Summary
Descriviamo le prove meccaniche simultanea e live imaging 3D della parete arteriosa di isolato, arterie di resistenza umana e Fiji e Ilastik analisi di immagine per la quantificazione di elastina e collagene densità di volume e di organizzazione spaziale. Discutiamo l'uso di questi dati in modelli matematici della meccanica della parete arteriosa.
Abstract
Il contributo di patogeno della resistenza dell'arteria rimodellamento è documentato nell'ipertensione essenziale, il diabete e la sindrome metabolica. Le indagini e lo sviluppo di modelli matematici microstructurally motivati per comprendere le proprietà meccaniche delle arterie di resistenza umana nella salute e nella malattia hanno il potenziale per aiutare la comprensione come malattia e trattamenti medici influenzare la microcircolazione umana. Per sviluppare questi modelli matematici, è essenziale per decifrare il rapporto tra le proprietà meccaniche e della microarchitettura della parete microvascolare. In questo lavoro, descriviamo un metodo ex vivo per prove meccaniche passive e simultaneo imaging tridimensionale privo di etichetta della microarchitettura di elastina e collagene nella parete arteriosa delle arterie di resistenza umana isolata. Il protocollo di imaging può essere applicato alle arterie di resistenza di qualsiasi specie di interesse. Analisi di immagine sono descritti per quantificare le modifiche i) pressione indotta in angoli ramificazione lamina elastica interna e rettilineità adventitial collagene utilizzando Fiji e densità di volume ii) collagene ed elastina determinato utilizzando il software Ilastik. Preferibilmente tutte le misure di formazione immagine e meccaniche vengono eseguite sulle arterie live, irrorate, tuttavia, è un approccio alternativo utilizzando pressione standard video-microscopia myography in combinazione con post-fissazione formazione immagine dei vasi ri-pressurizzati discussi. Questo metodo alternativo fornisce agli utenti con diverse opzioni per approcci di analisi. L'inclusione dei dati meccanici e imaging in modelli matematici della meccanica della parete arteriosa è discussa, e lo sviluppo futuro e aggiunte al protocollo sono proposti.
Introduction
Il contributo patogeno e gli effetti della resistenza dell'arteria rimodellamento sono documentati nell'ipertensione essenziale, diabete e sindrome metabolica1,2,3,4,5. Decifrare il rapporto tra le proprietà meccaniche e della microarchitettura della parete microvascolare è essenziale per lo sviluppo di modelli matematici di questa associazione. Tali modelli miglioreranno la comprensione del processo di rimodellamento e sosterranno lo sviluppo di modelli di silico utile per testare strategie farmacologiche malattia targeting relativo rimodellamento della parete arteriosa.
Precedenti studi focalizzati a comprendere come la microarchitettura della parete arteriosa si riferisce alla meccanica della parete arteriosa incorporando misure meccaniche e la microarchitettura della matrice extracellulare (ECM) vengono eseguite quasi esclusivamente su grande , le arterie elastiche condotto da topi o suina6,7,8,9,10,11. Formazione immagine di microstrutture della parete viene in genere eseguita utilizzando tecniche ottiche non lineari, approfittando del autofluorescence di elastina e di generazione di seconda armonica da collagene. In questo modo spatiotemporal imaging dei due componenti principali della matrice extracellulare, elastina e collagene, senza la necessità di macchiatura. Imaging della parete arteriosa in tutto il suo spessore è una sfida nelle arterie di grande condotto a causa di dispersione della luce nella spessa tunica media. Tuttavia, per determinare la correlazione tra la microarchitettura delle componenti strutturali della parete arteriosa e le proprietà meccaniche osservate, informazioni tridimensionali devono essere ottenuti durante le prove meccaniche. Per grandi arterie come l'aorta umana, questo richiede montaggio biassiale, prove meccaniche e imaging delle regioni di interesse in pezzi di2 : 1-2 cm della parete arteriosa7,9,10, 12. solo una parte del muro può essere imaged e meccanicamente testata.
Per più piccole arterie di qualsiasi specie (ad es., pericardico umano13, polmonare14 e sottocutaneo15 arterie, ratto arterie mesenteriche16,17,18, 19 , 20, mouse cremaster, mesenterico, cerebrale, femorale e arterie carotiche21,22,23,24,25,26, 27) imaging dello spessore della parete intera è possibile e può essere combinato con prove meccaniche. Questo permette la registrazione simultanea di proprietà meccaniche e i dispositivi strutturali all'interno della parete. Tuttavia, una modellazione matematica diretta della relazione tra le alterazioni osservate nella struttura tridimensionale della ECM e cambiato proprietà meccaniche della parete arteriosa resistenza, è al meglio della nostra conoscenza solo stato segnalato su recentemente in resistenza umana arterie13,15.
In questo lavoro, è descritto un metodo ex vivo per prove meccaniche passive e formazione immagine tridimensionale simultanea della microarchitettura di elastina e collagene nella parete arteriosa delle arterie di resistenza umana isolata. Il protocollo di imaging può essere applicato alle arterie di resistenza di qualsiasi specie di interesse. Analisi di immagine sono descritti per ottenere misure di angoli ramificazione lamina elastica interna e collagene adventitial rettilineità13 utilizzando Fiji28. Densità di volume di collagene ed elastina sono determinati utilizzando Ilastik software29 e infine, l'inclusione dei dati meccanici e imaging in modelli matematici della meccanica della parete arteriosa è discussa.
L'obiettivo di descrivere le analisi di imaging e immagine tecniche in combinazione con modellazione matematica è quello di fornire gli investigatori un approccio sistematico per descrivere e comprendere osservato cambiamenti di pressione indotta nel ECM di arterie di resistenza. Il metodo descritto è focalizzato nel quantificare i cambiamenti in ECM in una nave durante la pressurizzazione, confrontando la struttura dell'ECM a 20, 40 e 100 mmHg. Queste pressioni sono stati scelti per la determinazione della struttura della parete arteriosa al suo più compatibile (20 mmHg), rigido (100 mmHg) e stato intermedio (40 mmHg), rispettivamente. Tuttavia, qualsiasi processo nella parete vascolare delle arterie dal vivo, tra cui i cambiamenti indotti da componenti vasoattivi, isteresi e flusso, può essere quantificato, a seconda l'ipotesi di ricerca in questione dallo sperimentatore.
L'uso di microscopia di fluorescenza del due-fotone eccitazione (TPEM) in combinazione con un myograph di pressione per lo studio di pressione (o altro) ha indotto cambiamenti in ECM delle arterie dal vivo è data risalto a. In primo luogo, perché questo consente acquisizione simultanea della struttura nel complesso tridimensionale della parete arteriosa (diametro e spessore della parete) con acquisizione tridimensionale privo di etichetta di alta qualità, immagini del collagene e dell'elastina dettagliate microarchitetture come descritto13 sfruttando l'autofluorescenza di elastina e collagene seconda generazione armonica segnale (SHG)30. In secondo luogo, TPEM consente è consentito l'uso della luce di eccitazione di bassa energia vicino infrarosso, minimizzando photodamage di tessuti e dunque, formazione immagine ripetuta esattamente nella stessa posizione all'interno della parete vascolare, che consente analisi di misure ripetute di osservato modifiche.
L'uso di un approccio alternativo usando la formazione immagine confocal di pressione fissata arterie è discusso per consentire agli utenti senza accesso ai TPEM l'opportunità di utilizzare il metodo descritto pure. Informazioni sulla densità di struttura e volume di ECM possono essere recuperate anche dalle analisi bidimensionale dei tessuti sezionati in serie, ad esempio come descritto da31,32. Tuttavia, a causa della mancanza di possibilità di recuperare informazioni strutturali tridimensionali sopra le scale di lunghezza dell'arteria, così come durante il cambiamento delle condizioni di utilizzo di questo metodo, si consiglia di non utilizzare questo approccio per le indagini di pressione e il trattamento ha indotto cambiamenti tridimensionale in ECM.
Il requisito minimo per l'investigatore applicare il metodo qui descritto è l'accesso a un programma di installazione per inserimento di una canula e pressurizzazione delle arterie in combinazione con un microscopio a fluorescenza confocale o due-fotone eccitazione. Il programma di installazione descritto nel protocollo seguente è un myograph di pressione su misura con un trasduttore di forza longitudinale, costruito per adattarsi su un microscopio di fluorescenza di eccitazione del due-fotone costruito su ordinazione invertito.
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Protocol
Raccolta delle biopsie del pericardio parietale umana per l'uso in quest'opera è stata eseguita dopo consenso informato scritto, come descritto in precedenza33. Lo studio dei tessuti umani sono conformi ai principi delineati nella dichiarazione di Helsinki34 ed è stato approvato dai comitati regionali la salute ricerca etica per Southern Denmark (S-20100044 e S-20140202) e l'Agenzia danese per la protezione dei dati.
1. raccogliere tessuto e Isolate (umano) resistenza dell'arteria
- Raccogliere campioni di tessuto di interesse immediatamente dopo l'asportazione durante un intervento chirurgico. Trasferimento del tessuto a 4 ° C HEPES fisiologico soluzione salina tamponata (HBS) immediatamente al momento della raccolta e memorizzarlo in HBS.
Nota: Tessuti umani sono raccolti solo dopo l'approvazione di comitati etici e istituzionali nonché consenso informato dei pazienti. Composizione di HBS in mM: 144 di NaCl, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, 14,9 HEPES, glucosio 5.5. Regolare il pH 7.4 con NaOH e filtrare il filtro di soluzione però 0,2 µm. - Lasciare il tessuto raccolto in sterile HBS a 4 ° C durante la notte per lavare fuori degli anestetici.
Nota: Qualsiasi effetto di deposito notturno sulla nave l'integrità e la funzionalità deve essere controllato dal laboratorio di ricerca individuale. - Isolare accuratamente arterie della resistenza dimensioni (diametro del lume di ± 200 µm) utilizzando una coppia di sharp-suggerimento pinze e le forbici micro-dissezione.
- Conservare le arterie a 4 ° C in HBS ghiacciata mentre la camera di imaging/pressione di adescamento.
2. Montare l'arteria isolata nel Myograph di pressione
- Montare le cannule di vetro con un diametro di punta di ~ 80 µm su supporti cannule. Posizionare i suggerimenti circa 150 µm sopra il fondo di vetro camera.
Nota: cannule piegate punta 45° possono permettere un posizionamento preciso della nave sopra il fondo di vetro. - Riempire d'aspirazione e tubo di uscita con HBS con BSA 1% e connettersi al sistema di pressione.
Nota: BSA è incluso per conservare la funzione delle cellule endoteliali. - Montare l'arteria isolato con due punti di sutura doppio nodo per cannula.
Nota: Nodi possono essere preparati in anticipo e memorizzati su nastro adesivo doppio fino a quando necessario. - Riempire la camera con HBS e inserire due doppi nodi su ogni cannula di vetro.
Nota: Quando si utilizza arterie visualizzazione tono miogenico, HBS dovrebbe essere sostituito con calcio che gratis HBS completati con 3 µM EGTA e nitroprussiato di sodio 3 µM. - Tenere l'arteria delicatamente ad una estremità usando due paia di pinze a punta tagliente. Aprire il lume dell'arteria e infilarla delicatamente la cannula. Difficoltà sulla cannula usando due nodi.
- Applicare una pressione di 5 mmHg per lavare delicatamente il lume con HBS / 1% BSA.
- Incannulare l'altra estremità dell'arteria e fissarlo sulla cannula utilizzando due doppi nodi.
- Trasferire la myograph per il tavolino del microscopio e pressurizzare l'arteria a 5 mmHg (pressione d'ingresso = pressione di uscita), quindi riscaldare a 37 ° C per 30 min.
- Opzionale: Calibrare il trasduttore di forza longitudinale secondo le istruzioni del produttore (1 g = 9,81 mN).
Nota: È necessario calibrare il trasduttore di forza dopo riscaldamento quanto è sensibile alla temperatura.
3. eseguire l'esperimento: Imaging di diametro arterioso, spessore della parete, collagene ed elastina microarchitettura utilizzando TPEM
- Analizzare rapidamente l'arteria cannulata pressurizzato a 5 mmHg usando un obiettivo X 20 (apertura numerica (NA) ≥ 0,8) e la luce di eccitazione di bassa potenza per valutare vaso diametro e spessore della parete a 5 mmHg.
Nota: Per microscopi rovesciati, utilizzare un obiettivo a immersione in acqua; per microscopi verticali, utilizzare un acqua immersione obiettivo. Se l'obiettivo non ha un collare di correzione per correggere per spessore del vetrino coprioggetto, assicurarsi di corrispondere il coprioggetto usato con l'obiettivo utilizzato. Le impostazioni del software e le descrizioni possono variare a seconda del utente-interfase e il microscopio e il software utilizzato.- Programma di installazione il percorso ottico.
- Attivare il Mai Tai due fotoni laser e impostarlo su 820 nm di luce di eccitazione.
Attenzione: Evitare l'esposizione alla luce laser visibile, così come invisibile. - Raccogliere emissione contemporaneamente in due canali. Dividere emissione luce tra i fotomoltiplicatori utilizzando un 460 nm passaggio lungo specchio dicroico e raccogliere emissioni utilizzando filtri di 30-60 nm ampia banda centrati a 520 nm (elastina) e 410 nm (collagene), rispettivamente.
- Attivare il Mai Tai due fotoni laser e impostarlo su 820 nm di luce di eccitazione.
- Abilitare la scansione continua con 10 µs laser dwell tempo/pixel e 512 × 512 pixel per 100% campo di vista.
- Manualmente la scansione attraverso l'arteria per determinare la profondità dove il diametro massimo è osservato.
- Scegliere una porzione rettangolare copre più ampio diametro dell'arteria e la scansione di un singolo fotogramma con pixel dimensioni ≤ 300 nm/pixel (Figura 2). Utilizzare come eccitazione bassa potenza di luce e tempo di permanenza del pixel possibile evitare photodamaging l'arteria dal vivo.
Nota: Si raccomanda di ottenere una rettangolare, per es., 100 × 1024 pixel dell'immagine, anziché quadratica immagine in questa posizione per risparmiare tempo e limitare l'esposizione del fotone di tessuto (Figura 2). - Salvare l'immagine per successive analisi.
- Programma di installazione il percorso ottico.
- Determinare il lume diametro e spessore della parete presso il diametro massimo dell'arteria.
- Caricare l'immagine in Fiji.
- Impostare la scala facendo clic Main menu | Analizzare | impostare la scala e immettere µm/pixel e pixel rapporto (si consiglia di mantenere il rapporto di pixel 1:1).
- Scegliere lo strumento di riga di Fiji e tracciare una linea tra le due lamine elastiche interne a ogni lato del lume arterioso e fare clic su ctrl + M. Fiji rapporti lunghezza come predefinito nella tabella dei risultati.
- Allo stesso modo, disegnare altre linee per misurare lo spessore di ciascuna parete e fare clic su ctrl + M per misurare il markup seguente.
- Salvare le misurazioni.
- Immagine del collagene ed elastina microarchitettura a 5 mmHg analizzando l'intero spessore della parete arteriosa, ottenimento di serie di immagini 3D con una buona qualità per 1-3 regioni di interesse lungo la lunghezza dell'arteria.
- Ottenere gli stack di immagine attraverso l'intera parete dell'arteria utilizzando un 60 X obiettivo, NA ≥ 1, le dimensioni dei pixel ottimizzata e z-spaziatura.
- Calcolare le condizioni ottimali di formazione immagine (dimensioni in pixel e la spaziatura di z-passaggio) in conformità con il percorso ottico, mezzo immersione e indici di rifrazione usando la calcolatrice scientifica Volume Imaging Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator) di esempio.
Nota: Si prega di prestare attenzione alla differenza tra le dimensioni di pixel ottimale e z-spaziatura contro i consigli nella sezione 3.4. sopra sull'uso di una dimensione massima di pixel.
- Calcolare le condizioni ottimali di formazione immagine (dimensioni in pixel e la spaziatura di z-passaggio) in conformità con il percorso ottico, mezzo immersione e indici di rifrazione usando la calcolatrice scientifica Volume Imaging Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator) di esempio.
- Utilizzare le stesse impostazioni di eccitazione e di emissione come sopra (3.1.1.).
- Consente di analizzare rapidamente la parete del vaso come descritto sopra per determinare lo spessore dello z-stack.
- Definire l'inizio dello stack z fine profondità z-passo ed e densità di pixel (calcolato in 3.3.1.1.) ed eseguire la scansione di z. Salvare ogni canale separatamente.
Nota: Immagini dovrebbero essere abbastanza piccolo per esempio 30 x 30 µm o 50 × 50 µm a seconda delle dimensioni del recipiente per evitare qualsiasi influenza di curvatura nelle analisi successive immagine.
- Ottenere gli stack di immagine attraverso l'intera parete dell'arteria utilizzando un 60 X obiettivo, NA ≥ 1, le dimensioni dei pixel ottimizzata e z-spaziatura.
- Determinare il diametro arterioso, spessore della parete e microarchitettura di elastina e collagene a pressioni restanti del protocollo.
- 3.1-3.2 a pressioni 10 e 20 mmHg di ripetere, ripetere 3.3 a pressione 20 mmHg.
- Ripetere 3.1 e 3.2 a pressione 40 mmHg.
- 3.1-3.2 a pressioni 60, 80 e 100 mmHg di ripetere e ripetere 3.3 a 100 mmHg.
Nota: 3.1-3.3 può essere ripetuta per tutte le pressioni e combinazioni delle pressioni (es. serie/combinazione di crescenti pressioni anche come decrescente), a seconda l'ipotesi da testare. Eosina in concentrazione 0,3 - 1 µM può essere aggiunto per migliorare l'elastina autofluorescence in caso di photobleaching. Photobleaching può essere evitate applicando come eccitazione di bassa potenza leggero possibile. - Sostituire il buffer nella camera di myograph con ° C 37 fresco HBS dopo ogni passaggio di pressione. Consentire l'arteria di adattarsi per 5 min prima di formazione immagine dopo ogni variazione di pressione.
- Memorizzare gli stack di canale separatamente per analisi di immagine.
- Test di vitalità dell'arteria.
- Applicare 10 µM U46619 nella camera di myograph seguito dall'aggiunta di bradichinina µM 10 quando si osserva una riduzione stabile.
- Registrare, diametro e spessore come descritto sopra nella sezione 3.1 segue l'applicazione di ciascuno dei composti.
- Quando l'arteria non è completamente dilatata dopo l'aggiunta di bradichinina e record di diametro e spessore, aggiungere 3 µM sodio nitroprussiato.
Nota: A seconda delle proprietà farmacologiche dell'arteria di interesse (letto vascolare e specie) altri vasocostrittori e composti di vasodilatatore (endotelio-dipendente) possono essere utilizzati.
- Opzionale: Difficoltà l'arteria pressurizzato o continuare con formazione immagine di collagene ed elastina per densità di volume (passaggio 7).
- Aggiungere 4% formaldeide in 1x tampone fosfato salino (PBS) a 37 ° C per 1 h.
- Lavare l'arteria fissa tre volte in PBS 1X e far scorrere delicatamente l'arteria fuori le cannule, toccare solo le parti dell'arteria fuori i nodi. Non rimuovere i nodi, li usano per lo svolgimento dell'arteria durante il trasferimento a un tubo di storage.
- Negozio in 1 x PBS / 0.05% sodio azide a 4 ° C fino a imaging per densità di volume di elastina e collagene o per altri scopi.
Nota: Le arterie fisse possono essere memorizzate per almeno 3 mesi in 1 x PBS / 0.05% sodio azide a 4 ° C.
4. calcolo di Stress ceppo relazioni e rigidezza intrinseca parete
- Si prega di seguire le formule e i passaggi del calcolo per il calcolo di sollecitazioni, deformazioni e rigidità di parete come descritto da Bloksgaard, M. et al. 13 e riferimento nel presente documento.
5. analisi - (Lamina elastica interna) IEL ramificazione angoli dell'immagine
- Stack di immagine aperta in Fiji. Vai a file | Apri immagine di scegliere la serie di immagini.
Nota: Le proiezioni di intensità Max di 2-7 consecutivi z-sezioni che riguardano la IEL (1-2 µm di spessore) sono utilizzate per determinare gli angoli IEL elastina fibra ramificazioni utilizzando lo strumento angolo nel Fiji28,35. Per illustrazione, fare riferimento alla Figura 4A . - Vai alla immagine | pile | progetto z... di scegliere le immagini e la "Proiezione di intensità Max".
- Salvare la proiezione di intensità massima come TIFF.
- Scegliere come molti punti di ramificazione fibra IEL possibili utilizzando lo strumento"angolo" e lavorare sistematicamente attraverso le immagini. Fare clic su ctrl + M per misurare ogni angolo.
- Salvare il foglio di risultati di Fiji.
6. analisi - collagene Adventitial ondulazione dell'immagine
- Stack di immagine aperta in Fiji. Vai a file | aprire immagine per scegliere la serie di immagini.
Nota: Max proiezioni di intensità di 2-7 z-sezioni consecutive che copre proprio collagene fuori la lamina elastica esterna (Anguilla, 1-4 µm spessore) vengono utilizzati per determinare ondulazione di collagene utilizzando il plugin di Fiji NeuronJ36 come descritto da Rezakhaniha, R . et al. 37 (Figura 4B). - Impostare la scala. Vai a analizzare | impostare scala di immettere le dimensioni in pixel.
- Vai alla immagine | pile | progetto z... di scegliere immagini per lavorare con e "Proiezione di intensità Max".
- Modificare il tipo di immagine a 8 bitt TIFF cliccando immagine | tipo | 8 bitt e salvare la proiezione di intensità massima come TIFF.
- Misurare la rettilineità della fibra collagene utilizzando il Plugin di Fiji neurone J.
- Aprire il plugin NeuronJ facendo Fiji | Plugin | Neurone J.
- Aprire il TIFF a 8 bit in NeuronJ facendo Load Image | Selezionare il File.
- Fare clic su Aggiungi tracciamentie selezionare fibre per analizzare cliccando su inizio e fine di ogni fibra.
- Fare clic su tracciati di misura, scegliere di visualizzare l'analisi (Lf) e misure di vertice nella finestra di dialogo.
- Calcolare L0/Lf in excel (o simili) e salvare i risultati.
- Copiare e incollare Fiji neurone J uscita i tracciati e i vertici di eccellere (o simili) e calcolare L0 utilizzando il teorema di Pitagora dalle misure di vertice. Primo e l'ultimo punto sulla linea indicano le posizioni delle estremità dell'ipotenusa in un sistema di coordinate 2D.
Nota: Un L0/Lf [lunghezza di collagene fibra bundle-to-end tramite una linea retta (L0) / full lunghezza (Lf)] vicino a 1 indica una fibra collagene quasi dritto.
- Copiare e incollare Fiji neurone J uscita i tracciati e i vertici di eccellere (o simili) e calcolare L0 utilizzando il teorema di Pitagora dalle misure di vertice. Primo e l'ultimo punto sulla linea indicano le posizioni delle estremità dell'ipotenusa in un sistema di coordinate 2D.
7. collagene ed elastina Volume densità per imaging
- Lavare l'arteria (fisso) 1 x in PBS e macchia per 15 min in 1 eosina µM in PBS 1x al buio. Per arterie fisse, è necessario eseguire questo passaggio a temperatura ambiente.
Nota: Eosina migliora la fluorescenza di elastina. Se il campione è lasciato nella soluzione colorante per un tempo prolungato, eosina macchierà altre strutture come il collagene e il citoplasma della cellula. Se la colorazione di altre strutture è troppo intenso, abbassare la concentrazione di eosina a 0,3 µM o ripetere il lavaggio. - Lavare l'arteria 3 x in PBS 1X
- Per arterie fisse: montare l'arteria per l'imaging.
Attenzione: Formazione immagine dei vasi non pressurizzato non consentire il recupero di eventuali informazioni quantitative geometriche. Quando sono necessarie quantità assoluta, questi dovrebbero essere ottenuti sempre sulle arterie live, pressurizzate. Rapporti di volume possono essere ottenuti su arterie non pressurizzato con questo metodo.- Mettere due pezzi di adesivo doppio nastro 1-1,5 cm di distanza su un oggetto di vetro. Nastro adesivo doppio è circa 100 µm di spessore. Applicare uno o più strati di nastro al diametro dell'arteria per essere montato.
- Inserire 10-20 µ l di PBS sul vetro nel mezzo della piazza e l'arteria nella goccia di PBS.
Nota: La goccia dovrebbe essere come piccolo e piatto come possibile per evitare spingendo l'arteria fuori posizione quando si monta il vetrino coprioggetto. - Posizionare il vetrino coprioggetto e stirarli doppio nastro adesivo.
- Riempire il serbatoio tra il vetrino coprioggetto e vetro portaoggetti con 1x PBS. Riempire ogni ora per evitare l'essiccazione del campione.
- Per arterie fisse: montare l'arteria per l'imaging.
- Ottenere la serie di immagini per collagene ed elastina densità di volume utilizzando un obiettivo X 20 con NA > 1 a coprire gran parte della parete arteriosa possibile pur avendo una buona risoluzione ottica (Figura 2D, 2G e 2h).
Nota: Utilizzare un obiettivo a immersione in acqua per l'imaging delle arterie fisse sotto un vetrino coprioggetto e utilizzare un acqua immersione obiettivo per l'imaging delle arterie vitali. Se l'obiettivo non ha un collare di correzione per correggere per spessore del vetrino coprioggetto, assicurarsi di corrispondere il coprioggetto all'obiettivo. Utilizzare preferibilmente le dimensioni dei pixel ottimale e z-spaziatura. Calcolare questi utilizzando la calcolatrice di Nyquist (punto 3.3.1.1.). In alternativa, utilizzare una dimensione minima in pixel di 300 nm e z-spaziatura di 1 µm. Si consiglia di ottenere tre immagini lungo la lunghezza dell'arteria per consentire all'utente di determinare la variabilità intra-saggio. - Elastina immagine utilizzando 820 nm eccitazione luce e emissione raccogliere utilizzando un 30-60 nm passa-banda larga filtra centrato a 520 nm.
- Collagene di immagine utilizzando la luce di eccitazione nm 990 per evitare qualsiasi eccitazione di elastina e di altre proteine di autofluorescent e raccogliere emissioni utilizzando filtra passa-banda larga di 10-30 nm centrato a 495 nm.
- Salvare la serie di immagini da ogni canale separatamente come file TIFF
8. image Analysis per l'estrazione di elastina e collagene Volume densità utilizzando Ilastik
- Convertire TIFF immagine pile per HDF5 utilizzando Fiji28,35 , scegliere Scegli File | Salva come... HDF5.
- Creare due cartelle di file di dati sul disco rigido del computer, uno per l'elastina, uno per serie di immagini di collagene, rispettivamente. Copiare gli stack immagine pertinente alle relative cartelle.
- Creare due nuovi progetti di Ilastik del software Ilastik, uno di elastina, uno per il collagene, rispettivamente.
- Aprire Ilastik | Creare nuovo progetto | classificazione di pixel | nuovo progetto | aggiungere dati e cartella Seleziona immagine creata al punto 8.2.
Nota: Seguire la procedura guidata di Ilastik.
- Aprire Ilastik | Creare nuovo progetto | classificazione di pixel | nuovo progetto | aggiungere dati e cartella Seleziona immagine creata al punto 8.2.
- Importare una serie di immagini 3D per addestrare il software.
- Selezionare l'applet Input dati | area di lavoro principale | Scheda di dati RAW | Aggiungi nuovo... | Aggiungere immagini separate e scegliere i dati di immagine desiderata
- Scegliere caratteristiche rilevanti del software.
- Aperto Selezione funzionalità applet | Selezionare la funzione che apre una nuova finestra di dialogo. Per dettagli, vedere Figura 5A .
- Aggiungere almeno due etichette utilizzando il pulsante Aggiungi etichetta sotto l'applet di formazione.
Nota: Ogni etichetta corrisponde a un tipo di oggetto che deve essere separato. In questo lavoro, tre etichette vengono utilizzate per l'elastina: elastina stessa, punti luminosi (da escludere) e lo sfondo (da escludere). - Disegnare le etichette in cima alla pila di immagine raw utilizzando il pennello di vernice in stile strumento di annotazione.
- Selezionare l'etichetta appropriata: scegliere lo strumento pennello e iniziare a disegnare.
- Richiesta Ilastik per analizzare la serie di immagini e cercare caratteristiche simili facendo clic su Attiva Live Update.
- Controllare attentamente la mappa di previsione (Figura 5).
Nota: Il processo da immagine raw a una mappa di pronostico completo è illustrato nella Figura 5. Ilastik usi la mappa di previsione per l'immagine del segmento dello stack secondo quale etichetta un pixel è più probabilità di essere associati (Figura 5). - Applicare una soglia.
- Selezionare soglia applet, scegliere un metodo appropriato, etichetta di ingresso, liscio, soglia e misura parametri di filtro e infine fare clic su Applica.
Nota: Questo separa le parti allo stesso modo con etichetta dell'immagine in oggetti discreti. Tessuto altamente connesso, come l'elastina e collagene non ha bisogno di essere separati, pertanto, viene applicata una soglia di 0,4 (l'impostazione predefinita è 0,5). Figura 5E e 5F illustrano il risultato dell'applicazione di una soglia.
- Selezionare soglia applet, scegliere un metodo appropriato, etichetta di ingresso, liscio, soglia e misura parametri di filtro e infine fare clic su Applica.
- Ripetere l'addestramento di Ilastik fino a quando il risultato è soddisfacente (solo elastina, rispettivamente del collagene è riconosciuto per le rispettive analisi).
- Passa frequentemente tra la formazione e segmentazione (e a volte anche la soglia) applet durante questo processo. Nella Figura 6è riportato un esempio dell'effetto di ri-formazione Ilastik.
- Batch di analizzare i dati di immagine simile: selezionare selezione dell'ingresso Pronostico batch e aggiungere i file pertinenti.
Nota: Il Ilastik è una collezione di serie di immagini 3D di pseudo - 1 bit (immagine maschere) con 0 (zero) che indica l'assenza di elastina (o collagene) e 1 (uno) che denota la presenza del presente documento di output (la profondità di bit effettivi è 8 bit). - Verificare i risultati per ogni serie di immagini confrontando visivamente le maschere di immagine e i file di immagine raw.
- Ottimizzare la maschera Ilastik (passaggi 8,4-8,9) e ri-analizzare qualsiasi serie di immagini con risultati insoddisfacenti.
- Calcolare la densità di volume di elastina e collagene da Ilastik immagine maschere utilizzando MATLAB
- Aprire MATLAB.
- Selezionare la cartella con ilastik immagine maschere in MATLAB "cartella corrente" finestra.
- Copiare lo script MATLAB da complementare 1 File nell'editor di MATLAB e salvare il codice come volumeCalculator.m nella cartella MATLAB sul disco rigido del computer.
- Immettere le dimensioni dei pixel e altezza in pixel delle linee di script
pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; micron di % * micron
pixelHeight = 0,9; micron % - Salvare lo script.
- Vai alla finestra di comando MATLAB e immettere "volumeCalculator (' percorso-to-data')" per caricare lo script.
- Fare clic su invio. Ogni immagine maschera ora è riassunta e moltiplicato per il volume (noto) pixel/voxel (dimensioni fisiche di un pixel moltiplicata per la risoluzione di z-axis). L'output da MATLAB è il volume totale di elastina e collagene in ogni serie di immagini.
- Salvare i risultati.
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Representative Results
Il myograph di pressione su misura per l'imaging utilizzato in questo lavoro è illustrato nella Figura 1. Un'attenzione particolare per la progettazione del myograph è stata pagata ai) camera con un piccolo volume (2 mL) e ii) la possibilità di posizionamento cannule vicino a e in parallelo con il fondo di vetro (Figura 1B). Parte inferiore della camera di misura 50 × 24 mm #1.5 vetrino coprioggetti (sostituibile). Il regolatore di pressione è stato costruito da una bottiglia di vetro 1L standard e uno sfigmomanometro (Bracciale rimosso). Per un setup di myograph con requisiti di flusso, è consigliato l'uso di un regolatore di pressione del servo.
La figura 2 illustra le posizioni consigliate per l'ottenimento di immagini singole e serie di immagini durante l'esperimento descritto nel protocollo. A scopo illustrativo, un immagine di microscopia chiara trasmissione dell'arteria montato è incluso nella Figura 2A. Nodo per nodo lunghezza dell'arteria montato è circa 1,6 mm. L'arteria viene sottoposto a scansione fino a quando il diametro più largo è osservato (Figura 2B), e a questo punto, il diametro e spessore della parete sono determinati (Figura 2). Allo stesso modo, un'immagine luminosa di trasmissione dell'arteria è incluso nel Figura 2D, indicante la posizione e larghezza degli stack immagine per determinare la microarchitetture di collagene (Figura 2E) ed elastina (Figura 2F, piccolo consigliata Piazza di Figura 2D) così come la serie di immagini per determinare il collagene (Figura 2) e la densità di elastina (Figura 2 H) volume (quadrato più grande, Figura 2D). Utilizzando questo approccio, dati per la costruzione di curve di pressione diametro, seguite dal calcolo delle curve sforzo-deformazione corrispondente possono essere ottenuti da misure di spessore di parete, diametro e pressione (Figura 2).
Una singola misura esponenziale del rapporto sforzo-deformazione secondo Bloksgaard et al. 13 e riferimento nel presente documento, fornisce il β-valore, una misura indipendente di geometria della rigidità di parete proporzionale al modulo elastico incrementale, Einc. Calcolo Einc presso le diverse pressioni alle quali immagini per collagene ed elastina sono stati ottenuti microarchitetture, consente un'analisi diretta della relazione tra i cambiamenti di pressione indotta in microarchitetture di collagene ed elastina ed il modulo elastico incrementale a pressioni diverse (Figura 3). La misurazione degli angoli ramificazioni IEL e rettilineità di collagene è illustrata nella Figura 4.
Importante per l'interpretazione dei dati meccanici confrontando due o più gruppi di interesse, ad esempio vs normotesi pazienti ipertesi, è la determinazione del contenuto di elastina e collagene. Per questo, un metodo di analisi automatica in Ilastik, un software di analisi di immagine freeware che può essere addestrato a riconoscere alcune caratteristiche dell'immagine, è stato sviluppato. Il flusso di lavoro in Ilastik è illustrato nella Figura 5.
Per il rilevamento automatico di elastina e collagene per le densità di volume, è importante che ci sia un buon rapporto segnale-rumore nelle immagini ottenute. In campioni umani, significativo autofluorescence da collagene è osservato spesso oltre al segnale SHG di collagene. Questo diminuisce il rapporto segnale-rumore per la rilevazione di elastina. La figura 6 illustra come ri-formazione del programma Ilastik può provocare migliore riconoscimento delle fibre di elastina sottile in un campione con autofluorescenza collagene significativo nel "verde" / canale di elastina. Se trapasso del segnale autofluorescenza nella scanalatura SHG del collagene è un problema, può aiutare a ottenere il segnale SHG utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione. Se il canale sanguina attraverso si verifica dopo colorazione con eosina, la concentrazione della soluzione applicata di eosina dovrebbe essere abbassata. Eosina è facilmente lavato fuori, così ripetuti lavaggi del campione macchiato possono diminuire il segnale troppo.
Figura 1 . Personalizzato costruito myograph di pressione per l'imaging di fluorescenza. (A) camera di aspersione con tubi capillari in vetro attaccato al micromanipolatori, che è montata su un trasduttore di forza (forza longitudinale). (B) 2 mL imaging camera. La flessione di 45° delle cannule facilita imaging mediante un microscopio invertito. Regolatore di pressione (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Combinato di strategia di formazione immagine di fluorescenza e di pressione myography. (A) immagine luminosa trasmissione dell'arteria con illustrazione di (B) la scansione di tutta la larghezza dell'arteria. Il collagene SHG è mostrato in verde ed elastina autofluorescence a magenta. (C). diametro del lume arterioso (qui 238 µm) e spessori di parete (qui 17 e 18 µm superiore e inferiore, rispettivamente) è determinato presso la regione equatoriale (più grande diametro osservata) dell'arteria. (D) trasmissione luce immagine dell'arteria con l'illustrazione della posizione della z-stack ottenuto a una scala di 10-50 µm per la determinazione di rettilineità di collagene (E), delle lamine elastiche interne gli angoli ramificazioni (F) e (G) z-stack ottenuto a un 50-100 µm scala per l'ottenimento di collagene ed elastina (H) densità di volume. Immagini B/c: altezza 300 µm (bar 20 µm), E/f: 50 x 50 µm (bar 10 µm), G/H 130 × 130 × 30 µm (bar = 30 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Microstrutturali cambia in adventitial collagene e la lamina elastica interna (IEL) e loro relazione con i moduli elastici incrementali della circonferenza a 20, 40 e 100 mmHg. (A) angoli di Branching delle fibre di elastina nella IEL. (B) rettilineità delle fibre del collagene adventitial vicino la lamina elastica esterna. p-valori e secondo valori di F sono stati determinati utilizzando misurazioni ripetute ANOVA unidirezionale: p/F-values r: 0.0014/24.18, b: 0.0002/37.38. Angoli di ramificazione (C) IEL nonlinearly correla con Einc. (D) rettilineità collagene correla linearmente con Einc. I dati sono mostrati come media ± SE. microstrutturali cambiamenti (A e B e assi x di C e D) sono stati determinati per 6 arterie di resistenza sottoposte a imaging vitale mentre Einc (C e D) è stato calcolato per 20 altre arterie sottoposti a pressione myography in standard myograph di pressione. Ogni arteria studiato era da un individuo diverso. Questa figura è stata modificata da Bloksgaard et al. 13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Illustrazione delle misurazioni di angoli ramificazioni IEL e rettilineità di collagene in Fiji. (A) IEL ramificazioni angoli manualmente sono contrassegnati e misurata utilizzando il tool di angolo di Fiji. (B) rettilineità collagene viene determinato utilizzando il plugin di Fiji neurone J come il rapporto tra la lunghezza di end-to-end di una fibra di collagene singolo tramite una linea retta (bianco) diviso per la lunghezza effettiva di end-to-end della fibra (arancione). Formato della barra: 20 µm.
Figura 5 . Flusso di lavoro Ilastik. (A) finestra di selezione funzione con l'indicazione delle caratteristiche selezionate. (B) esempio di immagine raw con etichette (C) per le fibre di elastina, punti luminosi (indesiderati) e sfondo evidenziato in rosso, verde e blu, rispettivamente. (D) con conseguente Mappa previsione per immagine (B) con etichette indicate in (C). (E) segmentazione basata sulla mappa previsione in (D) prima (E) e dopo (F) l'applicazione di una soglia di 0,5. Colore giallo Mostra i pixel collegati corrispondente alla caratteristica segregata (elastina). Formato della barra: 25 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Immagini di esempio prima e dopo l'ottimizzazione della previsione Ilastik mappa che mostra l'effetto di ri-formazione Ilastik per il riconoscimento delle fibre di elastina in un campione con fluorescenza di fondo alta da collagene (Sub-ottimo rapporto segnale-rumore). (A) immagine originale, (B) risultato della prima analisi di Ilastik, dove soprattutto le fibre di elastina sottile (a sinistra dell'immagine B) non sono inclusi nella segmentazione e risultato (C) finale dopo l'ottimizzazione della mappa previsione. Formato della barra: 25 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo lavoro rappresenta la nostra proposta per un standardizzato combinato imaging e pressione myography approccio, prezioso per la valutazione simultanea delle proprietà meccaniche di resistenza arterie e pressione relativi cambiamenti nella struttura dell'arterioso parete in un intervallo di pressione da 0 a 100 mmHg. L'approccio presentato è stato sviluppato utilizzando attrezzature costruzione personalizzata, tuttavia, può essere utilizzato qualsiasi myograph di pressione che si inserisce su un microscopio di fluorescenza del due-fotone eccitazione, quando permette la progettazione di attrezzature sia per formazione immagine della parete arteriosa. Dovrebbe prestare particolare attenzione alla forma, larghezza e distanza di lavoro dell'obiettivo e le condizioni in cui verrà eseguito l'imaging. Microscopi diritti richiedono l'uso di acqua immersione obiettivi, considerando che l'uso di obiettivi di immersione acqua è raccomandato per microscopi rovesciati evitare differenze di indici di rifrazione tra il campione e l'obiettivo. Inoltre, occorre prestare attenzione allo spessore del vetrino coprioggetto, applicando una correzione per una mancata corrispondenza tra l'obiettivo e il vetrino coprioggetti usando il collare di correzione sull'obiettivo (se presente) o abbinando lo spessore del vetrino coprioggetto con l'obiettivo utilizzato.
Nel protocollo descritto, è preso vantaggio di bassa energia, vicino infrarosso luce per imaging autofluorescence di elastina e collagene SHG. Questo consente di imaging per lunghi periodi di tempo. Nelle arterie di resistenza umana utilizzate in questo studio, la IEL è comprende una rete di fibra-like allineata longitudinalmente di elastina interconnessi fibre13,33, simile alla struttura di IEL di resistenza umana sottocutanea arterie (hSCA)38,39. Modifiche in angoli di ramificazione delle fibre di elastina nella IEL sono state valutate e utilizzate insieme a misure della sbobinatura graduale delle fibre del collagene adventitial con crescenti pressioni37 per valutare i cambiamenti nella microarchitettura di elastina e collagene rispettivamente. Immagini per la valutazione microarchitetture elastina e collagene sono stati ottenuti presso la stessa regione di interesse all'interno della parete arteriosa a pressioni diverse. Questo consente l'analisi di misurazioni ripetute. Quando possibile, l'investigatore potrebbe mirare ad ottenere immagini in almeno 3 regioni di interesse, con immagine dimensioni 10-50 µm in ogni dimensione. Tuttavia, a seconda del campione, soprattutto lo spessore della parete arteriosa, un compromesso deve essere fatta tra il numero delle regioni digitalizzate di interesse e la durata dell'esperimento fattibile. In caso di arterie di resistenza umana pericardico, le arterie sono rimanere vive per almeno 8-12 h di sperimentazione. Scansione di diverse regioni di interesse permette la valutazione della intra-versus variabilità inter-campione e favorisce così la conclusione sui risultati ottenuti.
È importante notare che per evitare di indurre danno fototossico, imaging utilizzando luce di eccitazione ad alta potenza dovrebbe essere evitato quando si lavora su campioni di tessuto vivo. Alla luce di ciò, si raccomanda di ottenere gli stack di grande immagine per collagene ed elastina densità di volume alla fine del protocollo sperimentale, in alternativa su campioni fissati. Quando le quantità assolute dei componenti ECM, qualsiasi effetto di fissativo sulle densità volume dovrebbe essere quantificato e preso in considerazione. Fissazione e permeabilizzazione delle arterie permette inoltre la macchiatura di bersagli intracellulari di interesse quando necessario. In questo protocollo, la macchiatura per elastina viene eseguita utilizzando eosina sull'arteria dal vivo. Macchiatura di elastina mediante sonde specifiche (ad es., alexa 633 idrazide maleica40) e collagene (ad es., CNA3541), può essere applicata insieme ad altre macchie (ad es., falloidina42) o del DNA, per facilitare la valutazione di densità volumetrica e organizzazione strutturale di altre strutture di interesse nella parete arteriosa. Questa opportunità può fornire laboratori di ricerca del singolo-fotone microscopi confocali un'opportunità per studiare i cambiamenti microstrutturali nelle arterie della resistenza. Segmenti dall'arteria stessa possono essere trattati in condizioni diverse, fisso sotto pressione e imaged in una fase successiva per confrontare l'effetto del trattamento applicato. Obiettivi di interesse devono essere visualizzati da imaging i vasi delle cannulate, ri-pressurizzati e macchiati. Quando i cambiamenti strutturali sono considerati, come elastina non può essere risolto e, quindi, sarà rinculo e alterano la struttura 3D dell'arteria fisso43,44, è necessario re-inserimento di una canula e ri-pressurizzazione. Lo svantaggio di determinare cambiamenti strutturali nelle arterie fisse è che parecchi segmenti devono essere fissati per il confronto e analisi di misurazione ripetuta non possono essere eseguite.
I dati ottenuti usando la formazione immagine è direttamente utilizzabile per calcolare le sollecitazioni di parete e supporto di capire la meccanica della parete vascolare, come descritto in Bloksgaard, M. et al.13. In questo lavoro, è stato applicato un modello matematico per caratterizzare la rigidità intrinseca dell'elastina e componenti del collagene della parete arteriosa e di stimare il collagene reclutamento ceppi45,46 sulla base di calcolo lo stress ceppo relazioni. La formazione immagine supportati i risultati dalla modellizzazione matematica, che il collagene nelle arterie della resistenza umana è stato già reclutato a bassa deformazione circonferenziale e stress di parete. Le misure quantitative della microarchitettura di elastina e collagene descritto in questo protocollo possono essere ulteriormente esteso, ispirato al vasto lavoro condotto su arterie carotiche6,8,47, 48 , 49 e aorta7,9,10,50,51: analisi supplementari possono includere la valutazione della distribuzione spaziale e la microarchitettura di collagene e fibre di elastina all'interno i diversi strati della parete arteriosa, nonché angoli di orientamento della fibra (orientamento rispetto all'asse longitudinale). Bell et al. 15 affrontato la riorganizzazione di pressione indotta del IEL e collagene adventitial compreso un modello analitico di multi-strato per calcolare la rigidezza e lo stress in ogni strato della parete arteriosa. Questi autori15 usato arterie di resistenza umana sottocutanea ottenute da volontari sani e struttura correlata e sottolinea muro alle 3 e 30 mmHg, rispettivamente.
Il metodo proposto in questo protocollo motiva si spera che ulteriori indagini e lo sviluppo di modelli matematici microstructurally motivati per comprendere le proprietà meccaniche delle arterie di resistenza umana nella salute e nella malattia. Con ulteriori modifiche del metodo per includere anche collagene ed elastina angoli di orientamento lungo l'asse longitudinale, muscolo liscio cellula densità di volume, distribuzione spaziale e l'orientamento all'interno della distribuzione di parete, collagene ed elastina arteriosa e orientamento in mezzi di tunica e organizzazione di elastina e distribuzione nel adventitia di tunica, i dati di imaging possono alimentare avanti sviluppo di modelli matematici, facilitare la comprensione del processo di rimodellamento in ipertensione, il diabete e la sindrome metabolica. Allo stesso modo, come suggerito da Chen e Kassab per la microcircolazione coronarica52,53, modelli basati su microstruttura delle arterie di resistenza umana possono fornire previsioni di risposte meccaniche arteriose presso il macro-(intera arteria) e micro-(structure) livelli meccanici per ciascun costituente. Tali modelli devono basarsi su dati quantitativi dei parametri strutturali e proprietà meccaniche dei singoli strati e costituenti nella parete arteriosa delle arterie provenienti da volontari sani e pazienti affetti da diverse patologie, ricezione di diversi trattamenti farmacologici. Dati vengono raccolti in un modo standardizzato e rispetto tra gli individui con diverso fattore di rischio, malattia e trattamento profili. Il metodo ha il potenziale per aiutare la comprensione come malattia e trattamenti medici colpiscono la microcircolazione umana.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il centro di Imaging biomedico di danese molecolare presso la facoltà di scienze naturali, Università della Danimarca meridionale, per l'utilizzo di laboratori e microscopi. Kristoffer Rosenstand e Ulla Melchior sono riconosciuti per l'eccellente assistenza tecnica con la pressione myography e imaging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Science Tools | 15401-12 | ||
| Fine Science Tools | 11251-23 | ||
| Nikon | SMZ800N | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose | |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | ||
| Smiths medical Intl, UK | |||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | ||
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | ||
| Mettler toledo | |||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | ||
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | ||
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | ||
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | ||
| Nikon | Custom built | ||
| Spectra Physics, Mountain View, CA | |||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | ||
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | ||
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | ||
| Scotch TM | |||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
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