Summary
Basit yöntem pulmoner endotel enfeksiyonu takip sitotoksik amyloids üretimini gösteren için Pseudomonas aeruginosatarafından açıklanmıştır.
Abstract
Pnömoni hayatta hastaların hastane deşarj izleyen ay içinde ölüm oranları yüksek sahip. Pnömoni sırasında akciğer doku enfeksiyonu sonraki uç organ yetmezliği yol açabilir uzun ömürlü Sitotoksin üretiminde sonuçları olan. Sitotoksin akciğer enfeksiyonu sırasında üretilen hipotezi test etmek vitro deneyleri geliştirdik. İzole sıçan pulmoner endotel hücreleri ve bakteri Pseudomonas aeruginosa model sistemleri olarak kullanılır ve endotel hücreleri enfeksiyon bakteri tarafından takip cytoxins üretim ve ardından hücre kültürü kullanarak gösterilmiştir doğrudan Nefelometri laktat dehidrogenaz deneyleri ve bir roman mikroskobik yöntemi kullanmak ImageJ teknoloji kullanarak. Bu Sitotoksin amiloid doğası thioflavin T bağlama deneyleri ve immunoblotting ve A11 Anti-amiloid antikor kullanarak immunodepletion tarafından sunuldu. İmmunoblotting kullanarak daha fazla analizleri oligomeric tau ve Aβ üretilen ve endotel hücreleri enfeksiyon P. aeruginosatarafından takip tarafından yayımlanan olduğunu gösterdi. Bu yöntemler için insan klinik örneklerin analizleri kolayca adapte olmalıdır.
Introduction
Pnömoni hayatta hastaların hastane deşarj1,izleyen ay içinde ölüm oranları yüksek2,3,4,5,6. Çoğu durumda, ölüm de dahil olmak üzere böbrek, akciğer, kalp, uç-organ yetmezliği veya karaciğer olaylar yanı sıra inme5,6çeşit tarafından oluşur. Bu hasta popülasyonda yüksek ölüm oranı nedenini asla kurmuştur.
Zatürre de topluluk-elde olarak sınıflandırılır veya hastane edinilen (nozokomiyal) ve zatürre neden olabilir ajanlar bakteri, virüs, mantar ve kimyasallar içerir. Bakteri Pseudomonas aeruginosanozokomiyal pnömoni önemli nedenlerinden biridir. P. aeruginosa doğrudan hedef hücreleri7,8sitoplazma için ekzoenzimlerden olarak adlandırdığı çeşitli efektör moleküllerin aktarmak için bir tür III salgı sistemi kullanır Ayagin Gram-negatif bir organizmadır. Pulmoner endotel hücreleri enfeksiyon sırasında ekzoenzimlerden endotel bir formu Mikrotubul ilişkili protein tau9,10,11,12 de dahil olmak üzere çeşitli hücre içi proteinlerin hedef. , ağır pulmoner ödemi kaynaklanan endotel bariyer arıza lider, pulmoner fonksiyon ve oftentimes, ölüm düşmüştür.
Daha önce belirtildiği gibi ilk pnömoni hayatta hastaların hastane deşarj takip ilk 12 ay içinde ölüm oranları yüksek sahip. Bu fenomeni açıklamak için bir potansiyel uzun ömürlü toksin bazı tip zavallı uzun vadeli sonuca yol açar ilk enfeksiyon sırasında oluşturulan bir mekanizmadır. İki gözlem bu olasılığı destekler. Bakterilerin antibiyotik13tarafından öldürdükten sonra bir hafta için çoğalırlar başlangıçta P. aeruginosa ile kabul edilen ilk, kültürlü pulmoner endotel hücreleri başarısız. İkincisi, uzun ömürlü prionlar ve aracıları prion özelliklere sahip çeşitli insan ve hayvan hastalıklarında, özellikle sinir sistemi14,15ile ilişkili hastalıklar gösterdi.
Uzun ömürlü sitotoksik ajanlar potansiyel üretim akciğer enfeksiyonu sırasında İnceleme yöntemleri hiç tarif edilmistir. Burada özetlenen basit vitro deneyleri bir dizi kullanılabilir Sitotoksin üretim ve enfeksiyon bir ortak zatürre neden Ajan, P. aeruginosakullanarak aşağıdaki etkinlik araştırma için. Bu deneyleri enfeksiyon zatürre neden diğer aracıları kullanarak aşağıdaki olası Sitotoksin indüksiyon araştırmak için kolayca adapte olmalı ve üretilen supernatants-meli da var olmak tamamen Sitotoksin etkilerini araştıran için yararlı organ ya da hayvan. Son olarak, büyük olasılıkla burada özetlenen deneyleri hayvan ve insan biyolojik sıvıları Sitotoksin üretimi sırasında zatürree için test etmek için adapte olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan yordamları incelendi ve kurumsal ve hayvan bakımı Komitesi South Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmış ve tüm federal, eyalet ve yerel düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. Sıçan pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri (PMVECs) birincil kültürleri akciğer biyoloji için University of South Alabama'nın merkezi hücre kültür çekirdek tesisinden elde edilmiştir. Hücre yukarıda açıklanan yordamları16kullanılarak hazırlanmıştır.
1. nesil sitotoksik Supernatants
Not: Burada, P. aeruginosaiki farklı soyu kullanırız: ekzoenzimlerden ExoU ve ExoT enfeksiyon ve ∆PcrV, bir tür III salgı sistemi yoksun ve sırasında hedef hücrelere aktarma yetenekli bir bozulmamış türü III salgı sistemi olan PA103 ekzoenzimlerden aşı takip hedef hücrelere aktarma aciz.
- Bakteri Vogel-Bonner (VB) ağar kaplamalar17 üzerine çizgi ve 37 ° C'de gecede büyümek
- Tabak hazırlamak için aşağıdaki hisse senedi çözüm (Vogel-Bonner tuzları; 10 x hisse senedi) olun: ölçmek 2 g MgSO4, 20 g sitrik asit (ücretsiz), 100 g K2PO4ve 35 g NaH2PO4. GKD2O 1 L ve basınçlı kap 15dk yavaş egzoz ile için ekleyin.
- 450 mL GKD2O 7.5 g agar ve yukarıdaki gibi basınçlı kap koyun.
- Isıyla her iki çözüm de soğutmak için 50 ° C su banyosu yerleştirin.
- 10 x VB hisse senedi tuz solüsyonu 50 mL agar için ekleyin.
- Carbenicillin 400 µg/ml (için kullanılan P. aeruginosa suşlarının) ve de şişeye dönen tarafından karıştırın.
- Bireysel steril kültür yemekleri, VB agar çözümde yer 5 mL agar kuvvetlendirmek ve 4 ° C'de bakteriyel tohum güne kadar saklamak izin verir.
- Bakteriyel tohum gün, önceden bir tabak 37 ° c sıcak ve bakteri steril bir döngü kullanarak plaka üzerine çizgi. Yer 37 ° C kuluçka plaka bir gecede.
- Pozitif floresan griffona simplicifolia ile boyama tarafından PMVEC saflık doğrulayın lektin ve floresan ile negatif boyama Helix pomatia lektin (arteriyel endotelyal hücreler için bir işaretleyici). Aliquot hücreleri ve sıvı azot dondurucuda.
- Deneyler için hücreleri içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum ile desteklenmiş DMEM) korumak ve hücreleri içeren % 5 CO237 ° C kuluçka büyür. Hücreleri pasajlar 5-15 kullanın.
- Sitotoksik supernatants nesil, 2 x 106 hücreler bireysel 150 cm yemekleri plaka ve 3-4 gün için izdiham elde kadar büyür. Deney (aşağıya bakın) başına iki tabak kullanın.
- Sitotoksik supernatants çözümlenmesi için plaka 1 x 105 6-iyi bireysel kuyu hücrelere çanağı ve dört gün izdiham elde kadar büyür.
- Süpernatant üretmek için bir PMVECs iki 150 cm yemekleri adım 1.3.1 fosfat tamponlu tuz ile yıkama, trypsinize ve sonra hücreleri saymak (Biz bir otomatik hücre sayacını kullanın ve üreticinin iletişim kuralı izleyin; Tablo reçetesibakın). PMVECs ile Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) diğer bulaşık yıkama ve P. aeruginosa enfeksiyon (MOI) 20:1 çokluğu, ya suşu ile enfekte. Bu şekilde elde edilir:
- P. aeruginosaiçin OD540 0.25 = 2 x 108 CFUs/mL. Bu seyreltme hazırlamak için 1 mL tek kullanımlık küvet 1 mL HBSS ekleyin. Yeterince bakteri 0,25 OD540 bir spektrofotometre kullanarak ölçülen zaman elde edilir kadar 1.1 adımda hazırlanan tabak kapalı kazımak. Bir sonraki adım ne kadar bakteri gerekli olacak bir hesaplama sağlar.
- PMVECs kültür tabağına sayısı belirlendikten sonra (1.4 yukarıdaki adım), bakteri PMVECs içeren ikinci, Sigara trypsinized kültür yemek için eklenecek uygun sayısını belirleyin. Örneğin, PMVECs kültür tabak 1.3 x 107 hücreleri içeren, sonra 1.3 x 107 hücreleri x 20 bakteri/hücre x 1 mL/2 x 108 CFUs hazırlamak belirlediyseniz 1.3 mL bakteri =.
- 150 cm çanak tüm yüzeyine sıvıyla kaplı, sonra seyreltilmiş bakteri PMVECs plakasına eklemek bakterilerin 1.3 mL HBSS 20 mL, son bir birime oranında seyreltin.
- Kuluçkaya boşluklar plaka olarak gözlenen hücre monolayer şekillendirme görülebilir kadar % 5 CO2 kuluçka için 4-5 h, 37 ° C'de bakteri ile aşılanmış PMVECs (bkz: Şekil 1 uygun düzeyde boşluk oluşumu için).
- Süpernatant toplamak sonra hücresel enkaz kaldırmak için masa üstü bir santrifüj 2.000 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi.
Not: Herhangi bir masa üstü santrifüj üreten yeterli G'lik zorla unlysed hücreleri ve büyük hücreli parçaları-ebilmek var olmak kullanılmış için bu adımı cips için. - Süpernatant süpernatant bakteri kaldırmak için filtreden geçmek sonuna, sonra bağlı 0.2 µm filtresi olan bir şırınga içine dökün.
- Bir aliquot, steril süpernatant sitotoksisite sınamak için kullanın (bkz. 2.1) ve kalanı süpernatant ileride kullanmak üzere-80 ° C'de dondurmak.
2. sitotoksik Supernatants Analizi
- Sitotoksisite tahlil
- 6-iyi yemekler PMVECs izdiham kadar büyür. Yıkama wells bir kez HBSS ile daha sonra 1,5 mL (ya PA103 ya da ∆PcrV aşısını hücrelerden toplanan) filtre sterilize süpernatant bireysel wells için ekleyin. Steril HBSS başka bir şey için bir negatif kontrol ekleyin.
- 21-24 h CO2 kuluçka plaka yerleştirin, sonra hücre öldürme/sitotoksisite için gözlemlemek (sonraki adıma bakın). Sitotoksisite daha fazla deneme için sergi supernatants kullanın ve bu da hücre öldürme gösterme atın.
- Hücre öldürme Nefelometri
- Ölçü laktat dehidrogenaz (karaciğer) serbest piyasada bulunan karaciğer tahlil kitleri ve üretici kullanarak ölü hücrelerden yordamlar önerilir.
- Alternatif olarak, hücre öldürme mikroskobik ImageJ yazılımını kullanarak ölçmek. Bunun için kayıt mikroskobik görüntüleri ve sağlam hücreleri içeren kültür yemek alanları, sonra hücreler (hücre ölümü bir monolayer gösterge) eksik bölgelerin ölçmek özel bir ImageJ (Ulusal Sağlık Enstitüleri) makro (bkz: ek kodlama dosya kullanarak ). İsterseniz, el ile aşağıdaki gibi makro adımları izleyin:
- Görüntüleri (RGB veya TIFF biçiminde) makro girdi ve doymuş % 15 piksel için karşıtlığı ayarlayın. Kontrast-düzeltilir görüntüleri çoğaltın ve hücre ve gap alanı görüş alanı içinde yüksek karşıtlık görüntüsünü elde etmek için "arka plan çıkarmak" komutunu gerçekleştirir.
- Bu görüntü orijinal görüntüden çıkarma ve ortaya çıkan görüntü görüntü hesap makinesi "Ve" işlevi kullanarak orijinal görüntü ile birleştirir. Siyah (boşluk) ve beyaz (hücreler) maskesi ile eşik görev (en az 0, en çok 5) sonuç görüntü dönüştürmek ve gürültü yansımadan kaldırmak için "ikili aşındırmak" işlevini kullanın.
- Siyah beyaz piksel "alan kesir" ölçüm kullanarak sonuç görüntü içinde için oranını ölçmek. Arsa ve kesirli alanlar her tedavi süresi noktası için maksimal gap alanının yüzde ifade eder.
- Anlamına gelir hesaplamak ve Tukey'nın öğleden hoc testi, p değerleri anlamlı kabul 0,05 daha az ile tek yönlü ANOVA kullanarak karşılaştırın.
- İmmunoblot analiz varlığı amiloid, oligomeric tau ve Aβ kültür supernatants kurmak için kullanın. Kültür supernatants en az 10 kat Elektroforez önce konsantre dışında standart prosedürler10,11,12, kullanan immunoblot çözümlemesi gerçekleştirin.
- Süpernatant konsantre için 1-2 mL süpernatant olan membran 10 kDa molekül ağırlığı cut-off vardır Santrifüjü filtre ünitesi yerleştirin. Filtre ünitenin görüntülenmemesini bir masa üstü santrifüj ve santrifüj 2.000 x konsantrasyon gerekli derecesine kadar g (genellikle 45-60 dakika) elde.
- Konsantre süpernatant11 protein miktarını belirlemek ve örnekleri eşit miktarda jel bireysel kuyu yükleyin.
- Jelleri çalıştırmak, proteinler nitroselüloz için daha sonra A11 Anti-amiloid antikor, T22 Anti-oligomeric tau antikor veya uygun ikincil antikorlar tarafından takip MOAB2 anti-Aβ antikor lekesi sonda. Standart Kemiluminesan yordamları kullanarak lekesi geliştirmek.
- Bir thioflavin T tahlil yapmak için supernatants içinde amyloids ölçmek için thioflavin T Floresan (ThT) kullanın. Bu ölçümler için filtre sterilize supernatants kullanın.
- Thioflavin T stok çözeltisi (50 x) 8 mg thioflavin T (ThT) askıya tarafından 10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlamak. Karıştırma sonra çözüm parçacıklar kaldırmak için 0,22 µm filtre ile filtre.
- Ölçümler için PBS 1 mL spektrofotometre küvet içinde 1 mL 20 µL ThT stokunun ekleyin. Seyreltilmiş örnek bir spectrofluorimeter yerleştirin.
- 425 nm uyarma kullanarak ve floresan emisyon 450-575 nm 2 nm aralıklarla üzerinden tarama temel floresans emisyon ölçmek.
- 425 nm uyarma kullanarak zaman atlama tarama gerçekleştirmek ve verileri ile 482 nm Emisyon elde her 0,2 s 60 s.
- İlk 20 s zaman atlama tarama ölçer floresans boş küvet içinde. 20 s, tarama duraklatmak ve filtre sterilize süpernatant ile 10 µL küvet için ekleyin. Küvet INVERSION tarafından karıştırın ve geri spectrofluorimeter yerleştirin.
- Son 40 edinme zaman aşamalı tarama devam s veri.
- Zaman atlama tarama tamamlandığında, ayrıntılı olarak 2.1.5.3 aynı ayarları kullanarak bir son floresans emisyon spektrum taraması gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sitotoksin supernatants P. aeruginosabakteri ile enfekte hücre içinde varlığı için tahlil için bir basit vitro tahlil geliştirilmiştir. Temel olarak, enfekte hücreleri kültür ortamından 4 h bakteriyel eklenmesinden sonra toplanır, bakteri filtresi sterilizasyon süpernatant kültürünün tarafından kaldırılır ve daha sonra steril süpernatant hücreleri yeni bir popülasyon için eklenir. Hücreleri sonra süpernatant eklenmesi sonra 21-24 h gözlenir ve hücre öldürme sayılabilir.
P. aeruginosa ilavesi PMVECs konfluent katmanları için hücreleri arasındaki boşlukları oluşumu neden olmaktadır. Vivo, boşluk oluşumu akciğer ödemi ve azalmış akciğer fonksiyon yol açar. Sitotoksin yayın içine hücre kültür supernatants ve yeterli PA103 ile kuluçka süresi için zaman noktası filtreleme için varlığı ile gösterildiği gibi hücre monolayer formunda başlar boşluklar belirtildiği şekilde açıklanan assay olarak, boşluk oluşumu kullanılır Şekil 1. ΔPcrV bakteri hücre boşlukları bu kuluçka koşullarda neden değil. Bir kez boşluklar tespit edilir, süpernatant olduğunu toplanan, filtre sterilize ve naif PMVECs sitotoksik etkinliğini değerlendirmek için eklendi. Onların anılan sıraya göre supernatants PMVECs sonra 21-24 h için bir kuluçka yerleştirilir ve sonra gözlenen ve fotoğraflandı. Şekil 2' de gösterildiği gibi P. aeruginosa gerilme PA103 ile enfekte olmuş PMVECs üzerinden toplanan süpernatant kültürlü hücre ölüm indüklenen tarafından 21 h süpernatant eklenmesi sonra Sitotoksin içeriyordu. Buna ek olarak, hücre ölüm yok ya HBSS orta veya Pseudomonas ΔPcrV zorlanma toplanan süpernatant ile tedavi kontrol hücreleri gözlendi. Immunoblot analiz hiçbir amyloids PMVECs (Şekil 2) aşı takip ΔPcrV zorlanma tarafından oluşturulan iken amiloid molekülleri oligomeric tau ve Aβ, dahil olmak üzere, PA103 gerginliği, mantar enfeksiyonu sırasında oluşturulan olduğunu gösterdi. Amyloids rolüyle bu tahlil Sitotoksin kültürlü hücreler12süpernatant ek önce gelen amyloids immunodepletion tarafından doğrulanmıştır. Her ne kadar burada gösterilmeyen, sitotoksik süpernatant A11 Anti-amiloid antikor ve T22 Anti-tau oligomer antikor tamamen kullanarak, immunodepletion supernatants PA103 enfeksiyonu (Balczon ve ark. 2017 üretilen sitotoksik aktivitesinden depletes 12 ve Balczon vd., hazırlık).
Miktar hücre öldürme, roman, ucuz ve basit bir yöntem geliştirdi. Bu tahlil için ImageJ yazılım mikroskobik bir alandaki hücreler (hücre öldürülmesi gösterge) eksikliği alanların doğrudan ölçüm izin vermek için adapte edilmiştir. Bu yöntem güvenilirliğini karaciğer hücreleri sürümüdür öldürme, hücre ölçme köklü yöntemi için doğrudan karşılaştırma tarafından doğrulandı. Şekil 3' te gösterildiği gibi ImageJ yazılım, beyaz hücreleri içeren bölgeleri mikroskobik alanın ve siyah hücrelere eksikliği bölgeler dönüştürmek için kullanılabilir. Daha sonra siyah beyaz alanlar basit oranında hücre ölüm ölçmek için kullanılabilir. Hücreleri bir konfluent monolayer ile başlatırken, mikroskobik alanın tüm bölgeler beyaz. Ancak, sonra supernatants Sitotoksin içeren ek 18 h tarafından monolayer boşluklar tespit edilemedi. Alan 36 h sonrası ilavesi sitotoksik süpernatant kadar doğrusal bir şekilde artmış hücre yoksun kültür yemeğin miktarı. Karaciğer yayın ölçerken aynı sonuçlar, ilk 18 h, sitotoksik süpernatant eklenmesinden sonra tespit edilmeden karaciğer sürümü ile elde edilmiştir. Maksimal hücre öldürme 36 h süpernatant eklenmesi sonra ölçüldü kadar karaciğer yayın daha sonra doğrusal bir şekilde arttı. Küçük hücre ölümü aşısını ΔPcrV hücrelerden (Şekil 3) toplanan süpernatant ile tedavi hücreleri veya kültürler için 36 h HBSS ile tedavi ölçüldü.
Tedavi ile bakteri hücreleri serbest amiloid miktarı ThT floresans ölçerek sayılabilir. Amyloids ThT için bağlama floresan yoğunluğu molekül ve an artmak içinde bir konformasyonal değişim neden olur. Bu tahlil için thioflavin T bir küvet için eklenir ve temel floresans ölçülür. Örnek küçük bir aliquot eklenirken floresans kayıt sonra durdu. Küvet sonra fluorimeter için döndürülür ve floresan emisyon kaydedilir değişimdir. Şekil 4' te gösterildiği gibi floresans emisyon artış gösterildiği gibi bulunan P. aeruginosa amiloid PA103 suşu ile inkübe hücrelerden süpernatant toplanan. Buna ek olarak, süpernatant ΔPcrV gerilme ile aşılanmış PMVECs üzerinden amyloids, artan floresan bir yokluğu tarafından belirtildiği şekilde yoksun.
Şekil 1. P. aeruginosa inolculation etkileri PMVEC morfoloji. PMVECs (A) ve PA103 P. aeruginosasuşu eklenmesi (B) sonra dört saat önce in konfluent monolayer. Boşluklar enfekte hücrelerde hücre monolayer açıkça görülebilir. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Sitotoksik supernatants analizlerini. [I] bölümü. Kontrol ve tedavi hücreleri temsilcisi görüntüleri. PMVECs 21 h için her iki PA103 bakteri (B) ya da zorlanma ΔPcrV ile (C)aşılamaya hücrelerden elde edilen süpernatant ile tedavi edildi. Kontrol hücreleri de HBSS arabellek (A)21 h için inkübe. Ölçek çubuğu 100 µm. Bölüm [II] =. Temsilcisi immunoblots supernatants, toplanan ΔPcrV (A) veya PA103 (B) enfekte PMVECs. Lekesi amiloid (A11) veya oligomeric tau (T22) karşı antikorlar ile probed. Mr kDa de. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Hücre öldürme Nefelometri. (A) temsilcisi mikroskop alanlardan alan hangi bölgelerde içeren ve hücreleri eksik ya beyaz ya da siyah, sırasıyla, ImageJ yazılımı kullanılarak çevrildi farklı zaman puan (h süpernatant toplama sonra). Dönüşüm aynı zamanda gösterilmeden önce aynı faz kontrast görüntü. Çubuk 100 µm. (B) = Nefelometri standart karaciğer yayın tahlil ve ImageJ tahlil kullanarak öldürme hücresinin karşılaştırılması. N = 4, **p < 0,05, ***p < 0,01. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Temsilcisi ThT floresans tahlil veri. Boş cuvettes ThT içeren heyecanlı 425 nm ve emisyon sonra floresan 482 ölçüldü nm. Arka plan floresans 20 s ve Süpernatant sonra gelen her iki PA103 - veya ΔPcrV-PMVECs için cuvettes eklendi aşısını toplanmıştır. Floresans emisyon sonra 40 saniye kaydedildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, basit vitro yöntemleri gösteri sitotoksik amyloids nesil enfeksiyon sırasında organizma neden bir pnömoni ile izin özetlenmiştir. Bu yöntemler içerir bir hücre kültür sitotoksisite tahlil, immunoblotting, Nefelometri hücrenin bir roman mikroskobik yöntemi ve ThT bağlama kullanarak öldürme. Sitotoksik ajanlar analizleri amiloid doğada (Şekil 2 ve Şekil 4) vardır ve bir deli dana12özellikleri sergi gösterdi. Sitotoksik prion moleküller oluşturma sırasında zatürre pnömoni ölüm onların Hastanesi deşarj takip gözlenen yüksek ölüm oranları için potansiyel bir açıklama sağlar. Deneyler devam eden bu olasılığı test ediyoruz.
Sitotoksik süpernatant nesil tüm açıklanan çalışmaları için anahtar olayıdır ve iki önemli değişkenler dikkate alınması gerekir. İlk olarak, Seviyelendirilmiş deneyler köstebeğiyle PMVECs enfeksiyon adımı için ve sitotoksisite tahlil için kullanılmıştır. Diğer hücre tipleri Sitotoksin üretimi için kullanılan olabilir ayrıntılı olarak araştırmış değil, ve diğer hücrelerin sitotoksik supernatants tedavi çeşitli P. aeruginosasuşlarının ile aşağıdaki oluşturmak mümkün olabilir mümkündür. Görüldüğü gibi Sitotoksin amiloid doğada ve oligomeric tau ve Aβ içerir. Tau ve/veya beta amiloid protein hızlı diğer hücre tipleri her ne kadar test edilecek bu olasılığı kalır bakteri aşılama, takip Sitotoksin oluşturmak için indüklenen beklemek mantıklı olabilir. Diğer hücre tipleri farklı hakaret takip sitotoksik amyloids üretmek için bağlı olup olmadığını anahatlı yordamları incelemek için kullanılabilir.
İkinci önemli sitotoksik supernatants nesil bakteri ile tedavi süresi değişkendir. PMVECs kuluçka boşluklar içinde monolayer görülebilir kadar ilerleme izin verilmesi esastır. Hücre monolayer boşluklar bir gösterge ekzoenzimlerden Pseudomonas bakterileri tarafından ana hücre sitoplazma enjekte edilmiş ve ekzoenzimlerden hücre kenarlıkları (Şekil 1) geri içinde çekilmesi sonucu etkin olan tanımlamasıdır. Bizim deneyimdir hücre kenarlıklarını geri çekme süresi noktası Sitotoksin yayın süpernatant içine, güvenilir bir göstergedir. O iki olay oligomeric tau serbest bırakılması sitotoksik amyloids biridir ve hücre şekil değişiklikleri için katkıda Mikrotubul bozulumu tau faaliyet bozulma sonuçları olarak ilgili spekülasyon için cazip olduğunu. Nerede tedavi boşluk oluşumu ikna etmek için gereken süreyi daha az olan deneylerde, küçük olgun sitotoksik amiloid algıladı.
Bu el yazması açıklanan sitotoksisite tahlil basit ve güvenilir olduğunu. Hücre ölümü kolayca mikroskobik bir sınava gözlenen ve kaydedilen mikroskobik görüntüleri doğrudan sayılabilir. Burada açıklanan yöntemleri sadece enfeksiyon sıçan pulmoner endotel hücre P. aeruginosaile takip Sitotoksin üretim değerlendirmek için kullanılmaktadır. Olası yordamları sitotoksik amyloids nozokomiyal ilişkili her ikisi de dahil olmak üzere neden diğer zatürree ile enfeksiyon üretilen değerlendirmek için kolayca adapte olabilir görünüyor bakteri ve bakteri ve virüsleri sorumlu Zatürree türleri topluluk satın aldı. Ayrıca, bildirilen yordamlar yalnızca sitotoksik amiloid dil üretimi sırasında enfeksiyon kültürlü hücre incelemek için kullanılmaktadır. Hücre kültürü yapay bir sistemdir ve büyük olasılıkla burada özetlenen yordamlar Sitotoksin oluşturma sırasında hayvan modelleri ve insan hastaların pulmoner enfeksiyon değerlendirmek için adapte olabilir. Enfekte hayvan veya hasta bronchoalveolar lavaj gibi biyolojik sıvı toplanması sitotoksik amyloids enfeksiyon sürecinde içinde vivo oluşturulan olup olmadığını değerlendirmek için rapor burada deneyleri aynı türden kullanılabilir. Açıkçası, bakteri ile kuluçka sürelerini hayvana aşı zaman oldukça farklı olabilir ve bronchoalveolar lavaj tedavi nihai süresi belirlemek için birden çok zaman noktada toplanan olması gerekir.
Immunoblot analizleri oligomeric tau ve Aβ (Şekil 3) dahil olmak üzere supernatants içinde amyloids olduğunu gösterdi. İmmunoblot yordamları standart olmakla birlikte, immunoblot analizleri başlatılıyor önce gerçekleştirilmesi gereken önemli bir adım vardır. Özellikle, bu algılama immunoblot Analizi tarafından sınırın altındaki amiloid içinde un konsantre süpernatant miktarı olduğu gibi supernatants en az on immunoblotting önce konsantre olması önemlidir. Burada rapor gibi Santrifüjü kullanarak bir filtre ile donatılmış tüpler bu konsantrasyon adım için rutin olarak kullanılan yöntemdir, ancak bu TCA yağış gibi diğer yöntemleri eşit olarak bu adımı için yararlı olur makul görünüyor.
Görüntüleri kullanarak öldürme hücre Nefelometri önemli avans temsil eder. Şu anda hücre ölümü miktarının için kullanılabilir yordamlar karaciğer serbest bırakmak--dan ölü hücreleri ölçümü izin oldukça pahalı kitleri satın alma güveniyor. ImageJ programları NIH Web sitesinden indirmek için ücretsiz olarak burada açıklanan tahlil hiçbir maliyeti içerir. ImageJ programlar basit uyarlaması hücre öldürme oldukça hassas ölçüm sağlar. Ancak, bu küçük eserler birkaç anahatları belirlenmiş iletişim kuralı performansını sırasında karşılaşılan işaret değer. Odak kişisinin alanlar gibi hücre parçaları olarak hücreleri die kültür çanak ile ilişkili kalabilir önemli konudur. Bu kalıntı hücre parçaları kamera tarafından tespit edilebilir ve hücreleri çanak üzerinde kalır yapay bir göstergesi. Bu nedenle, değeri % 100 hücre öldürme, bu yordamı kullanarak elde edilir nadirdir.
Bir bildirilen tahlil sisteminin Sitotoksin amyloids hazırlık asla tamamen tanımlanmış olan zayıflıktır. Bu nedenle, Nefelometri zordur. ELISA deneyleri her hazırlık bireysel türler hakkında detaylı herhangi bir bilgi vermeden farklı amyloids, toplam düzeyde sağlamak için kullanılabilir. Kadar daha kesin deneyleri, öyle aynı derecede kitle-spec veya içinde vitro amiloid reaksiyonlar sentez, geliştirilebilir, şu anda yapabileceğiniz en iyi her deney aynı sayıda hücre ile başlamak için aynı süre için kuluçkaya ve doğrulayın kullanılmış olan önceki hazırlıkları gibi aynı fiyatlara sitotoksisite oluşur. Değişim herhangi bir normları kurulan ek belirsizlik tanıttı.
Özetle, zatürre neden olan Ajan ile enfeksiyon takip pulmoner endotel hücreleri tarafından toksik amiloid moleküllerin üretimini gösteren için basit vitro yöntemleri açıklanmaktadır. Deneyleri güvenilir ve büyük olasılıkla diğer organizmalar için ve biyolojik sıvı enfekte hayvan ve insan hasta elde kullanarak kullanmak için adapte edilebilir. Bu yöntemler pnömoni uzun vadeli sonuçları araştıran çalışmalar ve uç-organ yetmezliği hastalarda hastane deşarj ardından yol açan mekanizmalar kurmak için faydalı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Rapor için hiçbiri.
Acknowledgments
Bu araştırma bölümlerinde NIH hibe HL66299 TH, RB ve SL, HL60024 TS ve MF HL136869 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
