Мы описать одновременное механическое тестирование и 3D-изображений артериальной стенки изолированных, жить артерий человеческого сопротивления и Фиджи и Ilastik анализа изображения для количественной оценки плотностей эластина и коллагена пространственной организации и объем. Мы обсуждаем использования этих данных в математических моделях артериальной стенки механики.
Патогенные вклад сопротивления артерии ремоделирования документирован в гипертоническая болезнь, диабет и метаболически синдрома. Исследования и разработка microstructurally почве математических моделей для понимания механические свойства человеческого сопротивления артерий в здоровье и болезни имеют потенциал для оказания помощи понимание как болезни и лечение влияет на человека микроциркуляцию. Развивать эти математические модели, важно расшифровать отношения между свойства Механические и микроархитектуры микрососудистой стены. В этой работе мы описываем метод ex vivo для пассивного механических испытаний и одновременное лейбл бесплатно трехмерных изображений микроархитектуры эластина и коллагена в артериальной стенки артерий изолированных человеческое сопротивление. Визуализации протокол может применяться к артерии сопротивления любых видов, представляющих интерес. Анализ изображений описаны для количественной оценки i) давление индуцированные изменения в внутренней упругой пластинки ветвления углов и прямолинейности adventitial коллагена, используя Фиджи и плотности тома ii) коллагена и эластина, определяются с помощью программного обеспечения Ilastik. Желательно все механические и Тепловизионные измерения выполняются на живой, перфузии артерий, однако, альтернативный подход с использованием стандартных видео микроскопия давления миография в сочетании с после фиксации изображений повторно под давлением судов обсудили. Этот альтернативный метод предоставляет пользователям с различными опциями для анализа подходов. Обсуждается включение механических и визуализации данных в математической модели механики артериальной стенки, и предлагается будущего развития и дополнения к протоколу.
Патогенных вклада и воздействия сопротивления артерии ремоделирования описаны в гипертоническая болезнь, диабет и метаболический синдром1,2,3,4,5. Расшифровка отношения между механические и микроархитектуры свойства стенку, Микроваскулярная имеет важное значение для разработки математических моделей этой ассоциации. Такие модели улучшат понимание процесса реконструкции и будет поддерживать развитие в silico модели полезен для тестирования фармакологических стратегии таргетинга болезни ремоделирования артериальной стенки.
Предыдущие исследования были сосредоточены в понимании того, как микроархитектура артериальной стенки относится к артериальной стенки механики, включив механические меры и микроархитектуры внеклеточного матрикса (ECM) выполняются почти исключительно на крупных , артерии упругой трубы от мышей или свиной6,,78,9,10,11. Изображений микроструктур стены обычно выполняется с помощью нелинейных оптических методов, воспользовавшись аутофлюоресценция эластина и второе поколение гармонических коллаген. Это позволяет пространственно-временных изображений двух основных компонентов внеклеточного матрикса, эластин и коллаген, без необходимости для окрашивания. Визуализации артериальной стенки в полной толщине является проблемой в больших каналом артерии из-за рассеяния света в средствах массовой информации толстые туника. Однако чтобы определить, как микроархитектура структурных компонентов артериальной стенки связаны наблюдаемое механических свойств, трехмерные информация должна быть получена в ходе механических испытаний. Для крупных артерий как человека аорты это требует биаксиальные оплетки монтажа, механические испытания и изображений регионов интерес в 1-2 см2 шт артериальной стенки7,9,10, 12. только часть стены могут быть образы и механически испытания.
Для мелких артерий любых видов (например, человеческий перикард13, легочной14 и подкожной15 артерий, крыса верхней брыжеечной артерии16,,1718, 19 , 20, cremaster мыши, брыжеечный, головного мозга, бедренных и сонных артерий21,22,23,24,25,26, 27) изображений всей толщины возможно и может сочетаться с механических испытаний. Это позволяет одновременной записи механических свойств и структурных договоренностей внутри стены. Однако прямой математическое моделирование взаимоотношений между наблюдаемыми изменениями в трехмерной структуры ECM и изменения механических свойств сопротивления артериальной стенки, в меру наших знаний только поступили после Недавно в человеческое сопротивление артерий13,15.
В этой работе описан метод ex vivo для пассивного механических испытаний и одновременное трехмерных изображений микроархитектуры эластина и коллагена в артериальной стенки артерий изолированных человеческое сопротивление. Визуализации протокол может применяться к артерии сопротивления любых видов, представляющих интерес. Анализ изображений описаны для получения мер внутреннего упругой пластинки ветвления углов и adventitial коллагена прямолинейность13 с помощью Фиджи28. Объем плотность коллагена и эластина, определяются с помощью программного обеспечения Ilastik29 , и наконец, обсуждается включение механических и визуализации данных в математических моделях артериальной стенки механики.
Цель описания изображений и изображения анализ методов в сочетании с математическое моделирование заключается в предоставлении следователи системный подход для описания и понять наблюдаемые изменения давления индуцированной в ECM сопротивления артерий. Описан метод ориентирован в количественную оценку изменений в ECM в судно во время наддув, сравнивая структуру ECM в 20, 40 и 100 мм рт.ст.. Эти факторы были выбраны для определения структуры артериальной стенки на его более совместимым (20 mmHg), жесткая (100 мм рт.ст.) и промежуточное состояние (40 mmHg), соответственно. Однако любой процесс в сосудистой стенке артерий живой, включая изменения, индуцированных вазоактивных компонентов, гистерезис и потока, может быть определена количественно, в зависимости от гипотезы исследования вопрос следователя.
Особое внимание уделяется использование микроскопии флуоресцирования возбуждения двух фотонов (TPEM) в сочетании с myograph давления для изучения давления (или других) индуцированного изменения в ECM живой артерий. Во-первых потому что это позволяет одновременное приобретение общей трехмерной структуры артериальной стенки (диаметр и толщина стенки) наряду с трехмерной метки бесплатно приобретение высокого качества, подробные изображения коллагена и эластина схемотехнические как описано13 , воспользовавшись аутофлюоресценция эластина и коллагена второй гармоники поколения сигнала (SHG)30. Во-вторых TPEM позволяет, что допускается использование ближней ИК-области спектра возбуждения низкой энергии света, минимизации повреждений ткани и таким образом, повторяющихся изображений на точно таком же положении в сосудистой стенке, позволяющей повторить измерения анализ наблюдается изменения.
Использование альтернативного подхода с использованием конфокальная томография давления фиксированной артерий обсуждается позволяет пользователям без доступа к TPEM возможность использовать метод описан как хорошо. Информация о плотности структуры и объема ECM можно получать также из двумерный анализ тканей секционного в последовательный порт, например, как описано на31,32. Однако, ввиду отсутствия возможности для получения трехмерных структурную информацию над шкалой длина артерии, а также в ходе изменения условий, с помощью этого метода, это не рекомендуется использовать этот подход для расследования давления и лечения индуцированных трехмерной изменения в ECM.
Минимальным требованием для детектива, чтобы применить метод здесь описано является доступ к установке для катетеризации и герметизация артерий в сочетании с микроскопом конфокальный или два Фотон возбуждения флуоресценции. Установки, описанные в следующий протокол является заказ давления myograph с продольной силы датчика, построен, чтобы поместиться на пользовательские построен Перевернутый двух Фотон возбуждения флуоресценции микроскопа.
Эта работа представляет собой наше предложение стандартизированных, комбинированные изображений и давления миография подхода, ценные для одновременной оценки механических свойств сопротивления артерий и связанные с давлением изменения в структуре артериальной стены в диапазоне да…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят изображений центра молекулярной биомедицинских датского на факультет естественных наук, Университет Южной Дании, за использование лабораторий и микроскопы. Кристоффер Rosenstand и Мельхиор Ulla признаны за отличную техническую помощь с давлением миография и изображений.
Fine Science Tools | 15401-12 | |
Fine Science Tools | 11251-23 | |
Nikon | SMZ800N | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
Smiths medical Intl, UK | ||
Ethicon | Ethilon 11-0 | |
Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
Mettler toledo | ||
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
Nikon | Custom built | |
Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
Scotch TM | ||
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |