Summary
Nous décrivons simultanée des essais mécaniques et 3D-imagerie de la paroi artérielle d’isolé, vivent les artères de la résistance humaine et des analyses d’image Fidji et Ilastik pour la quantification des densités de volume et d’organisation spatiales élastine et de collagène. Nous discutons de l’utilisation de ces données dans les modèles mathématiques de la mécanique de la paroi artérielle.
Abstract
La contribution de pathogène de résistance artère remodelage est documentée dans l’hypertension essentielle, le diabète et le syndrome métabolique. Enquêtes et le développement de modèles mathématiques microstructurally motivés pour comprendre les propriétés mécaniques des artères de résistance humain sain ou malade ont le potentiel pour aider à comprendre comment la maladie et les traitements médicaux effet sur la microcirculation humaine. Pour développer ces modèles mathématiques, il est essentiel de déchiffrer la relation entre les propriétés mécaniques et micro architecturale du mur microvasculaire. Dans ce travail, nous décrivons une méthode ex vivo pour essais mécaniques passives et simultanée exempte d’étiquette imagerie en trois dimensions de la microarchitecture d’élastine et de collagène dans la paroi artérielle des artères isolées de la résistance humaine. Le protocole d’imagerie peut être appliqué aux artères de résistance de toute espèce d’intérêt. Analyses d’image sont décrits pour quantifier les changements i) induit par la pression dans les angles de ramification de la limitante élastique interne et de la rectitude de collagène adventitiels à l’aide de Fidji et des densités de volume ii) collagène et d’élastine, déterminées à l’aide du logiciel Ilastik. Préférence toutes les mesures mécaniques et d’imagerie sont effectuées sur les routes de live, perfusés, cependant, est une approche alternative à l’aide de pression standard de vidéo-microscopie myographie en combinaison avec l’imagerie après fixation de re-pressurisés discutés. Cette méthode alternative offre aux utilisateurs des options différentes pour les approches de l’analyse. L’inclusion des données mécaniques et d’imagerie dans les modèles mathématiques de la mécanique de la paroi artérielle est discutée, et développement futur et ajouts au protocole sont proposées.
Introduction
La contribution pathogène et les effets du remodelage de l’artère de résistance sont documentées dans l’hypertension essentielle, le diabète et le syndrome métabolique1,2,3,4,5. Déchiffrer la relation entre les propriétés mécaniques et micro architecturale du mur microvasculaire est essentiel pour le développement de modèles mathématiques de cette association. Ces modèles seront mieux comprendre le processus de remodelage et soutiennent le développement de modèles de silico utile pour tester des stratégies pharmacologiques ciblant des maladies liées de remodelage de la paroi artérielle.
Études préalables porté à comprendre comment la microarchitecture de la paroi artérielle est liée à la mécanique de la paroi artérielle en incorporant des mesures mécaniques et la microarchitecture de la matrice extracellulaire (ECM) sont presque exclusivement réalisées sur les grands , les artères élastiques conduit des souris ou porcine6,7,8,9,10,11. Imagerie des microstructures de la paroi est généralement effectuée à l’aide des techniques optiques non linéaires, profitant de l’autofluorescence d’élastine et de deuxième génération harmonique de collagène. Cela permet l’imagerie spatio-temporelle des deux principales composantes de la matrice extracellulaire, élastine et du collagène, sans une nécessité pour la coloration. Imagerie de la paroi artérielle dans toute son épaisseur est un défi dans les artères de gros conduits en raison de la dispersion de la lumière dans les médias de tunica épais. Toutefois, pour déterminer comment la microarchitecture des composantes structurales de la paroi artérielle portent sur les propriétés mécaniques observées, informations en trois dimensions doivent être obtenues pendant l’essai mécanique. Pour les grosses artères comme l’aorte humaine, cette opération requiert biaxial montage, les essais mécaniques et imagerie des régions d’intérêt en morceaux2 1-2 cm de la paroi artérielle7,9,10, 12. qu’une partie de la paroi peut être imagée et testée mécaniquement.
Pour les plus petites artères de toute espèce (par exemple, péricardique humaine13, pulmonaire14 et les artères sous-cutanées15 , rat artères mésentériques16,17,18, 19 , 20, souris cremaster, mésentérique, cérébrale, fémorale et artères carotides21,22,23,24,25,26, 27) imagerie de l’épaisseur du mur entier est possible et peut être combinée avec les essais mécaniques. Cela permet l’enregistrement simultané des propriétés mécaniques et les arrangements structurels au sein de la paroi. Toutefois, une modélisation mathématique directe de la relation entre les altérations observées dans la structure tridimensionnelle de l’ECM et modifié les propriétés mécaniques de la paroi artérielle de résistance, au meilleur de nos connaissances seulement signale à récemment dans les artères de la résistance humaine13,15.
Dans ce travail, on décrit une méthode de ex vivo pour essais mécaniques passives et une imagerie tridimensionnelle simultanée de la microarchitecture d’élastine et de collagène dans la paroi artérielle des artères isolées de la résistance humaine. Le protocole d’imagerie peut être appliqué aux artères de résistance de toute espèce d’intérêt. Analyses d’image sont décrits pour l’obtention de mesures des angles de ramification de la limitante élastique interne et de rectitude de collagène adventitiels13 à l’aide de Fidji28. Les densités de volume collagène et d’élastine sont déterminées au moyen de logiciels Ilastik29 et enfin, on discute de l’inclusion des données mécaniques et d’imagerie dans les modèles mathématiques de la mécanique de la paroi artérielle.
Le but de décrire les analyses de l’imagerie et l’image en combinaison avec la modélisation mathématique des techniques consiste à fournir aux enquêteurs une approche systématique pour décrire et comprendre la pression induite par changements observés dans l’ECM des artères de résistance. La méthode décrite vise à quantifier les changements dans l’ECM dans un récipient pendant la pressurisation, en comparant la structure de l’ECM à 20, 40 et 100 mmHg. Ces pressions ont été retenues pour la détermination de la structure de la paroi artérielle plus dociles (20 mmHg), raide (100 mmHg) et un état intermédiaire de (40 mmHg), respectivement. Cependant, tout processus dans la paroi vasculaire des artères vivants, y compris les changements induits par les composants vasoactifs, hystérésis et flux, peut être quantifié, selon l’hypothèse de recherche en question par l’enquêteur.
L’utilisation de la microscopie de fluorescence excitation biphotonique (TPEM) en combinaison avec un myographe pression pour étudier la pression (ou autre) induit des changements dans l’ECM des artères direct est mis en valeur. Tout d’abord, parce que cela permet une acquisition simultanée de la structure tridimensionnelle dans l’ensemble de la paroi artérielle (diamètre et épaisseur de paroi) ainsi que l’acquisition de label-free tridimensionnelle de haute qualité, des images de la collagène et d’élastine détaillées microarchitectures comme décrit13 en profitant de l’autofluorescence élastine et le collagène deuxième génération harmonique signal (SHG)30. Deuxièmement, TPEM permet d’utilisation de la lumière d’excitation proche-infrarouge de faible énergie, minimiser le photovieillissement du tissu et ainsi, l’imagerie répété à exactement la même position dans la paroi vasculaire est autorisée, permettant des analyses répétées-Mensurations d’observé changements.
L’utilisation d’une approche alternative à l’aide de l’imagerie confocale de pression fixé des artères est discutée pour permettre aux utilisateurs sans accès à TPEM l’occasion d’utiliser la méthode décrite aussi bien. Informations sur la structure et le volume des densités ECM peuvent également être récupérées de l’analyse bidimensionnelle des tissus sectionnés en série, par exemple, tel que décrit par31,32. Toutefois, en raison de l’absence de possibilité de récupérer des informations structurelles en trois dimensions sur les échelles de longueur de l’artère ainsi qu’au cours de l’évolution des conditions à l’aide de cette méthode, il est déconseillé d’utiliser cette approche pour les enquêtes de pression et traitement induit des changements en trois dimensions de la MEC.
L’exigence minimale pour l’enquêteur d’appliquer la méthode décrite ci-après est l’accès à un programme d’installation pour canulation et la pressurisation des artères en combinaison avec un microscope à fluorescence excitation confocal ou deux photons. La configuration décrite dans le protocole suivant est un myographe pression sur mesure avec un capteur de force longitudinale, construit pour s’adapter sur un microscope à fluorescence personnalisé excitation construit à deux photons inversé.
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Protocol
Collection des biopsies du péricarde pariétal humain destiné à ces travaux ont été effectuée après consentement éclairé, comme précédemment décrit33. L’étude de tissus humains sont conformes aux principes énoncés dans la déclaration d’Helsinki34 et a été approuvé par les comités régionaux sur l’éthique de la santé recherche pour Southern Denmark (S-20100044 et S-20140202) et l’Agence danoise de Protection des données.
1. récupérez le tissu et l’artère de résistance isolat (homme)
- Recueillir des échantillons de tissus d’intérêt immédiatement après l’excision pendant une intervention chirurgicale. Transfert du tissu à 4 ° C HEPES physiologique solution saline tamponnée (HBS) immédiatement après la collecte et la stocker dans HBS.
Remarque : Les tissus humains sont seulement collectées après l’approbation par commissions institutionnelles et éthiques, mais aussi écrit le consentement éclairé des patients. Composition de HBS en mM : 144 de NaCl, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, HEPES 14,9, glucose 5.5. Ajuster le pH 7,4 avec NaOH et filtre la solution bien que 0,2 µm. - Laissez les tissus prélevés en HBS stérile à 4 ° C durant la nuit pour laver des anesthésiques.
Remarque : Aucun effet de stockage pendant la nuit sur l’intégrité du navire et de la fonctionnalité doit être vérifiée par le laboratoire de recherche individuelles. - Isoler soigneusement les artères de résistance de taille (diamètre du lumen ± 200 µm) à l’aide d’une paire de sharp-tip pinces et ciseaux micro-dissection.
- Stocker les artères à 4 ° C en HBS glacée tout en amorçant la chambre de pression/imagerie.
2. monter l’artère isolée dans la pression myographe
- Monter les canules de verre d’un diamètre de pointe d’environ 80 µm sur les détenteurs de canules. Positionner le µm conseils environ 150 au-dessus du fond de verre de chambre.
NOTE : canules de 45° pointe plié peuvent permettre un positionnement précis du navire au-dessus du fond de verre. - Remplissez les deux entrée puis le tube de sortie avec HBS avec 1 % de BSA et connecter au système de pression.
NOTE : BSA est inclus afin de préserver la fonction des cellules endothéliales. - Monter l’artère isolée à l’aide de deux sutures double noeud par la canule.
Remarque : Les noeuds peuvent être préparés à l’avance et stockés sur double ruban adhésif jusqu'à ce que nécessaire. - Remplir la chambre avec HBS et placer deux doubles noeuds sur chaque canule de verre.
Remarque : Lorsque vous utilisez des artères affichant un tonus myogène, HBS remplacer avec le calcium que libre HBS additionné de 3 µM EGTA et 3 µM nitroprussiate de sodium. - Tenir l’artère doucement à une extrémité à l’aide de deux paires de pinces à bout pointu. Ouvrez la lumière de l’artère et faire glisser doucement sur la canule. Difficulté sur la canule à l’aide de deux noeuds.
- Appliquer une pression de 5 mmHg pour rincer délicatement la lumière avec HBS / 1 % BSA.
- Canule dans l’autre extrémité de l’artère et fixez-le sur la canule à l’aide de deux doubles noeuds.
- Transférer le myographe sur la platine du microscope et pressuriser l’artère à 5 mmHg (pression d’entrée = pression de sortie), puis chauffer jusqu'à 37 ° C pendant 30 min.
- Facultatif : Calibrer le capteur de force longitudinale selon les instructions du fabricant (1 g = 9.81 mN).
Remarque : Il est essentiel d’étalonner le capteur de force après qu’il est sensible à la température de chauffage.
3. réaliser l’expérience : Imagerie du diamètre artériel, épaisseur de paroi et le collagène et élastine Microarchitecture utilisant TPEM
- Analyser rapidement l’artère canulée sous pressurisé à 5 mmHg avec un objectif 20 X (ouverture numérique (NA) ≥ 0,8) et la lumière d’excitation faible puissance afin d’évaluer le navire diamètre et épaisseur de paroi à 5 mmHg.
Remarque : Pour des microscopes inversés, utiliser un objectif à immersion d’eau ; pour les microscopes verticale, utilisez une eau trempage objectif. Si l’objectif n’a pas un collier de correction pour corriger pour l’épaisseur de la lamelle couvre-objet, assurez-vous de faire correspondre la lamelle couvre-objet utilisé avec l’objectif utilisé. Les paramètres du logiciel et les descriptions peuvent varier selon l’utilisateur-interphase et le microscope et le logiciel utilisé.- Configurer le chemin optique.
- Activer Mai Tai deux photons laser et placez-le à la lumière d’excitation 820 nm.
ATTENTION : Éviter toute exposition à une lumière laser visibles mais aussi invisibles. - Recueillir des émissions simultanément dans les deux canaux. Split d’émission lumineuse entre le Photomultiplier utilisant un miroir dichroïque de longue passe nm et une émission virée à l’aide de filtres à large bande passante 30-60 nm centrées à 520 460 nm (élastine) et 410 nm (collagène), respectivement.
- Activer Mai Tai deux photons laser et placez-le à la lumière d’excitation 820 nm.
- Activer l’analyse continue avec 10 µs laser dwell time/pixel et 512 × 512 pixels pour 100 % de champ.
- Parcourir manuellement l’artère pour déterminer la profondeur où le diamètre maximum est observé.
- Choisissez une tranche rectangulaire couvrant les plus large diamètre de l’artère et analyser une seule image avec taille ≤ 300 nm/pixels (Figure 2). Utilisation comme puissance lumineuse faible excitation et temps de pause de pixel que possible pour éviter le photodamaging l’artère direct.
Remarque : Il est recommandé d’obtenir une forme rectangulaire, par exemple., 100 × 1024 pixels image, plutôt qu’une image quadratique à cette position pour gagner du temps et de limiter l’exposition de photon de tissus (Figure 2). - Enregistrer l’image pour des analyses ultérieures.
- Configurer le chemin optique.
- Déterminer le lumen diamètre et épaisseur de paroi au diamètre maximal de l’artère.
- Charger l’image dans les îles Fidji.
- Définissez l’échelle en cliquant Main menu | Analyser | Définissez l’échelle et entrez les taux µm/pixel et les pixels (il est fortement recommandé de garder le pixels 1:1).
- Choisissez l’outil de ligne de Fidji et tracer une ligne entre les deux lamelles élastiques internes de chaque côté de la lumière artérielle et cliquez sur ctrl + M. Fidji des rapports longueur comme valeur par défaut dans le tableau de résultats.
- De même, tracer des lignes plus pour mesurer l’épaisseur de chaque paroi et cliquez sur ctrl + M pour mesurer le balisage suivant.
- Enregistrer les mesures.
- Image de collagène et élastine microarchitecture à 5 mmHg en balayant toute l’épaisseur de la paroi artérielle, obtenir des piles d’image 3D de bonne qualité pour 1-3 régions d’intérêt le long de l’artère.
- Obtenir des piles d’image par le biais de toute la paroi de l’artère à l’aide d’un 60 X objectif, NA ≥ 1, tailles pixel optimisée et z-espacement.
- Calculer les conditions optimales d’imagerie (tailles de pixel et l’espacement de z-étape) conformément à la voie optique, milieu d’immersion et dégustez les indices de réfraction à l’aide de la calculatrice scientifique Volume d’imagerie Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator).
Remarque : Faites attention ici à la différence entre la taille des pixels optimale et z-espacement par rapport à l’avis à la section 3.4. plus haut sur l’utilisation d’un format de pixel maximum .
- Calculer les conditions optimales d’imagerie (tailles de pixel et l’espacement de z-étape) conformément à la voie optique, milieu d’immersion et dégustez les indices de réfraction à l’aide de la calculatrice scientifique Volume d’imagerie Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator).
- Utilisez les mêmes paramètres d’excitation et d’émission que ci-dessus (3.1.1.).
- Analyser rapidement la paroi des vaisseaux tel que décrit ci-dessus pour déterminer l’épaisseur de la pile-z.
- Définir le début de z-pile et la profondeur de la fin, l’espacement z-étape et la densité de pixels (calculé en 3.3.1.1.) et effectuer le z-scan. Enregistrez chaque canal séparément.
Remarque : Les Images doivent être assez petits par exemple 30 x 30 µm ou 50 × 50 µm selon la taille du navire pour éviter toute influence de courbure dans les analyses subséquentes d’image.
- Obtenir des piles d’image par le biais de toute la paroi de l’artère à l’aide d’un 60 X objectif, NA ≥ 1, tailles pixel optimisée et z-espacement.
- Déterminer le diamètre artériel, l’épaisseur du mur et microarchitecture élastine et de collagène à des pressions restantes du protocole.
- 3.1 ou 3.2 à pressions 10 et 20 mmHg de répéter, répéter 3,3 à pression 20 mmHg.
- Répétez les points 3.1 et 3.2 à 40 mmHg de pression.
- 3.1 ou 3.2 à pressions, 60, 80 et 100 mmHg de répéter et répéter 3,3 à 100 mmHg.
NOTE : 3.1 à 3.3 peuvent être répétées pour toutes les pressions et les combinaisons des pressions (par exemple une série/combinaison de pressions ainsi que diminue croissantes), selon l’hypothèse à tester. Éosine concentration 0,3 - 1 µM peuvent être ajoutés pour améliorer l’élastine autofluorescence dans le cas de photoblanchiment. Photoblanchiment peut être évité en appliquant comme excitation faible puissance légère que possible. - Remplacez la mémoire tampon dans la chambre myographe frais 37 ° C HBS après chaque étape de la pression. Permettre l’artère s’adapter pendant 5 min avant l’imagerie après chaque changement de pression.
- Stocker les piles de canaux séparément pour les analyses de l’image.
- Tester la viabilité de l’artère.
- Appliquer 10 µM U46619 dans la chambre myographe suivie par l’ajout de 10 bradykinine µM lorsqu’on observe une constriction stable.
- Enregistrer le diamètre et épaisseur de paroi comme décrit ci-dessus dans la section 3.1, suite à la demande de chacun des composés.
- Ajouter 3 µM nitroprussiate de sodium lorsque l’artère n’est pas entièrement dilatée après l’addition de la bradykinine et enregistrement diamètre et épaisseur de paroi.
Remarque : En fonction des propriétés pharmacologiques de l’artère d’intérêt (lit vasculaire et espèces) autres vasoconstricteur et vasodilatateur (endothélium-dépendante) composés utilisables.
- Facultatif : Fixer l’artère sous pression ou continuer avec l’imagerie de collagène et d’élastine pour des densités de volume (étape 7).
- Ajoutez 4 % de formaldéhyde dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 ° C pendant 1 h.
- Laver l’artère fixe trois fois dans du PBS 1 x et faites doucement glisser l’artère hors les canules, touchant uniquement les parties de l’artère en dehors des noeuds. Ne pas enlever les noeuds, utilisez-les pour tenir l’artère lors du transfert à un tube de rangement.
- Magasin à 1 x PBS / 0,05 % d’azide de sodium à 4 ° C jusqu'à ce que l’imagerie de l’élastine et le collagène des densités de volume ou d’autres fins.
NOTE : Artères fixes peuvent être conservés pendant au moins 3 mois dans 1 x PBS / 0,05 % d’azide de sodium à 4 ° C.
4. calcul du Stress relations de souche et rigidité intrinsèque mur
- S’il vous plaît suivre les formules et les étapes de calcul pour le calcul des contraintes, souches et la raideur de mur tel que décrit par Bloksgaard, M. et al. 13 et les références dans les présentes.
5. image Analysis - Angles de ramification de IEL (limitante élastique interne)
- Pile d’ouvrir l’image dans les îles Fidji. Allez dans fichier | ouvrir l’image pour sélectionner image ensemble.
NOTE : Les projections intensité Max consécutif de 2-7 z-sections couvrant la Lei (1-2 µm d’épaisseur) sont utilisées pour déterminer les angles IEL élastine fibres ramifiées à l’aide de l’outil angle à Fidji28,35. Reportez-vous à la Figure 4 a à titre d’illustration. - Aller à Image | piles | projet z... de choisir les images et la « Projection d’intensité Max ».
- Enregistrez la projection de l’intensité max sous TIFF.
- Choisissez autant bifurcations IEL fibre possible à l’aide de l’outil « angle » et systématiquement à travers les images. Cliquez sur ctrl + M pour mesurer chaque angle.
- Enregistrer la feuille de résultats de Fidji.
6. image Analysis - collagène adventitiels ondulation
- Pile d’ouvrir l’image dans les îles Fidji. Allez dans fichier | ouvrir image pour sélectionner image ensemble.
NOTE : Max projections d’intensité de 2-7 consécutives z-sections portant sur le droit de collagène à l’extérieur de la limitante élastique externe (anguille, 1-4 µm d’épaisseur) sont utilisés pour déterminer ondulation de collagène utilisant le plugin de Fidji NeuronJ36 tel que décrit par Rezakhaniha, R . et al. 37 (Figure 4 b). - Définissez l’échelle. Allez dans analyser | définissez échelle d’entrer les dimensions en pixels.
- Aller à Image | piles | projet z... de choisir de travailler avec des images et « Projection d’intensité Max ».
- Modifier le type d’Image à 8 bitt TIFF en cliquant sur Image | type | 8 bitt et enregistrez la projection de l’intensité max sous TIFF.
- Mesurer la rectitude de fibres de collagène en utilisant le Plugin de J de neurone de Fidji.
- Ouvrez le plugin NeuronJ en cliquant sur Fidji | Plugins | Neurone J.
- Ouvrir les 8 bits TIFF dans NeuronJ en cliquant sur charger l’Image | Sélectionnez le fichier.
- Cliquez sur Ajouter des calques, puis sélectionnez les fibres à analyser en cliquant sur le début et la fin de chaque fibre.
- Cliquez sur les tracés de mesure, choisissez afficher le suivi (Lf) et mesures de vertex dans la boîte de dialogue.
- Calculer L0/Lf dans excel (ou similaire) et enregistrer les résultats.
- Copiez et collez des Fidji neurone J tracés et sommets sortie vers excel (ou similaire) et calculer L0 en utilisant le théorème de Pythagore partir des mesures du sommet. Premier et dernier point à la ligne indiquent les positions des extrémités de l’hypoténuse dans un système de coordonnées 2D.
Remarque : Un L0/Lf [longueur de bout à bout de bundle de fibre de collagène via une ligne droite (L0) / pleine longueur (Lf)] proche de 1 indique une fibre de collagène presque rectiligne.
- Copiez et collez des Fidji neurone J tracés et sommets sortie vers excel (ou similaire) et calculer L0 en utilisant le théorème de Pythagore partir des mesures du sommet. Premier et dernier point à la ligne indiquent les positions des extrémités de l’hypoténuse dans un système de coordonnées 2D.
7. imagerie de collagène et d’élastine Volume densités
- Laver l’artère (fixe) 1 x dans du PBS et souiller pendant 15 min dans 1 Eosine µM dans du PBS 1 x dans l’obscurité. Pour les artères fixes, effectuez cette étape à la température ambiante.
NOTE : Éosine améliore la fluorescence de l’élastine. Éosine souillera autres structures telles que le collagène et le cytoplasme de la cellule si l’échantillon est laissé dans la solution colorante pendant de longues périodes. Si la coloration des autres structures est trop intense, abaisser la concentration de l’éosine à 0,3 µM ou répéter le lavage. - Laver l’artère 3 x dans du PBS 1 x
- Pour les artères fixes : monter l’artère pour l’imagerie.
ATTENTION : Imagerie des vaisseaux non pressurisés ne permet pas de récupérer des informations quantitatives géométriques. Lorsque les quantités absolues sont nécessaires, ceux-ci devraient provenir toujours sur les routes de direct et sous pression. Ratios de volume peuvent être obtenus sur les artères non pressurisés avec cette méthode.- Placer deux morceaux d’adhésif double bande 1 à 1,5 cm de distance sur un objet de verre. Ruban adhésif double est environ 100 µm d’épaisseur. Appliquer une ou plusieurs couches de ruban pour correspondre au diamètre de l’artère à monter.
- Placer 10-20 µL de PBS sur le verre au milieu de la place et l’artère dans le menu déroulant de PBS.
Remarque : La goutte doit être aussi petit et plat que possible pour éviter de pousser l’artère hors de position lors du montage de la lamelle couvre-objet. - Placez le couvre-objet et appuyez sur double ruban adhésif.
- Remplissez le réservoir entre la lamelle couvre-objet et l’objet verre avec 1 x PBS. Remplir toutes les heures pour éviter le séchage de l’échantillon.
- Pour les artères fixes : monter l’artère pour l’imagerie.
- Obtenir des piles d’image pour le collagène et l’élastine densités de volume avec un objectif 20 X NA > 1 afin de couvrir autant de la paroi artérielle que possible tout en ayant une bonne résolution optique (Figure 2D, 2 G et 2 H).
Remarque : Utilisez un objectif à immersion d’eau pour l’imagerie des artères fixes sous un lamelle couvre-objet et un pendage objectif pour l’imagerie des artères vitales de l’eau. Si l’objectif n’a pas un collier de correction pour corriger pour l’épaisseur de la lamelle couvre-objet, assurez-vous de faire correspondre la lamelle à l’objectif. Utilisez de préférence des tailles de pixel optimale et z-espacement. Calculer celles-ci à l’aide de la calculatrice de Nyquist (étape 3.3.1.1.). Sinon, utilisez une taille de pixel minimum de 300 nm et z-espacement de 1 µm. Il est recommandé d’obtenir trois images sur toute la longueur de l’artère pour permettre à l’utilisateur de déterminer la variabilité intra-essai. - Élastine d’image à l’aide de 820 nm excitation lumineuse et virés d’émission à l’aide de filtre un passe-bande large de 30 à 60 nm centrée à 520 nm.
- Collagène d’image à l’aide de 990 lumière d’excitation nm pour éviter toute excitation de l’élastine et autres protéines auto-fluorescente et collecter des émissions à l’aide du filtre passe-bande large de 10 à 30 nm centrée à 495 nm.
- Enregistrer image de chaque canal séparément sous forme de fichiers TIFF
8. image Analysis pour extraire l’élastine et le collagène des densités de Volume à l’aide de Ilastik
- Convertir des piles d’image TIFF à HDF5 utilisant les Fidji28,35 en cliquant sur choisir fichier | Enregistrer sous... HDF5.
- Créez deux dossiers de fichiers de données sur le disque dur de l’ordinateur, un d’élastine, pour piles de collagène d’image, respectivement. Copiez piles image pertinente dans le dossier approprié.
- Créez deux nouveaux projets de Ilastik dans le logiciel Ilastik, l’un de l’élastine, une pour le collagène, respectivement.
- Ouvrez Ilastik | Créer le nouveau projet | classification des pixels | nouveau projet | Ajouter des données et sélectionnez l’image dossier créé à l’étape 8.2.
Remarque : Suivez l’Assistant de Ilastik.
- Ouvrez Ilastik | Créer le nouveau projet | classification des pixels | nouveau projet | Ajouter des données et sélectionnez l’image dossier créé à l’étape 8.2.
- Importer une pile d’image 3D pour former le logiciel.
- Sélectionnez l’applet Input Data | zone d’espace de travail principal | Onglet de données brute | Ajouter un nouveau... | Ajouter des images séparées et choisir les données d’image souhaitée
- Choisissez les fonctionnalités pertinentes dans le logiciel.
- Applet de sélection des fonctionnalités ouverte | Sélectionnez la fonction qui ouvre une nouvelle boîte de dialogue. Pour plus d’informations, voir Figure 5 a .
- Ajouter au moins deux étiquettes en utilisant le bouton Ajouter Label dans l’applet de formation.
Remarque : Chaque étiquette correspond à un type d’objet qui doit être séparé. Dans cet ouvrage, trois étiquettes servent d’élastine : l’élastine lui-même, les points lumineux (à exclure) et l’arrière-plan (à exclure). - Dessiner des étiquettes sur le dessus de la pile d’images raw à l’aide du pinceau, outil d’annotation de style.
- Sélectionnez l’étiquette appropriée : cliquez sur l’outil pinceau et commencer à dessiner.
- Invite Ilastik à analyser la pile d’image et de chercher des biens similaires en cliquant sur Activer Live Update.
- Vérifiez soigneusement la carte de prédiction (Figure 5).
NOTE : Le processus de l’image raw à une carte de prévision complet est présenté dans la Figure 5. Ilastik utilise la pile de la carte de prédiction pour segmenter l’image selon quel label un pixel est plus susceptible d’être lié (Figure 5). - Appliquer un seuil.
- Sélectionnez l’applet de seuillage, choisir une méthode appropriée, lisse, étiquette d’entrée, seuil et taille des paramètres de filtre et enfin cliquez sur appliquer.
Remarque : Ceci sépare les parties de même marqués de l’image en objets distincts. Tissu très connecté, comme l’élastine et le collagène n’a pas besoin d’être séparés, par conséquent, un seuil de 0,4 est appliqué (la valeur par défaut est 0,5). Figure 5E et 5F illustrent le résultat de l’application d’un seuil.
- Sélectionnez l’applet de seuillage, choisir une méthode appropriée, lisse, étiquette d’entrée, seuil et taille des paramètres de filtre et enfin cliquez sur appliquer.
- Répétez la formation des Ilastik jusqu'à ce que le résultat est satisfaisant (seulement élastine, collagène respectivement est reconnu pour l’analyse).
- Fréquemment les applets de basculer entre la formation et de Segmentation (et parfois aussi le seuillage) au cours de ce processus. Un exemple de l’effet de re-formation Ilastik est illustré dans la Figure 6.
- Lot analyser les données d’image similaire : sélectionnez sélection d’entrée de prédiction par lot et ajoutez les dossiers pertinents.
Remarque : Le Ilastik de sortie est une collection des piles de 3D image de pseudo - 1 bit (masques d’images) par 0 (zéro) qui dénote l’absence d’élastine (ou collagène) et 1 (un) qui dénote la présence présentes (la profondeur binaire réel est 8 bits). - Vérifier les résultats pour chaque cheminée image de comparer visuellement les masques d’image et les fichiers image raw.
- Optimiser le masque de Ilastik (étapes 8,4 8,9) et réanalyser tout piles d’image avec des résultats insatisfaisants.
- Calculer des densités de volume élastine et de collagène de masques d’images de Ilastik à l’aide de MATLAB
- Ouvrir MATLAB.
- Sélection d’un dossier avec des masques d’image ilastik dans MATLAB « dossier en cours » fenêtre.
- Copiez le script MATLAB entre1 fichier complémentaire à l’éditeur de MATLAB, puis enregistrez ce code comme volumeCalculator.m dans le dossier MATLAB sur le disque dur de l’ordinateur.
- Entrez les tailles de pixels et hauteur en pixels dans les lignes de script
pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000 ; micron % * micron
pixelHeight = 0,9 ; micron % - Enregistrez le script.
- Allez dans la fenêtre de commande MATLAB et entrez « volumeCalculator (« chemin-de-data') "pour charger le script.
- Cliquez sur Entrez. Chaque masque de l’Image est maintenant résumer et multiplié par le volume (connu) pixel/voxel (dimensions physiques d’un pixel multiplié par la résolution de l’axe z). La sortie de MATLAB est le volume total d’élastine et de collagène dans la pile de chaque image.
- Enregistrer les résultats.
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Representative Results
Le myographe pression sur mesure pour l’imagerie utilisée dans ce travail est montré dans la Figure 1. Une attention particulière pour la conception de la myographe a été versée à i) la chambre avec une petite quantité (2 mL) et ii) la possibilité pour le positionnement des canules proche et en parallèle avec le fond de verre (Figure 1 b). Le fond de la chambre correspond à un 50 × 24 mm #1.5 verre couvre-objet (remplaçable). Le régulateur de pression a été construit une bouteille en verre 1 L standard et un sphygmomanomètre (brassard enlevé). Pour une configuration myographe avec exigences de débit, l’utilisation d’un contrôleur de pression de servo est recommandée.
La figure 2 illustre les positions recommandées pour obtenir des images uniques et piles d’image pendant l’expérience décrite dans le protocole. À des fins d’illustration, une image de microscopie de transmission de l’artère montée est incluse dans la Figure 2 a. Noeud à noeuds longueur de l’artère monté soit environ 1,6 mm. L’artère est analysée jusqu'à ce que le diamètre plus large est observé (Figure 2 b), et à ce stade, le diamètre et épaisseur de paroi sont déterminés (Figure 2). De même, une image lumineuse de transmission de l’artère est incluse dans la Figure 2D, montrant la position et recommandée largeur des piles pour la détermination des microarchitectures de collagène (Figure 2E) et d’élastine (Figure 2F, petite image place à la Figure 2D) ainsi que les piles d’image pour déterminer le collagène (Figure 2) et les densités de volume d’élastine (Figure 2 H) (grand carré, Figure 2D). En utilisant cette approche, les données permettant de construire les courbes de diamètre de pression, suivies par le calcul des courbes effort-déformation correspondante peuvent être obtenues de pression, diamètre et mur mesures d’épaisseur (Figure 2).
Un ajustement exponentiels unique de la relation contrainte-déformation selon Bloksgaard et al. 13 et les références dans les présentes, fournit la valeur β, une mesure indépendante de géométrie de la rigidité du mur proportionnelle à l’élasticité progressive, Einc. Calculer Einc sur les différentes pressions, quelles sont les images de collagène et d’élastine microarchitectures ont été tirées, permet une analyse directe de la relation entre les changements de pression induite dans le microarchitectures de collagène et d’élastine et le module élastique incrémentiel à différentes pressions (Figure 3). La mesure des angles de ramification IEL et de rectitude de collagène est illustrée à la Figure 4.
Il est importante pour l’interprétation des caractéristiques mécaniques en comparant deux ou plusieurs groupes d’intérêt, par exemple vs normotendus patients hypertendus, une détermination de la teneur de l’élastine et de collagène. Pour ce faire, une méthode d’analyse automatique dans Ilastik, un logiciel d’analyse image freeware qui peut être formé à reconnaître certaines caractéristiques de l’image, a été mis au point. Le flux de travail en Ilastik est illustré à la Figure 5.
Pour la détection automatique d’élastine et de collagène pour les densités de volume, il est important qu’il y a un bon rapport signal-bruit dans les images obtenues. Dans des échantillons humains, autofluorescence importante de collagène est souvent observé en plus le signal SHG de collagène. Cela diminue le rapport signal-bruit pour la détection de l’élastine. La figure 6 illustre comment re-formation du programme Ilastik produisent des meilleure reconnaissance des fibres d’élastine mince dans un échantillon avec autofluorescence collagène significative dans le « vert » / canal de l’élastine. Si le cordeau du signal autofluorescence dans le canal SHG de collagène est un problème, obtenir le signal SHG en utilisant une plus longue longueur d’onde d’excitation peut aider. Si le canal déteigne survient après coloration à l’éosine, la concentration de la solution appliquée de l’éosine devrait être abaissée. Éosine se lave facilement avec, donc les lavages répétés de l’échantillon coloré peuvent diminuer le signal trop.
Figure 1 . Myographe pression pour l’imagerie de fluorescence sur-mesure. (A) chambre de perfusion avec des capillaires en verre attaché aux micromanipulateurs, qui est montée sur un capteur de force (force longitudinale). (B) 2 mL chambre d’imagerie. La courbure de 45° de la canule facilite d’imagerie à l’aide d’un microscope inversé. Contrôleur de pression (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Combiné pression myographie et stratégie d’imagerie de fluorescence. (A) image transmission lumineuse de l’artère avec illustration de (B) l’analyse de toute la largeur de l’artère. Le collagène SHG apparaît en vert et élastine autofluorescence en magenta. C. diamètre du lumen artériel (ici 238 µm) et des épaisseurs de paroi (ici 17 et 18 µm de haut et le bas, respectivement) est déterminé à la région équatoriale (observé de plus grand diamètre) de l’artère. (D) image lumineuse la transmission de l’artère avec l’illustration de la position des z-piles obtenus à l’échelle 10 à 50 µm pour la détermination de rectitude de collagène (E), angles de ramification (F) des lamelles élastiques internes et (G) z-piles obtenus à un 50-100 µm échelle pour l’obtention de collagène et élastine (H) densités de volume. Images de B/c : hauteur 300 µm (bar 20 µm), E/f : 50 x 50 µm (bar 10 µm), G/H 130 × 130 × 30 µm (barre = 30 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Change de microstructures en collagène adventitiels et la limitante élastique interne (IEL) et leur rapport avec les modules élastiques supplémentaires circonférentielles à 20, 40 et 100 mmHg. (A) angles de branchement des fibres d’élastine dans la Lei. (B) la rectitude des fibres de collagène adventitiels à proximité de la limitante élastique externe. p- et selon F-valeurs ont été déterminées à l’aide de mesures répétées ANOVA à : p/F-values r : 0.0014/24.18, b : 0.0002/37.38. Angles de ramification (C) IEL est corrélée de façon non linéaire avec Einc. (D) rectitude de collagène est en corrélation linéaire avec Einc. Les données apparaissent comme moyenne ± SE. microstructures (A et B et x-axes des C et D) des changements ont été déterminées pour les artères de résistance 6 soumis à imagerie vitale, tandis que Einc (C et D) a été calculée pour 20 autres artères soumis à pression myographie dans une norme la pression myographe. Chaque artère étudié était une personne différente. Ce chiffre a été modifié par Bloksgaard et al. 13. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Illustration des mesures des angles de ramification IEL et de rectitude de collagène dans les îles Fidji. (A) angles de ramification IEL sont marqués manuellement et mesurée à l’aide de l’outil angle de Fidji. (B) rectitude de collagène est déterminé en utilisant le plugin Fidji neurone J comme le ratio de la longueur de bout à bout d’une fibre de collagène unique via une ligne droite (blanc) divisé par la longueur réelle de bout à bout de la fibre (orange). Taille de barre : 20 µm.
Figure 5 . Flux de travail de Ilastik. (A) fenêtre de sélection de fonction avec l’indication des fonctions sélectionnées. (B) exemple d’image raw avec des étiquettes pour les fibres d’élastine, points lumineux (non désirés) et fond (C) mis en évidence en rouge, vert et bleu, respectivement. (D) ce qui entraîne de la carte de prédiction d’image (B) avec étiquettes figurant aux points (C). (E) segmentation basée sur la carte de prédiction en D avant (E) et après (F) appliquer un seuil de 0,5. Couleur jaune indique les connectés pixels correspondant à la fonction distincte (élastine). Taille de barre : 25 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . Images d’exemple avant et après l’optimisation de la prédiction de Ilastik carte montrant l’effet de re-formation Ilastik pour la reconnaissance des fibres d’élastine dans un échantillon avec la fluorescence de fond élevé de collagène (sous-optimal rapport signal sur bruit). (A) image originale, (B) résultat de la première analyse de Ilastik, où en particulier les fibres d’élastine mince (à gauche de l’image B) ne figurent pas dans la segmentation et (C) le résultat suite à l’optimisation de la carte de prédiction. Taille de barre : 25 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce travail représente notre suggestion pour un standard, combinée d’imagerie et de la pression myographie approche, précieuse pour l’évaluation simultanée des propriétés mécaniques des artères de résistance et les changements liés à la pression dans la structure de cette artère mur sur une plage de pression de 0 à 100 mmHg. L’approche présentée a été développé en utilisant des équipements de construction personnalisée, cependant, n’importe quel myographe de pression qui s’adapte sur un microscope à fluorescence biphotonique excitation peut être utilisé, lors de la conception des deux appareils permet l’imagerie de la paroi artérielle. Devrait être une attention particulière à la forme, la largeur et la distance entre l’objectif et les conditions dans lesquelles l’imagerie sera effectuée. Microscopes debout nécessitent l’utilisation de l’eau de trempage des objectifs, tandis que l’utilisation d’objectifs à immersion eau est recommandée pour des microscopes inversés afin d’éviter des divergences dans les indices de réfraction entre l’échantillon et l’objectif. En outre, l’attention devrait être accordée à l’épaisseur de la lamelle couvre-objet, soit en appliquant une correction d’une incohérence entre l’objectif et la lamelle couvre-objet à l’aide du collier de correction sur l’objectif (le cas échéant), soit en faisant correspondre l’épaisseur de la lamelle couvre-objet avec l’objectif utilisé.
Dans le protocole décrit, lumière faible consommation d’énergie, proche infrarouge pour l’imagerie autofluorescence d’élastine et de collagène SHG est mise à profit. Cela permet l’imagerie pendant de longues périodes de temps. Dans les artères de la résistance humaine utilisées dans cette étude, l’IEL est constituée d’un réseau de fibre comme aligné longitudinalement d’élastine interconnectés fibres13,33, semblable à la structure de la Lei de la résistance humaine sous-cutanée artères (hSCA)38,39. Changements dans les angles de ramification des fibres élastine dans la Lei ont été évalués et utilisés ainsi que des mesures de la déroulement progressif des fibres de collagène adventitiels avec l’augmentation des pressions37 pour évaluer les changements dans la microarchitecture de l’élastine et collagène respectivement. Images d’évaluation microarchitectures d’élastine et de collagène ont été obtenues à la même région d’intérêt dans la paroi artérielle à différentes pressions. Cela permet des analyses de mesures répétées. Lorsque cela est possible, l’enquêteur pourrait viser à obtenir des images dans au moins 3 régions d’intérêt, avec image taille 10 à 50 µm de chaque dimension. Toutefois, selon l’échantillon, en particulier l’épaisseur de la paroi artérielle, un compromis doit être faite entre le nombre de régions numérisées d’intérêt et la durée possible de l’expérience. Dans le cas des artères de la résistance humaine péricardique, les artères demeurent vivantes pendant au moins 8-12 h d’expérimentation. Numérisation de plusieurs régions d’intérêt permet l’évaluation intra-par rapport à la variabilité entre l’échantillon et permet donc de conclure sur les résultats obtenus.
Il est important de noter que, pour éviter d’induire des dommages phototoxique, imagerie en utilisant la lumière d’excitation puissance élevée doit être évitée lorsque vous travaillez sur des échantillons de tissus vivants. Dans ce contexte, il est recommandé d’obtenir les piles d’agrandir de collagène et d’élastine des densités de volume à la fin du protocole expérimental, alternativement sur des échantillons de fixes. Lorsque les quantités absolues des composantes ECM sont nécessaires, tout effet du fixateur sur les densités de volume doit être quantifiée et pris en compte. Fixation et perméabilisation des artères permet en outre la coloration des cibles intracellulaires d’intérêt lorsque cela est nécessaire. Dans ce protocole, coloration pour l’élastine est effectuée à l’aide de l’éosine sur l’artère direct. La coloration de l’élastine par sondes spécifiques (p. ex., alexa 633 hydrazide maléique40) et du collagène (p. ex., CNA3541), peut être appliquée conjointement avec d’autres taches (p. ex., la phalloïdine42) ou de l’ADN, pour faciliter l’évaluation de densité volumétrique et structure de l’organisation d’autres structures d’intérêt dans la paroi artérielle. Cette possibilité peut fournir des laboratoires de recherche monophotonique microscopes confocaux une occasion d’étudier les modifications microstructurales dans les artères de résistance. Segments de l’artère de même et peuvent être traités dans des conditions différentes, sous la pression imagées à un stade ultérieur pour comparer l’effet du traitement appliqué. Cibles d’intérêt doivent être visualisés par les vaisseaux de re-canulés, re-sous pression et teintés d’imagerie. Re-canulation et re-pressurisation est nécessaire si l'on tient compte des changements structurels, élastine ne peut pas être résolu et donc sera recul et modifient la structure 3D de l’artère fixe43,44. L’inconvénient de la détermination des changements structurels dans les artères fixes est que plusieurs segments ont fixé pour comparaison et analyses répétées-mesure ne peuvent être effectuées.
Les données obtenues à l’aide de l’imagerie peuvent servir directement à calculer les souches et les contraintes de la paroi et accepter de comprendre la mécanique de la paroi vasculaire, est décrite dans Bloksgaard, M. et al.13. Dans ce travail, un modèle mathématique a été utilisé pour caractériser la rigidité intrinsèque de l’élastine et composants de collagène de la paroi artérielle et d’estimer le collagène recrutement souches45,46 , sur la base de calcul relations de contrainte de souche. L’imagerie a appuyé les conclusions de la modélisation mathématique, ce collagène dans les artères de la résistance humaine était déjà recruté à faible déformation circonférentielle et tension pariétale. Les mesures quantitatives de la microarchitecture d’élastine et de collagène décrits dans le présent protocole peuvent être encore étendu, inspiré par les travaux importants réalisé sur les artères carotides6,8,47, 48 , 49 et aorte7,9,10,50,51: analyses supplémentaires peuvent inclure évaluer la répartition spatiale et la microarchitecture du collagène et fibres d’élastine dans les différentes couches de la paroi artérielle, mais aussi les angles d’orientation de fibres (orientation par rapport à l’axe longitudinal). Bell et al. 15 abordé la réorganisation induite par la pression de l’IEL et adventitiels collagène, y compris un modèle analytique multicouche pour calculer la rigidité et la tension dans chaque couche de la paroi artérielle. Ces auteurs15 utilisé les artères de résistance sous-cutanée humaines obtenues à partir des volontaires sains et structure connexe et contraintes de mur à 3 et 30 mmHg, respectivement.
La méthode proposée dans le présent protocole motive j’espère que les autres enquêtes et développement de modèles mathématiques microstructurally motivés pour comprendre les propriétés mécaniques des artères de la résistance humaine dans la santé et la maladie. Avec amendements ultérieurs de la méthode d’inclure aussi de collagène et élastine angles d’orientation selon l’axe longitudinal, de cellules musculaires lisses densité volumique, distribution spatiale et l’orientation au sein de la distribution artérielle de mur, de collagène et d’élastine et orientation dans les médias de tunica et l’organisation de l’élastine et la distribution dans l’adventice de tunica, les données d’imagerie peuvent nourrir avant développement de modèles mathématiques, facilitant la compréhension du processus transformant dans l’hypertension, le diabète et la syndrome métabolique. De même, comme l’a suggéré par Chen et Kassab pour la microcirculation coronaire52,53, modèles axés sur la microstructure des artères de la résistance humaine peuvent fournir des prédictions des réponses mécaniques artérielles à la macro-(toute artère) et micro-(structure) mécanique niveaux pour chaque composant. Ces modèles doivent reposer sur des données quantitatives des paramètres structuraux et propriétés mécaniques des différentes couches et les constituants de la paroi artérielle des artères provenant de volontaires sains et de patients souffrant de différentes maladies, recevant des traitements pharmacologiques différents. Données sont recueillies de façon standardisée et comparativement entre les personnes avec différents facteurs de risque, maladie et traitement de profils. La méthode a le potentiel pour aider à comprendre comment la maladie et les traitements médicaux affectent la microcirculation humaine.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le centre d’imagerie biomédicale danois moléculaire à la Faculté des Sciences naturelles, University of Southern Denmark, pour l’utilisation des laboratoires et des microscopes. Kristoffer Rosenstand et Ulla Melchior sont reconnues pour l’excellente assistance technique avec la pression myographie et d’imagerie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Science Tools | 15401-12 | ||
| Fine Science Tools | 11251-23 | ||
| Nikon | SMZ800N | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose | |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | ||
| Smiths medical Intl, UK | |||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | ||
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | ||
| Mettler toledo | |||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | ||
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | ||
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | ||
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | ||
| Nikon | Custom built | ||
| Spectra Physics, Mountain View, CA | |||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | ||
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | ||
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | ||
| Scotch TM | |||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
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