生成される清面も全部 cytotoxins の効果を調査するため役に立つはず臓器や動物。最後に、ここで最も可能性の高い説明は、アッセイは肺炎の中に cytotoxins の生産のための動物と人間の体液をテストに適応可能であります。
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Protocol
動物のすべてのプロシージャを行った機関と動物ケア委員会南アラバマ大学によって承認し、すべての連邦、州、およびローカル規則に従って行われました。初代培養ラット肺微小血管内皮細胞 (PMVECs) の肺生物学南アラバマ大学センターで細胞培養コアから得られました。前に説明した手順16を使用して電池を作製しました。
1. 細胞培養上清の世代
注: ここで、我々 は緑膿菌の 2 つの異なる系統使用: PA103 標的細胞に感染、およびタイプ III の分泌システムに欠けている、∆PcrV の中に ExoU と ExoT exoenzymes を転送することができるそのままタイプ III 分泌システムを持っています。exoenzymes を接種対象セルに転送することができません。
- フォーゲル ボナー (VB) 寒天培地プレート17に細菌を連勝し、37 ° C で一晩成長
- プレートを準備するように次の原液 (フォーゲル ボナー塩; 10 x の在庫): 2 g MgSO4、20 g のクエン酸の酸 (遊離酸)、100 g K2PO4、および 35 g NaH2PO4を測定します。1 L と低速排気で 15 分間オートクレーブに ddH2O を追加します。
- 450 mL ddH2O で 7.5 g の寒天と上記としてオートクレーブを配置します。
- オートクレーブ、次クールに 50 ° C の水浴に両方のソリューションを配置します。
- 寒天に 10 x VB ストック塩溶液 50 mL を追加します。
- (使用されている膿の系統) の 400 μ g/mL に carbenicillin を追加し、フラスコを旋回でよく混ぜます。
- 個々 の無菌培養皿に VB の寒天液の場所 5 mL は、固化し、細菌の播種日まで 4 ° C で保存する寒天を許可します。
- 細菌の播種日前 37 ° c のプレートを温めるし、プレート滅菌ループを使って細菌を連勝します。37 ° C の定温器のプレートの場所は一晩します。
- 肯定的な染色蛍光グリフォニア simplicifolia PMVEC 純度を確認レクチンおよび否定的な汚損蛍光リンゴマイマイレクチン (血管内皮細胞のマーカー)。細胞分注、液体窒素で凍結。
- 実験用セル ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 牛胎児血清を添加したを維持し、5% CO2を含む 37 の ° C の定温器で細胞を成長します。5-15 の通路でセルを使用します。
- 細胞培養上清の世代、個々 の 150 cm 皿に 2 x 10 の6セルをプレート、合流点を達成するまで 3-4 日の拡張します。2 枚実験 (下記参照) を使用します。
- 、細胞培養上清の分析プレート 1 × 105セル 6 ウェルの個々 の井戸には皿し、合流が達成されるまで 4 日間の成長します。
- 上清を生成するリン酸緩衝生理食塩水でステップ 1.3.1 から PMVECs の 2 つの 150 cm の料理の一つ、trypsinize、洗ってその後セルをカウント (我々 は、自動化された細胞カウンターを使用して、製造元のプロトコルに従う;材料の表を参照してください)。PMVECs とハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) の他の皿を洗って、20:1 の感染 (MOI) の多様性で膿のいずれかの株に感染してしまいます。これは、次のとおり達成されます。
- 膿の540 0.25 = 2 × 108 CFUs/mL を OD します。この希釈を準備するには、1 mL の使い捨てのキュベットに 1 mL HBSS を追加します。分光光度計を使用して測定したとき、0.25 の外径540が得られるまで手順 1.1 で準備されたプレートから十分な細菌をこすり。次のステップは、細菌が必要とどのくらいの計算になります。
- 培養皿の PMVECs の数が決定される (1.4 上記の手順)、適切な PMVECs を含む 2 番目、非トリプシン培養皿に追加する細菌数を決定します。たとえば、PMVECs の培養皿は 10 の7セル x 1.3 が含まれているし、1.3 × 107セル x 20 細菌/携帯 x 1 mL/108 CFUs の準備と判断された場合は、1.3 mL の細菌を = します。
- 20 mL の最終巻には HBSS に細菌の 1.3 mL を希釈する、150 センチメートルの皿の表面全体液で覆われることができますし、PMVECs のプレートに希釈した細菌を追加します。
- プレートは、顕微鏡で観察するときセル単分子膜の形成、ギャップを見ることができるまで、4-5 時間 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で細菌を接種した PMVECs (ギャップ形成の適切なレベルを参照してください図 1 ) 孵化させなさい。
- 、上清を収集し、細胞の残骸を削除する卓上遠心分離機で 2,000 x g で 10 分間遠心します。
注: 十分な g を生成することができる任意のテーブル トップ遠心強制ペレット unlysed 細胞及び大細胞断片はこの手順で使用できるには。 - 上清を上澄みの細菌を除去するフィルターを通過し、その末尾に添付 0.2 μ m フィルターを持つ注射器に注ぐ。
- 無菌培養上清の因数を使用して細胞毒性をテスト (2.1 を参照) し、将来使用するため-80 ° C で培養上清の残りの部分を凍結します。
2. 細胞培養上清の分析
- 細胞毒性の試金
- 合流点まで 6 よく料理の PMVECs を成長します。洗浄井戸一度 HBSS で追加 1.5 mL (どちらか PA103 または ∆PcrV 接種の細胞採取) フィルター滅菌培養上清の個々 の井戸。また一つに陰性対照として滅菌 HBSS を追加します。
- 21-24 h の CO2インキュベーターにプレートを配置し、セル殺害/細胞毒性のための観察 (次の手順を参照してください)。さらに実験のため細胞毒性を示す培養上清を使用し、細胞の殺害を表示しないものを破棄します。
- セル殺害の定量
- 市販の LDH アッセイ キットと製造元を使用して死んだ細胞からメジャー乳酸脱水素酵素 (LDH) のリリースでは、手順をお勧めします。
- また、顕微鏡的 ImageJ ソフトウェアを使用してセル殺害を定量化します。このため、顕微鏡画像とそのままセルを含む培養皿のエリアを記録、セル (単層の細胞死を示す) に欠けている地域を定量化するカスタム ImageJ (健康の国民の協会) マクロ (を参照してくださいのコーディングの補足ファイルを使用).必要な場合は、手動で次のようにマクロのステップを実行します。
- マクロに画像 (RGB または Tiff 形式) を入力し、15% 飽和ピクセルのコントラストを調整します。コントラスト調整後の画像を複製し、ビューのフィールド内のセルとギャップ領域のコントラストの高い画像を得る「背景を引く」コマンドを実行します。
- 元のイメージからこのイメージを減算し、イメージ電卓"AND"関数を使用して元のイメージと結果のイメージを結合します。ブラック (ギャップ) と白 (セル) マスク (最低 0、最大 5) しきい値関数を得られる画像に変換し、画像からノイズを除去する「バイナリをむしばむ」関数を使用します。
- 「面積率」測定結果のイメージ内の白いピクセルを黒の比率を測定します。プロットし、最大ギャップ領域の % として各治療時点の小数のエリアを表現します。
- 手段を計算し、テューキー事後テストで重要と見なされる 0.05 未満のp値と、一方向の分散分析を使用して比較します。
- 培養上清中の a β オリゴマー タウ、アミロイドのプレゼンスを確立するのにイムノブロット解析を使用します。標準的な手順10、11,12、電気泳動前に、少なくとも 10 倍培養上清を集中以外を用いたイムノブロット解析を実行します。
- 上清を集中、その膜が 10 kDa の分子量カットオフ遠心フィルター ユニットに 1-2 mL の培養上清を配置します。その後、フィルター ユニットを配置テーブル トップ遠心分離機、遠心分離 2,000 x に g まで濃度の必要度は達成 (通常 45-60 分)。
- 11濃縮培養上清中のタンパク質の量を決定し、ゲルの個々 の井戸にサンプルの同量を読み込みます。
- ゲルを実行し、硝酸セルロースに蛋白質を転送、A11 抗アミロイド抗体、T22 反オリゴマー タウ抗体または適切な二次抗体に続いて MOAB2 抗 a β 抗体でしみをプローブします。化学発光の標準的なプロシージャを使用してしみを開発します。
- Thioflavin T アッセイを行う、上清中にアミロイドを定量化するのに蛍光 thioflavin T (ThT) を使用します。これらの測定はフィルター滅菌培養上清を使用します。
- 10 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に 8 mg thioflavin T (ThT) を停止することによって thioflavin T の原液 (50 倍) を準備します。混合した後、粉じんを除去する 0.22 μ m のフィルターを通してソリューションをフィルターします。
- 測定は、1 mL の PBS で 1 mL 分光光度計のキュベットに ThT 株式の 20 μ L を追加します。希釈したサンプルを蛍光測定装置に配置します。
- 425 nm 励起 2 nm 刻みで 450-575 nm の蛍光性の放出をスキャンしてベースライン蛍光発光を測定します。
- 425 nm 励起を用いたコマ撮りのスキャンを実行し、482 nm 発光、データ取得ごとの 0.2 s 60 s。
- 初期の 20 コマのスキャンの s 対策空白キュベットで蛍光します。20 s、スキャンを一時停止し、フィルター滅菌清 10 μ L をキュベットに追加。逆解析によるキュベットをミックスし、蛍光測定装置に置きます。
- 再開最終 40 を取得、時間ベースのスキャン データの s。
- コマのスキャンが完了したら、2.1.5.3 の詳細として同一の設定を使用して最終的な蛍光発光スペクトル スキャンを実行します。
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Representative Results
簡単な生体外の試金は、緑膿菌に感染細胞の上清中に cytotoxins の存在を試金するためにしました。基本的には、感染細胞から培養液、細菌の添加後 4 h を収集、細菌、培養上清、フィルター殺菌によって削除されます、無菌培養上清がセルの新しい人口に追加されます。細胞上清添加後に 21-24 時間観察し、細胞の殺害を定量化します。
PMVECs の合流の層に緑膿菌の添加は、細胞間のギャップの形成を誘導します。生体内でギャップの形成は肺水腫、肺機能の低下につながります。細胞培養上清に十分な期間 PA103 と孵化のグリコプロテイン リリースの検診時間ポイントに示すように単層の細胞で形成し始めるギャップの存在によって示されるように記述されているアッセイでギャップ形成を使用します。図 1。ΔPcrV 細菌はこれらの培養条件下での細胞のギャップを誘発しません。ギャップが検出されると、清は収集、フィルター、滅菌し、素朴な細胞傷害活性を評価するために PMVECs に追加されます。彼らのそれぞれの上清中に PMVECs し、21-24 h のインキュベーターは、観察し、撮影します。図 2のように、膿ひずみ PA103 に感染していた PMVECs から収集した上清には上澄みの付加の後で 21 h によって培養された細胞の死を誘導 cytotoxins が含まれています。対照的に、細胞死が認められなかった HBSS 中か上清 ΔPcrV シュードモナス菌から収集した治療コントロール細胞。イムノブロット解析中 PMVECs (図 2) の接種 ΔPcrV 株によるアミロイドは生成されません、PA103 ひずみと感染症の中に含むオリゴマー タウと、a β アミロイドの分子が生成されることを示した。この試金で cytotoxins としてのアミロイドの役割は、培養細胞12を添加する前に清からアミロイドの immunodepletion によって確認されています。ここに示されていませんが完全に A11 抗アミロイド抗体 T22 反タウ オリゴマー抗体を用いた細胞上清の immunodepletion 使い果たす PA103 感染 (Balczon et al. 2017 生産培養上清から細胞障害活性12 Balczonら、準備のために)。
小説、安価で、単純なセル殺害の定量化法を開発しました。このアッセイの ImageJ ソフトウェアはセル (セル殺害を示す) を欠いているミクロな場での直接測定を許可するように適応されています。この方法の信頼性は、測定細胞から LDH 放出である殺害, セルの確立法との直接の比較によって検証されています。図 3に示すとおり、ImageJ ソフトウェアは白セルを含むミクロな場の領域と黒セルがない領域を変換する使用できます。その後、黒に白領域の単純な比は、セル殺害を測定する使用できます。セルのコンフルエント単層にはじまって、ミクロな場のすべての地域が白いです。ただし、cytotoxins を含む上清の付加の後で 18 h で、単分子膜のギャップを検出でした。36 h 後細胞上清添加まで直線的に増加し細胞を欠いている培養皿の領域の量。LDH リリースを測定するとき細胞上清添加後 18 時間で検出される最初 LDH リリースで同一の結果が得られました。LDH リリースは、上清添加 36 h で測定した最大セル殺害まで、直線的に増加します。少しの細胞死は、細胞上清 ΔPcrV 接種した細胞 (図 3) から収集または 36 時間 HBSS 培養を測定しました。
ThT 蛍光を測定することによって細菌細胞から解放アミロイドの量を定量化することができます。ThT にアミロイドの結合分子と増加蛍光強度で構造のシフトが発生します。このアッセイのキュベットに thioflavin T を追加し、ベースラインの蛍光を測定します。サンプルの小さい因数を追加している間、蛍光録画が停止します。蛍光にキュヴェットを返し、変更は蛍光性の放出が記録されます。図 4に示すように、上清は蛍光性の放出の増加によって示されるように膿含まれているアミロイド PA103 株培養細胞から集められます。対照的に、PMVECs ΔPcrV 株を接種から上澄み増加蛍光の不在によって示されるアミロイドを欠けていた。
図 1。PMVEC 形態に及ぼすp inolculation.(A)および緑膿菌 PA103 ひずみの付加(B)の後の 4 時間前に PMVECs のコンフルエント単層。ギャップは、感染細胞の細胞膜ではっきり見ることが。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。細胞培養上清の分析。[I] の部分。コントロールと扱われた細胞の代表的なイメージ。PMVECs は、21 h のいずれか PA103 細菌(B)または歪み ΔPcrV (C)を接種した細胞から得られた上清と扱われました。制御の細胞も培養 HBSS バッファー (A)21 h の。スケールバー = 100 μ m. [Ii]。ΔPcrV (A)または PA103 採集、培養上清の代表 immunoblots (B)感染 PMVECs。しみは、アミロイド (A11) またはオリゴマー タウ (T22) に対する抗体をプローブしました。Mr kDa の。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。セル殺害の定量します。(A)代表的な顕微鏡のフィールド フィールドの領域でを含むと細胞に欠けている変換されたいずれかに白または黒、それぞれ、ImageJ ソフトウェアを使用して (上清添加後 h) で異なる時間ポイント。同じ位相差画像前に変換しているのです。バー = 100 μ m。 (B)標準 LDH リリース試金と ImageJ の試金を使用して細胞の定量の比較。N = 4、* *p < 0.05 * * *p < 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。代表 ThT 蛍光アッセイ データ。ThT を含む空白のキュベットは興奮していた、425 nm 帯および発光蛍光が 482 で測定した nm。背景の蛍光性はからどちらか PA103- または ΔPcrV-接種キュヴェットに PMVECs を追加しました 20 s と清の収集されました。蛍光性の放出は 40 秒間記録されます。
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Discussion
ここでは、簡単な培養方法の生物を引き起こす肺炎感染中の細胞毒性アミロイドの生成のデモンストレーションをするとおりです。これらのメソッドは、細胞培養の細胞毒性の試金、免疫ブロット、顕微鏡法と ThT バインドを使って細胞の定量。細胞毒性薬の分析を示した (図 2 と図 4) は本質的にアミロイドが、プリオンの12の特徴を表わします。肺炎の中に細胞傷害性プリオン分子の生成は、次の病院退院肺炎み高い死亡率のための潜在的な説明を提供します。進行中の実験は、この可能性をテストしています。
説明研究のすべてのキーのイベントが細胞上清の世代と 2 つの重要な変数を考慮しなければ。まず、輪郭を描かれた実験ラットでは、PMVECs は両方感染ステップと細胞毒性の試金のために使用されました。Cytotoxins の生産のため他の細胞型を使用できるかどうかは調査されていない、詳細に、他のセルは緑膿菌系統による細胞培養上清を生成することができる可能性があります。示すように、cytotoxins、自然の中のアミロイド、オリゴマー タウと a β を含まれます。テストするこの可能性が残っているが、細菌の接種 cytotoxins を生成するタウや β アミロイド蛋白質を表現する他の細胞型が誘発されるかもしれないことを期待するが妥当ででしょう。輪郭を描かれたプロシージャは、次の異なる侮辱細胞傷害性のアミロイドを生成する他のセルタイプを誘起することかどうかを調べることにされる可能性があります。
細胞培養上清の世代で 2 番目の重要な変数は、細菌による治療の期間です。単層のギャップを見ることができるまで進歩できる、PMVECs の培養が不可欠です。単層細胞のギャップの識別が表示 exoenzymes にシュードモナス細菌によってホスト細胞の細胞質に挿入されているし、exoenzymes がアクティブ、セルの罫線 (図 1) の取り消しの結果であります。我々 の経験は、培養上清をグリコプロテイン リリースの信頼性の高い指標であるセルの罫線の撤回の時点です。2 つのイベントが 1 つ解放される細胞傷害性のアミロイドのオリゴマー タウとタウの活動の中断の結果細胞形状の変化に寄与する微小管脱重合と関連するいると推測する魅力的です。どこの治療は、ギャップの形成を誘導するために必要な時間の量よりも少なくされている実験、少し成熟した細胞傷害性アミロイドが検出されました。
本稿で説明した細胞毒性アッセイは、シンプルで信頼性の高いです。細胞死の顕微鏡検査で容易に観察し、記録された顕微鏡画像から直接定量化できます。ここで説明されている方法は、専ら感染ラット肺血管内皮細胞の膿の毒素生産を評価するために使用されています。手順生成細胞毒性アミロイドには院内の両方を含むエージェントの原因他の肺炎、感染するかどうかを評価するためにすぐに適応できるそうだが細菌および細菌・ ウイルスの責任コミュニティ-取得肺炎の種類。また、報告された手順のみ感染培養細胞の中に細胞傷害性アミロイドの生成を確認する使用されています。細胞培養は人工的なシステムと、ほとんどの場合ここに記載されている手順は、肺感染症の動物モデルと人間の患者の両方で cytotoxins の発生を評価するために合わせることができます。体液から感染した動物や患者の気管支肺胞洗浄などのコレクションは、同じ種類のアッセイ細胞毒性アミロイドが体内感染プロセス中に生成されるかどうかを評価するためにここで報告で使用可能性があります。もちろん、動物に接種するときに細菌培養の期間がかなり異なる場合があります、気管支肺胞洗浄は、究極治療期間を決定するための複数の時点で収集しなければならないと思います。
イムノブロット解析は、アミロイドがオリゴマー タウと a β (図 3) などを含む、上清中に存在することを示しています。イムノブロット手順が標準、イムノブロット解析を開始する前に実行する必要があります重要なステップがあります。具体的には、培養上清こと集中して少なくとも 10 倍免疫ブロットする前に非集中の上澄みのアミロイドの量がのイムノブロットによる検出限界以下が重要です。ここで報告、遠心分離、フィルター搭載チューブを使用して、日常的にこの濃度ステップの使用方法が、TCA 沈殿物などの他の方法が同様のこの手順に便利になる合理的なようです。
重要な画像を用いた細胞の定量を表します。現在細胞死を定量化するための使用可能なプロシージャは死んだ細胞から LDH 放出の測定を許可するかなり高価なキットの購入に依存しています。ここで説明アッセイは、ImageJ プログラムは NIH のウェブサイトからダウンロードして無料、不要コストです。ImageJ プログラムの簡単な適応セル殺害のかなり正確な測定が可能します。ただし、輪郭を描かれたプロトコルのパフォーマンス中にマイナーな人工物のいくつかが発生したことを指摘する価値があります。主要な問題はフォーカル コンタクト エリアなどの細胞断片が細胞死ぬよう培養皿に関連付けられて残ることがあります。これらの残留細胞断片カメラによって検出することができます、セルがお皿に残っている人工の指示を与えます。など、この手順を使用して、100% セル殺害の値が得られることはまれです。
報告されたアッセイ系の弱点は、準備のグリコプロテイン アミロイドが完全に定義されていません。このように、定量は困難です。ELISA の試金は、各に備えて個々 の種について詳細な情報を提供することがなく異なるアミロイドのレベルの合計を提供するために使用できます。正確なアッセイまで質量仕様または体外アミロイド オリゴマーを合成、開発することができます最高の 1 つは現時点で行うことができます、セルの同じ番号を持つ各実験を開始、同じ期間インキュベートなど確認細胞毒性は、使用されている前の準備として同じ割合で発生します。確立された規範のいずれかからの変化は、追加の不確実性を紹介します。
要約すると、肺炎の原因となるエージェントと感染肺血管内皮細胞による毒性アミロイド分子の生産の「論証のため簡単な培養方法のとおりです。法は信頼でき、他の生物との使用感染した動物や人間の患者から得られた生物学的流体を用いた適応でしょう。これらのメソッドは肺炎の長期的な影響を調査し、研究および退院後の患者の終末器官障害につながるメカニズムを確立するために有用であります。
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Disclosures
なしにレポートします。
Acknowledgments
この研究は、NIH の補助金 HL66299 SL、TS へ HL60024 と mf HL136869、RB、TS によって部分で賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
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