Summary
Простые методы описаны для демонстрации производство цитотоксических Амилоиды после инфицирования легочного эндотелия синегнойной палочки.
Abstract
Пациенты, которые выживают пневмонии имеют повышенный уровень смертности в течение нескольких месяцев после выписки из больницы. Предположили, что инфекция легочной ткани при пневмонии приводит в производстве долгоживущих цитотоксины, которые могут привести к последующей конец полиорганной недостаточности. Мы разработали в vitro анализов для проверки гипотезы, что цитотоксины производятся при легочной инфекции. Изолированные крыса легочного эндотелиальных клеток и бактерий синегнойной палочки используются как модель системы, и производство cytoxins, после инфицирования эндотелиальных клеток бактерий подтверждается с помощью клеточной культуры следуют прямые количественный, используя лактатдегидрогеназа анализов и Роман микроскопического метода ImageJ технологии. Амилоидоподобные характер этих цитотоксины был продемонстрирован Тиофлавин Т привязки анализов и immunoblotting и immunodepletion, с использованием антител анти амилоид A11. Дальнейший анализ с использованием immunoblotting продемонстрировал подготовлены и выпущенная эндотелиальных клеток после заражения P. aeruginosaолигомерных Тау и значения. Эти методы должны быть легко адаптирован для анализа человеческого клинических образцов.
Introduction
Пациенты, которые выживают пневмонии имеют повышенный уровень смертности в течение нескольких месяцев после больницы разряда1,2,3,4,5,6. В большинстве случаев смерти происходит некоторый тип конца полиорганной недостаточности, в том числе почек, легких, сердца, или печени события, а также ход5,6. Причиной повышенной смертности в этой популяции пациентов никогда не было установлено.
Пневмония классифицируется как приобретается либо сообщества или внутрибольничной (внутрибольничные) и агенты, которые могут вызвать пневмонию включают бактерии, вирусы, грибки и химических веществ. Одной из основных причин нозокомиальная пневмония является бактерия Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa – грамотрицательные организм, который использует систему секреции III тип для передачи различных эффекторных молекул, называемых exoenzymes, непосредственно к цитоплазме целевой ячейки7,8. Во время инфекции легочного эндотелиальных клеток exoenzymes цели различных внутриклеточных белков, включая эндотелиальной формы связанные микротрубочек белка Тау9,10,11,12 , приводит к пробою эндотелиальный барьер, что приводит к тяжелой отек легких, снижение легочной функции и, зачастую, смерть.
Как указывалось ранее, пациентов, которые выживают первоначальный пневмонии имеют повышенный уровень смертности в течение первых 12 месяцев после выписки из больницы. Потенциальным механизмом для объяснения этого явления является, что некоторый тип долгоживущих токсин генерируется во время первичной инфекции, что приводит к плохой долгосрочный результат. Два замечания поддерживают эту возможность. Во-первых, культивированный легочного эндотелиальных клеток, которые первоначально лечатся P. aeruginosa не размножаться на срок до недели после того, как бактерии погибают от антибиотиков13. Во-вторых, long-lived прионов и агентов с характеристиками прионных было продемонстрировано в различных заболеваний человека и животных, особенно заболеваний, связанных с нервной системы14,15.
Никогда не были описаны методы для изучения потенциального производства долгоживущих цитотоксических агентов во время легочной инфекции. Здесь изложены ряд простых в vitro анализов, может использоваться для изучения cytotoxin производства и деятельности после инфекции с помощью общей причиной пневмонии агента, P. aeruginosa. Эти анализы должны быть легко адаптируемыми расследовать возможные cytotoxin индукции после инфекции с использованием других агентов, которые вызывают пневмонию и supernatants, которые создаются также должно быть полезным для изучения эффектов цитотоксины в целом органов или животных. Наконец анализов, которые описаны здесь скорее будет адаптироваться для тестирования животных и человеческих биологических жидкостях для производства цитотоксины при пневмонии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные процедуры были рассмотрены и одобрены организационного и животных уход комитета университета Южной Алабамы и были выполнены в соответствии с все федеральные, государственные и местные правила. Основных культур крыса легочной микрососудистой эндотелиальных клеток (PMVECs) были получены из Фонда основной культуры клеток в центре университета Южной Алабамы для легких биологии. Клетки были подготовлены с использованием ранее описанные процедуры16.
1. поколение цитотоксических Supernatants
Примечание: Здесь, мы используем два различных штаммов P. aeruginosa: PA103, который имеет нетронутыми типа III секреторной системы, способной передачи exoenzymes ExoU и экзот клетки-мишени во время инфекции и ∆PcrV, которых не хватает типа III секреторной системы и неспособным передачи exoenzymes в клетки-мишени после прививки.
- Полоса бактерий на пластины агар Фогеля-Боннер (VB)17 и расти на ночь при 37 ° C.
- Подготовить пластины, сделать следующие Стоковый раствор (Фогель-Боннер соли; 10 x фондовой): измерения 2 g MgSO4, 20 г лимонной кислоты (свободной кислоты), 100 g K2PO4и 35 g NaH2PO4. Добавьте ddH2O 1 Л и автоклав для 15 мин с медленным выхлопных газов.
- Место 7.5 g агар в 450 мл ddH2O и автоклаве выше.
- После автоклавирования место оба решения в ванну воды 50 ° C для охлаждения.
- Добавьте 50 мл раствора 10 x VB запасов соли в агар.
- Добавить carbenicillin в 400 мкг/мл (для штаммов P. aeruginosa используется) и смешайте хорошо закрученного колбу.
- Место 5 мл раствора агар VB в индивидуальной стерильной культуры блюда, позволяют агар затвердеть, и затем хранить при 4 ° C до дня бактериального посева.
- В день Бактериальный посев, предварительно теплой тарелку до 37 ° C и затем полоса бактерий на пластину с помощью стерильных цикла. Место пластину в инкубаторе 37 ° C ночь.
- Проверить чистоту PMVEC, положительный пятнать с флуоресцентной Griffonia simplicifolia лектины и негативные окрашивание с флуоресцентных виноградная Лектин (маркер для артериальной эндотелиальных клеток). Аликвота клетки и замораживание в жидком азоте.
- Для экспериментов поддерживать клетки в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) дополнены плода бычьим сывороточным 10% и рост клеток в инкубаторе 37 ° C, содержащих 5% CO2. Использование ячейки на проходы 5-15.
- Для поколения цитотоксических supernatants пластина 2 х 106 клеток в отдельных 150 см блюда и расти на 3-4 дня до впадения достигается. Использование двух пластин за эксперимент (см. ниже).
- Для анализа цитотоксических supernatants пластина 1 x 105 клетки в индивидуальные добра 6-хорошо блюдо и растут в течение четырех дней, пока не будет достигнуто слияния.
- Производить супернатанта, один из двух 150 см блюд PMVECs из шага 1.3.1 с фосфат амортизированное saline мыть, trypsinize и затем подсчитать количество ячеек (мы использовать счетчик автоматизированных клеток и следовать протокол изготовителя; см. Таблицу материалы). Вымойте другое блюдо PMVECs с Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS) и затем заразить любой штамм P. aeruginosa на разносторонности инфекции (МВД) 20:1. Это достигается следующим образом:
- Для P. aeruginosa, OD540 0,25 = 2 x 108 CFUs/мл. Подготовить этот растворения, добавьте 1 мл HBSS одноразовых кювет 1 мл. Скрип достаточно бактерии прочь пластину, который был подготовлен на этапе 1.1 до од540 0.25 достигается при измерении с помощью спектрофотометра. Следующий шаг будет предоставлять расчет сколько потребуется бактерий.
- После того, как определяется количество PMVECs в культуре блюдо (шаг 1.4 выше), определить соответствующее количество бактерий для добавления второй, не trypsinized культуры блюдо, содержащие PMVECs. Например если выясняется, что культуры блюдо PMVECs содержит 1.3 x 107 ячеек, а затем подготовить 1.3 x 107 клеток x 20 бактерии/клеток x 1 мл/2 x 108 CFUs = 1,3 мл бактерий.
- Развести по 1,3 мл бактерий в HBSS окончательный объемом 20 мл, так что всю поверхность 150 см блюдо может быть покрыта жидкостью, а затем добавьте разбавленные бактерий пластины PMVECs.
- Инкубируйте прививанным с бактериями при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора для 4-5 ч, до тех пор, пока пробелы можно увидеть формирование в монослое клеток, когда плита наблюдается микроскопически PMVECs (см. Рисунок 1 для надлежащего уровня разрыв формирования).
- Собирать супернатанта, а затем центрифуги для 10 мин на 2000 x g в настольная центрифуга для удаления сотовой мусора.
Примечание: Любые столешницы центрифуги, способных генерирования достаточных g силу Пелле unlysed клеток и крупноклеточный фрагменты могут быть использованы для этого шага. - Залейте супернатант в шприц, 0,2 мкм фильтром прилагается к своему концу, затем пройти супернатант через фильтр, чтобы удалить бактерии.
- Используйте Алиготе стерильных супернатант для тестирования цитотоксичности (см. 2.1) и заморозить остальные супернатант в-80 ° C для использования в будущем.
2. анализ цитотоксических Supernatants
- Цитотоксичность Assay
- Расти PMVECs в 6-ну блюд до слияния. Уэллс мыть раз с HBSS, затем добавить 1,5 мл фильтр стерилизации супернатант (собранные от любой прививки PA103 или ∆PcrV клеток) отдельных скважин. Добавьте стерильные HBSS другой хорошо как отрицательный контроль.
- Место пластину в CO2 инкубатора для 21-24 ч, а затем наблюдать за убийство/цитотоксичность клеток (см. следующий шаг). Использование supernatants, которые проявляют цитотоксичности для дальнейших экспериментов и отбросить те, которые не показывают ячейки убийства.
- Количественный клетки убийства
- Мера Лактатдегидрогеназа (LDH) освобождение от мертвых клеток, используя имеющиеся наборы Assay ЛДГ и производителя рекомендованных процедур.
- Кроме того подсчитать ячейки убийство микроскопически использованием ImageJ программного обеспечения. Для этого, запись микроскопических изображений и областей культуры блюдо, содержащие нетронутым клеток, а затем подсчитать регионах отсутствуют клетки (индикативный гибели клеток в монослое) используя пользовательский макрос ImageJ (национальные институты здравоохранения) (см. дополнительного кодирования файла ). При желании, провести макро шаги вручную следующим образом:
- Ввод изображений (формат RGB или Tiff) в макрос и отрегулировать контрастность до 15% насыщенных пикселей. Дублировать отрегулировать контрастность изображений и выполнить команду «вычитание фона» для получения высокой контрастности изображения района клеток и разрыв в поле зрения.
- Вычитание этого изображения из исходного изображения и объединить полученное изображение с исходным изображением с помощью калькулятора изображения функция «И». Преобразовать полученный образ черный (пробелы) и белый (клетки) маска с функцией порог (минимум 0, максимум 5) и используйте функцию «двоичный подорвать» для удаления шума из образа.
- Измерьте отношение чёрно-белых пикселей внутри результирующего изображения с помощью «области фракция» измерения. Сюжет и выразить дробных областей для каждой точки время лечения как процент максимального пробела района.
- Рассчитать средства и сравнить с помощью односторонний дисперсионный анализ с Тьюки в post hoc теста, значениями p меньше чем 0,05 считается существенным.
- Использование анализа immunoblot установить присутствие амилоида, олигомерных Тау и значения в supernatants культуры. Выполните анализ immunoblot с помощью стандартных процедур10,11,12, за исключением концентрации supernatants культуры по крайней мере 10 раз до электрофореза.
- Концентрацию супернатанта, место 1-2 мл супернатант в блок фильтра центрифугирования, чьи мембрана имеет молекулярный вес производства 10 кДа. Затем поместите фильтр в столешнице центрифуги и центрифуги на 2000 x g до тех пор, пока требуемая степень концентрации достигнута (обычно 45-60 мин).
- Определить количество белка в концентрированной супернатанта11 и загрузить равное количество образцов в индивидуальные добра геля.
- Запустите гели, передачи белков на нитроцеллюлозные, затем зонд кляксы с A11 анти амилоид антитела, антитела анти олигомерных Тау T22 или антитела анти значения MOAB2 следуют соответствующие вторичные антитела. Разработка помарки, используя стандартные хемилюминесценции процедур.
- Чтобы сделать Тиофлавин Т Assay, используйте Тиофлавин Т флуоресцирования (ThT) для количественного определения Амилоиды в supernatants. Для этих измерений используйте фильтр стерилизации supernatants.
- Подготовьте Стоковый раствор (50 x) Тиофлавин Т, приостановив Тиофлавин Т (ThT) 8 мг в 10 мл фосфатный буфер (PBS). После смешивания, фильтр решение через 0,22 мкм фильтр для удаления твердых частиц.
- Для измерений добавьте 20 мкл акций ThT 1 мл PBS в кювет спектрофотометр 1 мл. Поместите разреженных образца в Спектрофлуориметр.
- Измерьте базовые флуоресценции выбросов с использованием 425 Нм возбуждения и сканирование флуоресценции выбросов от 450-575 Нм приращением 2 Нм.
- Выполнить проверку промежуток времени, используя 425 Нм возбуждения и 482 выбросов Нм, с данными приобрела каждые 0,2 s 60 s.
- Первоначальный 20 s промежуток времени сканирования меры флуоресценции в пустой кюветы. 20 s, приостановить проверку и 10 мкл фильтр стерилизации супернатант в кювет. Смешать кювета, инверсии, а затем поместить обратно в Спектрофлуориметр.
- Возобновить на основе времени сканирования, приобретать окончательный 40 s данных.
- После завершения сканирования, покадровой выполните сканирование спектра излучения заключительном флуоресцирования используя идентичные параметры, как подробно указано в 2.1.5.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Простой в vitro пробирного был разработан для анализа на наличие цитотоксины в supernatants клетки, инфицированных бактериями P. aeruginosa. В основном питательной среды от инфицированных клеток собирается 4 h после бактериальной сложения, бактерии удаляются стерилизация фильтра супернатанта культуры, и затем стерильной супернатант добавляется к новой популяции клеток. Клетки затем наблюдаются 21-24 часа после нанесения супернатант и количественно клетки убийства.
Добавление P. aeruginosa вырожденная слои PMVECs индуцирует образование зазоров между ячейками. В естественных условиях, разрыв формирования приводит к отек легких и снижение легочной функции. В описанных assay разрыв формирования используется как момент времени для скрининга для выпуска cytotoxin в supernatants культуры клеток и достаточной продолжительности инкубации с PA103 указывается наличие пробелов, которые начинают формироваться в монослое клеток, как показано в Рисунок 1. ΔPcrV бактерии не вызывать клетки пробелы в этих условиях инкубации. Когда обнаруживаются пробелы, супернатанта является сбор, фильтр стерилизации и затем добавляется наивно PMVECs оценить цитотоксической активности. PMVECs в их соответствующих supernatants затем помещены в инкубатор для 21-24 часа и затем наблюдается и сфотографировали. Как показано на рисунке 2, супернатанта, собранных из PMVECs, которые были заражены штамм P. aeruginosa PA103 содержал цитотоксины, которые индуцированных 21 h смерть культивируемых клеток после добавления супернатант. В противоположность этому не смерть клетки наблюдалось в управления клетках, обработанных с либо HBSS среднего или супернатанта, собранных из штамма ΔPcrV Pseudomonas. Иммуноблот анализ показал, что амилоида молекулы, в том числе олигомерных Тау и значения, генерируются во время инфекции с PA103 деформации, в то время как не Амилоиды генерируются ΔPcrV деформации, после прививки PMVECs (рис. 2). Immunodepletion Амилоиды от супернатант перед добавлением культивируемых клеток12была подтверждена роль Амилоиды как цитотоксины в этот assay. Хотя здесь не показан, immunodepletion цитотоксических супернатанта, полностью используя антитела анти амилоид A11 и антитела анти Тау олигомера T22 истощает цитотоксическую активность от supernatants, производится после PA103 инфекция (Balczon et al. 2017 12 и Balczon et al., в рамках подготовки).
Роман, недорогой и простой метод количественной оценки клетки убийства был разработан. Для этот assay ImageJ программного обеспечения была адаптирована для разрешить прямое измерение областей в микроскопическом поле, которые не имеют клетки (индикативный клетки убийства). Прямое сравнение метода устоявшихся Преобразовательдавлениясизмерительнойячейкой убийства, которая ЛДГ релиз от клеток была проверена надежность этого метода. Как показано на рисунке 3, ImageJ программное обеспечение может использоваться для преобразования регионов микроскопических поля, которые содержат ячейки белого и регионы, которые не имеют клетки черный. Затем простой соотношение белых областей черный может использоваться для измерения клетки убийства. Когда начиная с вырожденная монослое клеток, все регионы микроскопическом поле белый. Однако в 18 ч после добавлением supernatants, содержащих цитотоксины, быть обнаружены пробелы в монослое. Количество области культуры блюдо лишенный клетки, затем увеличивается линейно до 36 ч после добавления цитотоксических супернатант. При измерении выпуска ЛДГ, идентичные результаты были получены, с выпуском ЛДГ, впервые обнаружено в 18 ч после нанесения цитотоксических супернатант. LDH релиз затем увеличивается линейно до тех пор, пока максимальное клетки убийства была измерена на 36 ч после добавления супернатант. Маленькая смерть клетки была измерена в клетках, обработанных с супернатанта, собранных от прививки ΔPcrV клеток (рис. 3) или в культурах, получавших HBSS за 36 ч.
Количество амилоид выпустили из клетки, относились с бактерий может быть определена количественно измеряя ThT флуоресценции. Связывание Амилоиды ThT вызывает конформационные изменения в молекуле и увеличения интенсивности флуоресценции. Этот assay Тиофлавин Т добавляется в кювет и базовых флуоресценции измеряется. Флуоресценции запись затем остановлена, в то время как небольшой Алиготе образец добавляется. Кювета затем возвращается к fluorimeter и изменения записал флуоресценции выбросов. Как показано на рисунке 4, супернатанта собраны из клеток, которые инкубировали с PA103 штамм P. aeruginosa содержится амилоид как отмечается увеличение выбросов флуоресценции. В отличие от этого супернатанта от PMVECs, привиты с ΔPcrV штамм не хватало Амилоиды, как указано на отсутствие увеличения флуоресценции.
Рисунок 1. Эффекты P. aeruginosa inolculation на словотолковании PMVEC. Вырожденная монослоя PMVECs до (A) и четыре часа после нанесения (B) PA103 штамм P. aeruginosa. Пробелы можно ясно увидеть в монослое клеток в инфицированных клетках. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Анализ цитотоксических supernatants. Часть [I]. Представитель изображения контроля и обработанные клетки. PMVECs для 21 h лечили супернатанта, полученные из клеток, привиты с PA103 бактерий (B) или штамм ΔPcrV (C). Также контроль клетки инкубировали для 21 h с HBSS буфера (A). Шкалы бар = 100 µm. часть [II]. Представитель иммуноблотов supernatants собраны из ΔPcrV (A) или PA103 (B) инфицированы PMVECs. Кляксы были зондируемой с антителами против амилоида (A11) или олигомерные Тау (T22). Mr в кДа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Количественный клетки убийства. (A) представитель Микроскоп поля из различных временных точек (в h после добавления супернатант) в каких регионах поля содержащие и не хватает клетки были преобразованы либо белый или черный, соответственно, с помощью ImageJ программного обеспечения. То же фазы контраст изображение до преобразования также показано. Бар = 100 µm. (B) сравнение количественный убийство с использованием стандартного анализа выпуска ЛДГ и ImageJ assay клетки. N = 4, **p < 0,05, ***p < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Представитель ThT флуоресценции пробирного данных. Пустой кюветы, содержащие ThT были рады на 425 Нм, а затем выбросов флуоресценции была измерена на 482 Нм. Фон флуоресценции была собрана для 20 s, а затем супернатант от либо PA103 - или ΔPcrV прививку PMVECs был добавлен в кюветы. Флуоресценции выбросов был затем записан для 40 сек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь просто в vitro методы изложены которые позволяют демонстрация поколения цитотоксических Амилоиды во время инфекции с пневмонией, вызывая организма. Эти методы включают в себя assay цитотоксичности клетки культуры, immunoblotting, количественный ячейки, убийство с использованием Роман микроскопическим методом и ThT привязки. Анализ цитотоксических агентов продемонстрировали, что они амилоида в природе (рис. 2 и рис. 4) и обладают характеристиками, прионы12. Поколение цитотоксических прионных молекул при пневмонии предоставляет потенциальным объяснение для повышенной смертности наблюдается в пневмонии выживших после их выписки из больницы. Эксперименты в ходе тестирования этой возможности.
Ключевым событием для всех описанных исследований это поколение цитотоксических супернатанта, и две важные переменные должны быть рассмотрены. Во-первых изложенные экспериментах крыс PMVECs были использованы для этапа инфекции и для анализа цитотоксичности. Ли другие типы клеток могут быть использованы для производства цитотоксины не изучался в деталях, и вполне возможно, что другие клетки могут быть способны генерировать цитотоксических supernatants, после лечения с различных штаммов P. aeruginosa. Как показано, цитотоксины амилоида в природе и включают в себя олигомерных Тау и значения. Было бы разумно ожидать, что другие типы клеток, которые выражают Тау или бета амилоида белка может быть привлечен к генерировать цитотоксины, после Бактериальная вакцинация, хотя эта возможность остается быть проверены. Изложил процедуры могут использоваться для изучения ли другие типы клеток может быть наведено производить цитотоксических Амилоиды после различные оскорбления.
Второй важной переменной в поколение цитотоксических supernatants является продолжительность лечения с бактериями. Важно, что при инкубации PMVECs разрешено прогресса до тех пор, пока пробелы можно увидеть в монослое. Выявление пробелов в монослое клеток является указание exoenzymes вводили бактериями Pseudomonas в цитоплазму клетки хост и exoenzymes активны, результате втягивания границ ячеек (рис. 1). Наш опыт является надежным показателем выпуска cytotoxin в надосадке время точкой опровержение границ ячеек. Это соблазн предположить, что эти два события связаны как один из цитотоксических Амилоиды освободили олигомерных Тау, и нарушение деятельности Тау приводит деполимеризацию микротрубочек, которая способствует изменения формы клеток. В экспериментах, где лечения были меньше, чем количество времени, необходимого для вызвать разрыв формирования было обнаружено мало зрелые Цитотоксические амилоида.
Анализа цитотоксичности, описанные в этой рукописи, простой и надежный. Смерть клетки может быть легко наблюдается при микроскопическом исследовании и количественно непосредственно из записанных микроскопических изображений. Методы, которые описаны здесь были использованы исключительно для оценки cytotoxin производства после инфицирования крыса легочного эндотелиальных клеток с P. aeruginosa. Представляется вероятным, что процедуры может быть легко адаптирована для оценки ли цитотоксических Амилоиды производятся после инфекции с другими пневмонии, вызывая агентов, включая как связанные нозокомиальных бактерий и бактерии и вирусы, ответственных за типы внебольничной пневмонии. Кроме того сообщил процедуры использовались только для изучения цитотоксических амилоида поколения во время инфекции культивируемых клеток. Культура клеток является искусственные системы, и процедуры, изложенные здесь скорее могут быть адаптированы для оценки поколение цитотоксины во время легочной инфекции как Животные модели, так и человека пациентов. Сбор биологических жидкостей, таких как Бронхоальвеолярный лаваж, больных или зараженных животных могут использоваться в те же виды анализов, сообщили здесь оценить ли цитотоксических Амилоиды генерируются во время инфекции процессов в естественных условиях. Очевидно Длительность инкубации с бактерий может быть совершенно разные, когда прививки в животных, и Бронхоальвеолярный лаваж должны быть собраны в несколько раз точке для определения конечной продолжительность лечения.
Иммуноблот анализы показали, что Амилоиды присутствуют в supernatants, включая олигомерных Тау и Aβ (рис. 3). Хотя процедуры immunoblot являются стандартными, есть ключевой шаг, который должны быть выполнены до начала анализа immunoblot. В частности важно что supernatants сосредоточены по крайней мере десять раз до immunoblotting как амилоида в ООН концентрированной супернатант сумма ниже предела обнаружения, immunoblot анализа. Как сообщили здесь, центрифугирование с помощью трубки с фильтром является метод обычно используется для этого шага концентрации, но кажется разумным, что другие методы, такие как TCA осадков, будет столь же полезным для этого шага.
Количественный ячейки, убийство с использованием изображений представляет собой важный шаг вперед. В настоящее время имеющиеся процедуры для количественной оценки смерть клетки полагаются на покупку довольно дорогим комплекты, которые позволяют измерения ЛДГ освобождения от мертвых клеток. Assay, описанные здесь не предполагает затрат как ImageJ программы бесплатно скачать с сайта NIH. Простая адаптация ImageJ программ позволяет довольно точное измерение клетки убийства. Однако это стоит отметить, что пару мелких артефактов встречаются во время исполнения намеченных протокола. Основная проблема заключается, что фрагменты клеток, таких как области фокуса контакта, может оставаться связанные с культуры блюдо как клетки умирают. Эти фрагменты остаточного клеток могут быть обнаружены на камеру и дают искусственные признаки того, что клетки остаются на блюдо. Таким образом это редкий, что значение 100% клеток убийства получается с помощью этой процедуры.
Слабость системы сообщил пробирного является, что Амилоиды cytotoxin в подготовке никогда не были полностью определены. Таким образом количественный трудно. ELISA assays может использоваться для предоставления всего уровней различных Амилоиды, не предоставляя любую подробную информацию об отдельных видов в каждом подготовки. До более точных анализов таких, как масса спецификации или в пробирке синтезированных амилоида олигомеров, могут быть разработаны, лучшее, что можно сделать в настоящее время является начало каждого эксперимента с тем же числом ячеек, инкубировать на тот же срок и убедитесь, что цитотоксичность происходит по тем же ставкам, как предыдущий препараты, которые были использованы. Отклонение от любого из устоявшихся норм вводит дополнительные неясности.
В резюме простой в vitro методы описаны для демонстрации производства токсичных амилоида молекул, легочного эндотелиальных клеток, после инфекции с агентом, вызывая пневмонию. Надежны и вероятно могут быть адаптированы для других организмов и использования, используя биологические жидкости, полученных из зараженных животных и человека пациентов. Эти методы будут полезны для исследования, изучения долгосрочных последствий пневмонии и для создания механизмов, ведущих к конце полиорганной недостаточности у больных после выписки из больницы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один доклад.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось в частях NIH грантов HL66299 TS, RB и SL, HL60024 в TS и HL136869 для MF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
