Summary
介绍了用铜绿假单胞菌感染肺内皮后细胞毒性 amyloids 的制备方法。
Abstract
在出院后的几个月里, 患有肺炎的病人死亡率升高。据推测, 肺炎期间肺部组织感染导致长期存活的细胞毒素的产生, 从而导致随后的最终器官衰竭。我们已经开发了体外检测, 以检验细胞毒素在肺部感染过程中产生的假说。将孤立大鼠肺内皮细胞和细菌铜绿假单胞菌作为模型系统, 用细胞培养法对 cytoxins 后的内皮细胞感染进行了分析, 然后用乳酸脱氢酶测定法直接定量, 并利用 ImageJ 技术进行了一种新的显微方法。通过 thioflavin T 结合试验, 免疫印迹法和 immunodepletion 采用 A11 抗淀粉样蛋白抗体, 证明了这些细胞毒素的淀粉样蛋白性质。进一步分析使用免疫印迹法表明, 寡聚头和 Aβ是由内皮细胞产生和释放后感染的铜绿假单胞菌。这些方法应易于适应对人体临床样品的分析。
Introduction
在出院1、2、3、4、5、6之后的几个月里, 患肺炎的患者死亡率升高。在大多数情况下, 死亡发生的一些类型的最终器官衰竭, 包括肾脏, 肺, 心脏, 或肝脏事件, 以及中风5,6。这个病人的死亡率上升的原因从来没有建立。
肺炎被归类为社区获得的或医院获得的 (医院), 可以引起肺炎的药物包括细菌、病毒、真菌和化学物质。细菌性铜绿假单胞菌是医院内肺炎的主要病因之一。铜绿假单胞菌是一种革兰阴性有机体, 使用 III. 型分泌系统将各种效应分子 (称为 exoenzymes) 直接转移到靶细胞7、8的细胞质中。在肺内皮细胞感染期间, exoenzymes 靶向各种胞内蛋白, 包括微管相关蛋白头9、10、11、12 的内皮形态., 导致内皮屏障破裂导致严重肺水肿, 肺功能减退, 常常死亡。
如前所述, 在出院后的头12月中, 幸存于最初肺炎的病人的死亡率升高。解释这种现象的一个潜在机制是, 在最初的感染过程中产生了某种长期存在的毒素, 导致了长期的不良结果。两项意见支持这种可能性。首先, 在细菌被抗生素杀死13之后, 最初用铜绿假单胞菌治疗的培养的肺内皮细胞不能增殖长达一周。第二, 长期存活的普利子和具有朊病毒特征的特工已经在各种人类和动物疾病中表现出来, 特别是与神经系统有关的疾病14,15。
在肺部感染过程中, 研究长期存活的细胞毒性药物的潜在生产方法从未被描述过。这里概述了一系列简单的体外检测方法, 可用于调查使用常见肺炎引起的铜绿假单胞菌感染后毒素的生产和活动。这些化验应易于适应, 以调查可能的毒素诱导后, 使用其他药物引起肺炎的感染, 并产生的上清液也应有助于调查细胞毒素的影响, 整个器官或动物。最后, 这里概述的化验结果最有可能会适应于在肺炎期间生产细胞毒素的动物和人体生物液。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物程序都由南阿拉巴马大学的机构和动物护理委员会审查和批准, 并按照所有联邦、州和地方条例进行。主要培养的大鼠肺微血管内皮细胞 (PMVECs) 是从细胞培养核心设施, 在南阿拉巴马大学的肺生物学中心。细胞是用先前描述的步骤16编写的。
1. 细胞毒性上清液的产生
注: 在这里, 我们使用两种不同菌株的铜绿假单胞菌: PA103, 它有一个完整的 III 型分泌系统能够转移 exoenzymes ExoU 和 ExoT 的目标细胞在感染期间, ∆PcrV, 这是缺乏第三类分泌系统, 并在接种后无法将 exoenzymes 转移到靶细胞。
- 条纹细菌上伏地尔-博纳 (VB) 琼脂板17和增长隔夜在37摄氏度。
- 要准备板材, 请做以下库存解决方案 (伏戈尔-博纳盐; 10x 库存): 测量2克 MgSO4, 20 克柠檬酸 (游离酸), 100 克 K2po4, 35 克 NaH2po 4。添加 ddH2O 到1升和高压釜为15分钟与慢排气。
- 放置7.5 克琼脂在450毫升 ddH2O 和高压釜如上所述。
- 跟随热处理, 安置两个解答入50°c 水浴冷却。
- 添加50毫升的 10x VB 库存盐溶液的琼脂。
- 添加羧苄青霉素到400µg/毫升 (对于使用的铜绿假单胞菌), 并通过旋转烧瓶混合良好。
- 将 VB 琼脂溶液的5毫升放入单独的无菌培养皿中, 使琼脂凝固, 然后贮存在4摄氏度直到细菌播种的那天。
- 在细菌播种的当天, 预热一盘到37摄氏度, 然后用无菌循环将细菌纹在盘子上。把盘子放在37摄氏度的恒温箱里过夜。
- 用荧光加纳单叶蔓荆凝集素和阴性染色与荧光螺旋蜗牛凝集素 (动脉内皮细胞的标记) 进行阳性染色, 验证 PMVEC 纯度。整除细胞并在液氮中冷冻。
- 在实验中, 维持 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) 中的细胞补充10% 胎牛血清, 并在37摄氏度孵化器中生长细胞, 含 5% CO2。使用 5-15 通道上的细胞。
- 对于生成的细胞毒性上清液, 板 2 x 106细胞成单独的 150 cm 菜肴和成长为 3-4 天, 直到汇合达到。每个实验使用两个盘子 (见下文)。
- 为分析细胞毒性上清液, 板 1 x 105细胞成一个6井盘的个体井并且增长四天直到汇合达到。
- 要生产上清, 洗一 PMVECs 的两个150厘米菜肴之一从步骤1.3.1 与磷酸盐缓冲盐水, 胰蛋白酶处理, 然后计数的细胞 (我们使用一个自动单元计数器, 并按照制造商的协议; 见材料表)。用汉克的平衡盐溶液 (HBSS) 洗另一盘 PMVECs, 然后用任一株铜绿假单胞菌感染20:1。实现方式如下:
- 对于铜绿假单胞菌, OD540 0.25 = 2 x 108 CFUs/毫升。要准备这种稀释, 添加1毫升 HBSS 到1毫升一次性试管。在步骤1.1 中所准备的板上刮出足够的细菌, 直到使用分光光度计测量540的0.25。下一步将提供一个计算多少细菌将需要。
- 一旦确定了培养皿中的 PMVECs 数量 (上面的步骤 1.4), 确定了适当数量的细菌添加到第二个, 非 trypsinized 培养皿中含有 PMVECs。例如, 如果确定 PMVECs 的培养皿包含 1.3 x 107细胞, 则准备 1.3 x 107细胞 x 20 细菌/细胞 x 1 mL/2 x 108 CFUs = 1.3 毫升细菌。
- 将1.3 毫升的细菌稀释成 HBSS 的最后体积20毫升, 使整个表面的150厘米的盘子可以被液体覆盖, 然后将稀释的细菌添加到 PMVECs 的盘子里。
- 孵化的 PMVECs 接种的细菌在 5% CO2孵化器37°c 为 4-5 h, 直到缝隙可以看到形成在细胞单层时, 显微镜观察 (见图 1为适当水平的差距形成)。
- 收集上清, 然后离心机10分钟在 2000 x g 在一个台式离心机去除细胞碎片。
注: 任何能够产生足够的 g 力的表顶离心机 unlysed 细胞和大细胞碎片可用于这一步骤。 - 将上清液倒入装有0.2 µm 过滤器的注射器上, 然后通过过滤器将上清液移除细菌。
- 使用整除的无菌上清液测试细胞毒性 (见 2.1), 并冻结其余的上清在-80 °c, 以供将来使用。
2. 细胞毒性上清液分析
- 细胞毒性试验
- 在6井的菜肴中生长 PMVECs 直到汇合。用 HBSS 洗井一次, 然后添加1.5 毫升的过滤灭菌上清 (从 PA103 或∆PcrV 接种的细胞收集) 到个别水井。将无菌 HBSS 添加到另一个井中作为阴性对照。
- 将该板块放入 CO2孵化器中 21-24 小时, 然后观察细胞杀伤/细胞毒性 (见下一步)。使用上清液的细胞毒性进行进一步的实验, 并丢弃那些不显示细胞杀戮。
- 细胞杀伤的定量
- 利用商用 LDH 检测试剂盒和制造商推荐的程序, 测定死细胞中乳酸脱氢酶 (LDH) 的释放。
- 或者, 用 ImageJ 软件量化细胞杀伤。为此, 记录了含有完整细胞的培养皿的显微图像和区域, 然后使用自定义 ImageJ (国家卫生研究院) 宏量化缺乏细胞的区域 (用单层表示细胞死亡) (参见补充编码文件).如果需要, 请手动执行宏步骤, 如下所示:
- 输入图像 (RGB 或 Tiff 格式) 到宏中, 并调整对比度为15% 饱和像素。复制对比度调整图像, 并执行 "减去背景" 命令, 以获得在视野内的细胞和间隙区域的高对比度图像。
- 从原始图像中减去此图像, 并使用图像计算器 "和" 功能将生成的图像与原始图像相结合。将结果图像转换为黑色 (空白) 和白色 (单元格) 掩码, 具有阈值函数 (最小 0, 最大值 5), 并使用 "二进制腐蚀" 函数从图像中移除噪音。
- 使用 "区域分数" 度量测量生成图像内的黑色和白色像素的比例。绘制和表达每个处理时间点的分数区域作为最大间隙面积的百分比。
- 计算方法和比较使用单向方差分析与 Tukey 的后专项测试, p值小于0.05 被认为是重要的。
- 利用应用免疫印迹分析建立淀粉样蛋白、寡聚头和 Aβ在培养上清液中的存在。使用标准程序10、11、12进行应用免疫印迹分析, 但在电泳前至少有10倍的浓缩培养上清液。
- 要集中上清液, 将 1-2 毫升的上清液放入离心过滤器单元, 其膜的分子量为 10 kDa。然后, 将过滤单元放入工作台顶部离心机和离心机 2000 x 克, 直到达到所需浓度 (通常为 45-60 分钟)。
- 确定浓缩清液11中的蛋白质含量, 并将等量的样品装入凝胶的单个水井中。
- 运行凝胶, 转移蛋白质到硝化棉, 然后探针印迹与 A11 抗淀粉样蛋白抗体, T22 抗寡聚头抗体, 或 MOAB2 抗 Aβ抗体, 其次是适当的二级抗体。使用标准化学发光程序来开发印迹。
- 为了进行 thioflavin t 检测, 使用 thioflavin t 荧光法对上清液中的 amyloids 进行量化。对于这些测量, 使用过滤灭菌上清液。
- 通过将8毫克 thioflavin t (thioflavin) 悬浮到10毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中, 准备一份库存溶液 (50x)。混合后, 通过0.22 µm 过滤器过滤溶液以去除微粒。
- 对于测量, 在1毫升分光光度计试管中添加20µL 的股票到1毫升 PBS。将稀释后的样品放入 spectrofluorimeter。
- 测量基线荧光发射使用425毫微米激发和扫描荧光发射从450-575 毫微米在2毫微米增量。
- 使用 425 nm 激发和 482 nm 发射进行时间推移扫描, 数据在六十年代每0.2 秒获得一次。
- 初始二十年代的时间推移扫描措施荧光在空白试管。在二十年代, 暂停扫描, 并添加10µL 过滤消毒上清到试管。通过反转混合试管, 然后再放回 spectrofluorimeter。
- 恢复基于时间的扫描, 获取数据的最后四十年代。
- 完成定时扫描后, 使用相同的设置进行最终的荧光发射频谱扫描, 如2.1.5.3 中详细说明。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
本文建立了一种简单的体外检测方法, 用于检测上清液菌感染的细胞中是否存在细胞毒素. 基本上, 细菌添加后, 从感染细胞中采集到的培养基为4小时, 细菌通过培养基上清液的过滤杀菌去除, 然后将无菌上清液添加到新的细胞群中。细胞被观察 21-24 小时在增加上清和细胞杀害以后被定量。
将铜绿假单胞菌添加到 PMVECs 的汇合层诱导细胞间空隙的形成。在体内, 间隙形成导致肺水肿和肺功能减退。在所描述的化验中, gap 的形成被用作筛选毒素释放到细胞培养的时间点上清液和 PA103 的充分潜伏期的存在表明, 在细胞单层中开始形成的缺口, 如所示图 1。ΔPcrV 细菌在这些孵化条件下不会诱发细胞间隙。一旦发现间隙, 就会收集上清, 过滤消毒, 然后加入天真的 PMVECs 来评估细胞毒性活动。PMVECs 在他们各自的上清液然后被安置在一个孵化器为 21-24 小时, 然后观察和被拍照。如图 2所示, 从 PMVECs 中采集到的清液中, 已感染了铜绿假单胞菌 PA103 含有细胞毒素, 在上清后增加了21小时的细胞死亡。相比之下, HBSS 培养基或假单胞菌ΔPcrV 株上清液治疗的控制细胞没有发现细胞死亡。应用免疫印迹分析表明, 淀粉样分子, 包括寡聚头和 Aβ, 是在感染时产生 PA103 菌株, 而 amyloids 是由ΔPcrV 菌株产生后 PMVECs 接种 (图 2)。amyloids 作为细胞毒素在这项试验中的作用已被证实的 immunodepletion amyloids 从上清之前, 除了培养细胞12。虽然这里没有显示, 使用 A11 抗淀粉样蛋白抗体和 T22 抗头寡聚物抗体 immunodepletion 细胞毒性上清液完全耗尽 PA103 感染后上清液产生的细胞毒活性 (Balczon et 等2017。12和 Balczon 等, 准备)。
研制了一种新颖、廉价、简便的细胞杀伤量化方法。对于这种检测, ImageJ 软件已被改编成允许直接测量缺乏细胞 (指示细胞杀死) 的微观领域中的区域。对该方法的可靠性进行了直接比较, 验证了其检测细胞杀伤的方法, 即细胞的 LDH 释放。如图 3所示, ImageJ 软件可用于将包含单元格的微观域的区域转换为白色, 而缺少单元格为黑色的区域。然后, 一个简单的比例的白色区域, 以黑色可以用来测量细胞杀戮。从细胞的汇合单层开始, 微观领域的所有区域都是白色的。然而, 在添加含有细胞毒素的上清液18小时后, 可以检测到单层中的间隙。没有细胞的培养皿的面积, 然后以线性方式增加, 直到 36 h 后, 细胞毒性上清。在测定 ldh 释放量时, 取得了相同的结果, 在添加了细胞毒性上清液后, 首次检测到18小时的 ldh 释放。乳酸脱氢酶释放然后以线性方式增加, 直到最大的细胞杀害被测量在36小时在增加上清以后。用ΔPcrV 接种细胞 (图 3) 或 HBSS 治疗的培养液中的上清液治疗细胞中的小细胞死亡量为36小时。
用细菌处理的细胞中释放的淀粉样蛋白可以通过测量荧光量来量化。amyloids 的结合导致分子构象转移和荧光强度的增加。对于这种检测, thioflavin T 被添加到试管和基线荧光测量。然后在添加少量整除的情况下停止荧光记录。然后将试管返回到 fluorimeter, 并记录了荧光发射的变化。如图 4所示, 从细胞中采集到的上清液中含有 PA103 菌株的铜绿假单胞菌, 其荧光量的增加表明了淀粉样蛋白。与此相反, PMVECs 接种ΔPcrV 菌株的清液缺乏 amyloids, 如没有增加荧光表示。
图1。铜绿假单胞菌inolculation 对 PMVEC 形态的影响.PMVECs 在(a)和四小时后, PA103 菌株的增加(B)后的汇合单胞菌。在感染细胞的细胞单层中可以清楚地看到缝隙。刻度条 = 100 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
图2。细胞毒性上清液分析.部分 [I]。控制和处理细胞的代表性图像。PMVECs 治疗21小时, 以 PA103 细菌(B)或应变ΔPcrV (C)接种细胞获得上清液。控制细胞也孵化21小时与 HBSS 缓冲(A)。刻度条 = 100 µm. 第 [II] 部分。从ΔPcrV (A)或 PA103 (B)感染 PMVECs 中收集的上清液的代表 immunoblots。用抗体对淀粉样蛋白 (A11) 或寡聚头 (T22) 进行了探针检测。我在 kDa。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。细胞杀伤的定量.(A)来自不同时间点的代表性显微镜场 (在上清液后的 h) 中, 其中含有和缺乏细胞的区域分别用 ImageJ 软件转换为白色或黑色。同时还显示了转换前的同一相位对比度图像。酒吧 = 100 µm. (B)采用标准 LDH 释放法和 ImageJ 法对细胞杀伤定量的比较。N = 4, **p < 0.05, ***p < 0.01。请单击此处查看此图的较大版本.
图4。代表荧光检测数据.含有 425 nm 的空白小试管, 然后用 482 nm 测定发射荧光。二十年代收集了背景荧光, 然后将 PA103 或ΔPcrV 接种的 PMVECs 上清液添加到小试管中。荧光发射被记录了40秒。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这里, 概述了简单的体外方法, 可以证明在感染时产生细胞毒性 amyloids 的生物。这些方法包括细胞培养毒性试验、免疫印迹法、定量的细胞杀死使用一种新的显微方法, 并具有约束力。对细胞毒性剂的分析表明, 它们是淀粉样蛋白 (图 2 和图 4), 并表现出朊病毒12的特征。在肺炎期间, 细胞毒性朊病毒分子的生成为肺炎幸存者在出院后观察到的高死亡率提供了潜在的解释。正在进行的实验正在测试这种可能性。
所有被描述的研究的关键事件是细胞毒上清的世代, 并且需要考虑两个重要变量。首先, 在概述的实验中, 大鼠 PMVECs 被用于感染步骤和细胞毒性试验。其他细胞类型是否可以用于细胞毒素的生产没有得到详细的调查, 有可能其他细胞可能会产生细胞毒上清液后, 不同菌株的铜绿假单胞菌治疗。如图所示, 细胞毒素是淀粉样蛋白的性质, 包括寡聚头和 Aβ。可能有合理的预期, 其他细胞类型, 表达头和/或β淀粉样蛋白可能会诱导产生细胞毒素后, 细菌接种, 虽然这种可能性仍有待检验。概述的程序可用于检查其他细胞类型是否可以诱导产生细胞毒性 amyloids 后, 不同的侮辱。
细胞毒性上清液生成的第二个重要变量是细菌治疗的持续时间。重要的是, PMVECs 的孵化过程必须被允许进行, 直到在单层中可以看到间隙。鉴定细胞单层中的间隙是指假单胞菌注入宿主细胞细胞质中的 exoenzymes, 并且 exoenzymes 活跃, 导致细胞边界的收缩 (图 1)。我们的经验是, 收缩细胞边界的时间点是一个可靠的指标, 毒素释放到上清。推测这两个事件是相关的, 因为其中一个细胞毒性 amyloids 被释放是寡聚头, 和中断的头活动导致微管的降解, 导致细胞形态的变化。在实验中, 处理时间少于诱导间隙形成所需的量, 检测出成熟的细胞毒性淀粉样蛋白。
本手稿所描述的细胞毒性试验简单可靠。细胞死亡可以很容易地观察到显微镜检查和量化直接从记录的显微图像。本文所描述的方法仅用于评估大鼠肺内皮细胞与铜绿假单胞菌感染后的毒素生产。这些程序似乎很可能易于适应, 以评估是否在感染其他肺炎引起的药物后产生细胞毒性 amyloids, 包括医院相关的细菌和细菌和病毒, 负责社区获得的肺炎类型。此外, 报告的程序只被用来检查细胞毒性淀粉样蛋白的产生, 在感染的干细胞。细胞培养是一种人工系统, 这里概述的程序最有可能被改编为评估细胞毒素在动物模型和人类患者肺部感染期间的生成。从受感染的动物或病人那里收集生物液体, 如支气管肺泡灌洗, 可用于在这里报告的同样类型的化验, 以评估是否在体内感染过程中产生细胞毒性 amyloids。显然, 在接种动物时, 细菌的潜伏期可能会有很大的不同, 支气管肺泡灌洗必须在多个时间点收集, 以确定治疗的最终期限。
应用免疫印迹分析表明, amyloids 存在于上清液, 包括寡聚头和 Aβ (图 3)。虽然应用免疫印迹程序是标准的, 但在启动应用免疫印迹分析之前必须执行一个关键步骤。具体地说, 在免疫印迹法之前, 上清液的浓度至少为十倍, 因为非浓缩清液中淀粉样蛋白的含量低于应用免疫印迹分析检测的极限。正如这里所报道的, 使用装有过滤器的管子的离心是这种浓缩步骤常用的方法, 但似乎合理的是, 其他方法, 如 TCA 沉淀, 对这一步骤同样有用。
使用图像进行细胞杀伤的定量是一个重要的进步。目前可用于量化细胞死亡的程序依赖于购买相当昂贵的试剂盒, 允许测量死细胞的 LDH 释放量。这里描述的化验不涉及成本, 因为 ImageJ 程序可以免费从 NIH 网站下载。简单的 ImageJ 程序的适应允许精确测量细胞的杀戮。但是, 值得指出的是, 在概述的协议的执行过程中遇到了几件小工件。主要的问题是细胞碎片, 如焦点接触区域, 可能与培养皿保持联系, 因为细胞死亡。这些残留的细胞碎片可以被相机检测到, 并给出一个人工的迹象, 表明细胞仍留在盘子上。因此, 很少有100% 细胞杀戮的价值是使用这个程序获得的。
报告的分析系统的缺点是毒素 amyloids 在准备从未被完全地定义了。因此, 定量是困难的。ELISA 测定可用于提供不同 amyloids 的总水平, 而不提供每种制剂中个别物种的详细信息。直到更精确的化验, 如质量规范或体外合成淀粉样寡聚物, 现在可以做的最好的是开始每个实验与相同数量的细胞, 孵化在同一时间内, 并验证细胞毒性的发生率与以前的制剂相同。任何既定规范的变化都带来了额外的不确定性。
总之, 简单的体外方法被概述, 以证明产生的毒性淀粉样分子的肺内皮细胞感染后, 肺炎引起的药物。这种化验方法是可靠的, 很有可能适用于其他生物体, 并可用于使用受感染动物和人类病人的生物液体。这些方法将有助于研究肺炎的长期后果, 并建立机制导致最终器官衰竭的病人出院后。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有报告。
Acknowledgments
这项研究由 NIH 授予 HL66299、RB、SL、HL60024 到 ts 和 HL136869 到 MF 的部分资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
