Summary
Vi beskriver samtidig mekanisk testing og 3D-bildebehandling av arterieveggen av isolert, live menneskelig motstand arterier og Fiji og Ilastik bilde analyser for kvantifisering av elastin og kollagen romlig organisering og volum tettheter. Vi diskuterer bruken av disse dataene i matematiske modeller av arterieveggen mekanikk.
Abstract
Patogene bidrag av motstand arterien remodeling dokumentert viktig hypertensjon, diabetes og Metabolsk syndrom. Undersøkelser og utvikling av microstructurally motiverte matematiske modeller for å forstå de mekaniske egenskapene av menneskelig motstand arterier i helse og sykdom har potensial til å hjelpe forstå hvordan sykdommen og medisinske behandlinger påvirke menneskelig blodsirkulasjonen. For å utvikle disse matematiske modeller, er det viktig å dechiffrere forholdet mellom mekanisk og mikroarkitekturstruktur egenskapene til mikrovaskulær veggen. I dette arbeidet beskriver vi en ex vivo metode for passiv mekanisk testing og samtidige etikett-fri tredimensjonale imaging av mikroarkitektur av elastin og kollagen i arterieveggen av isolerte menneskelig motstand arterier. Tenkelig protokollen kan brukes på motstand arterier av alle arter av interesse. Bildet analyser er beskrevet for kvantifisering i) press-indusert endringer i interne elastisk lamina forgrening vinkler og adventitial kollagen rett linje ved hjelp av Fiji og ii) kollagen og elastin volum tettheter bestemmes ved hjelp av Ilastik programvare. Fortrinnsvis alle mekaniske og tenkelig mål utføres på live, parfyme arterier, er imidlertid en alternativ tilnærming med standard video-mikroskopi trykk myography i kombinasjon med etter fiksering bildebehandling av nytt trykksatt fartøy diskutert. Denne alternative metoden gir brukerne ulike alternativer for analyse tilnærminger. Inkludering av mekanisk og bildebehandling data i matematiske modeller av arterieveggen mekanikken er diskutert, og fremtidig utvikling og tillegg for protokollen.
Introduction
Patogene bidrag og virkningene av motstand arterien remodeling er dokumentert i viktige hypertensjon, diabetes og Metabolsk syndrom1,2,3,4,5. Tyde forholdet mellom mekanisk og mikroarkitekturstruktur egenskapene til mikrovaskulær veggen er avgjørende for å utvikle matematiske modeller av denne tilknytningen. Slike modeller vil bedre forstå remodeling prosessen og vil støtte utviklingen av sili modeller nyttig for testing av farmakologiske strategier målretting sykdom relatert ombygging av arterieveggen.
Tidligere studier fokuserte forstå hvordan mikroarkitektur av arterieveggen gjelder arterieveggen mekanikk ved å innlemme mekanisk tiltak og mikroarkitektur med den ekstracellulære matrisen (EFM) utføres nesten utelukkende på store , elastisk kanal arterier fra mus eller svin6,7,8,9,10,11. Avbildning av microstructures av veggen utføres vanligvis med lineære optisk teknikker, utnytter autofluorescence av elastin og andre harmonisk generasjon av kollagen. Dette gjør spatiotemporal avbildning av to hovedkomponentene ekstracellulær matrix, elastin og kollagen, uten behov for flekker. Avbildning av arterieveggen full tykkelse er en utfordring i store kanal arterier på grunn av scatter lyset i tykke tunika media. Men for å avgjøre hvordan mikroarkitektur strukturelle komponentene i arterieveggen relatert til de observerte mekaniske egenskapene, må tre-dimensjonal informasjon hentes under mekanisk testing. For store arteriene som menneskelige aorta krever dette biaxial montering, mekanisk testing og imaging regioner av interesse i 1-2 cm2 stykker av arterieveggen7,9,10, 12. kun en del av veggen kan avbildes og mekanisk testet.
For mindre arterier av alle arter (f.eks human perikard13, lunge14 og underhud15 arteriene, rotte hvem arterier16,17,18, 19 , 20, mus cremaster, hvem, cerebral, femur og carotis arteriene21,22,23,24,25,26, 27) bildebehandling av hele veggtykkelse er mulig og kan kombineres med mekanisk testing. Dette tillater samtidig innspillingen av de mekaniske egenskapene og strukturelle avtaler i veggen. Men er en direkte matematisk modellering av forholdet mellom de observerte endringene i tredimensjonale strukturen av ECM og endrede mekaniske egenskaper av motstand arterieveggen, etter beste overbevisning bare rapportert på nylig i menneskelig motstand arterier13,15.
En ex vivo metode for passiv mekanisk testing og samtidige tredimensjonale imaging av mikroarkitektur av elastin og kollagen i arterieveggen av isolerte menneskelig motstand arterier er beskrevet i dette arbeidet. Tenkelig protokollen kan brukes på motstand arterier av alle arter av interesse. Bildet analyser er beskrevet for å få tiltak av interne elastisk lamina forgrening vinkler og adventitial kollagen rett linje13 med Fiji28. Kollagen og elastin volum tettheter fastsettes ved hjelp av Ilastik programvare29 og endelig inkludering av mekanisk og bildebehandling data i matematiske modeller av arterieveggen mekanikken diskuteres.
Målet med beskriver bildebehandling og bilde analysene teknikker i kombinasjon med matematisk modellering er å gi etterforskere en systematical tilnærming for å beskrive og forstå observert press induserte endringer i ECM av motstand arterier. Metoden beskrevet er fokusert i kvantifisere endringene i ECM i et fartøy i pressurization, ved å sammenligne strukturen av ECM på 20, 40 og 100 mmHg. Disse belastningene ble valgt for å bestemme strukturen i arterieveggen i mer kompatibel (20 mmHg), stive (100 mmHg) og mellomstatus (40 mmHg), henholdsvis. Imidlertid kan prosesser i vaskulære veggen av live arteriene, inkludert forandringer indusert av vasoactive komponenter, hysteresis og flyt, kvantifiseres, avhengig av forskning hypotesen aktuelle av utprøver.
Bruk av to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskopi (TPEM) i kombinasjon med et trykk myograph studerer press (eller andre) induserte endringer i ECM live arterier er vektlagt. Først, fordi dette gjør samtidige oppkjøpet av samlet tredimensjonale strukturen i arterieveggen (diameter og veggen tykkelse) sammen med tredimensjonale etikett-fri oppkjøpet av høy kvalitet, detaljerte bilder av kollagen og elastin microarchitectures som beskrevet13 ved å utnytte autofluorescence elastin og kollagen andre harmonisk generasjon signal (SHG)30. Andre tillater TPEM bruk av lavenergi nær infrarød eksitasjon lys, minimere photodamage vev og dermed gjentatte bildebehandling i nøyaktig samme posisjon innenfor vaskulære veggen er tillatt, tillater gjentatte målinger analyser av observert endringer.
Bruk av en alternativ tilnærming med AC confocal imaging press fast arterier er diskutert for å tillate brukere uten tilgang til TPEM en mulighet til å bruke beskrevet metoden også. Informasjon om ECM struktur og volum tettheter kan også hentes fra todimensjonal analyser av vev delt i føljetong, f.eks som beskrevet av31,32. Men på grunn av manglende mulighet til å hente tredimensjonale strukturinformasjon over lengden skalaer av arterien og endre ved hjelp av denne metoden, er det ikke anbefale å bruke denne tilnærmingen for undersøkelser av trykk og behandling indusert tredimensjonale endringer i ECM.
Minimumskravet etterforskeren bruke metoden her beskrevet er tilgang til et oppsett for cannulation og pressurization av arterier i kombinasjon med AC confocal eller to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskop. Beskrevet i følgende protokollen er en spesialbygd press myograph med en langsgående force svinger, bygd for å passe på en tilpasset bygget invertert to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samling av biopsies av menneskelig parietal pericardium for bruk i dette arbeidet ble utført etter skriftlig samtykke, som beskrevet tidligere33. Studiet av menneskelig vev i samsvar med prinsipper i deklarasjonen i Helsinki34 og ble godkjent av den regionale komiteer på helse forskning etikk for sørlige Danmark (S-20100044 og S-20140202) og dansk Data Protection Agency.
1. samle vev og isolere (menneske) motstand arterie
- Samle vevsprøver rundt umiddelbart etter excision under en operasjon. Overføring vev til 4 ° C HEPES bufret fysiologisk saltløsning (HBS) umiddelbart etter samling og lagre det i HBS.
Merk: Menneskelig vev er bare innhentet etter godkjenning av relevante institusjonelle og etiske komiteer samt pasienter skriftlig samtykke. HBS sammensetningen i mM: NaCl 144, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, HEPES 14,9, glukose 5.5. Justere pH 7.4 med NaOH og filtrerer løsning skjønt 0,2 µm filteret. - La samlet vevet i sterilt HBS på 4 ° C over natten for å vaske ut bedøvelse.
Merk: Noen effekt over natten lagringsplass på fartøyet integritet og funksjonalitet bør kontrolleres av personlige forskningslaboratoriet. - Forsiktig isolere motstand størrelse arteriene (± 200 µm lumen diameter) med en skarp-tip tang og mikro-disseksjon saks.
- Lagre arteries ved 4 ° C i iskalde HBS mens grunning bildebehandling/trykkammer.
2. montere isolert arterien i trykk-Myograph
- Montere glass cannulae med tips diameter på ~ 80 µm på cannulae holdere. Plasser tips ca 150 µm over kammer glass bunnen.
Merk: 45° bended tips cannulae kan nøyaktig posisjonering av fartøyet ovenfor glass bunnen. - Fyll både innløp og utløp rør med HBS med 1% BSA og koble til press.
Merk: BSA er inkludert for å bevare endothelial celle funksjon. - Montere isolert arterien bruker to doble knute suturer per kanyle.
Merk: Knop kan være forberedt på forhånd og lagret på dobbel teip til nødvendig. - Fyll kammeret med HBS og plassere to doble knop på hver glass kanyle.
Merk: Når du bruker arterier viser myogenic tone, HBS skal erstattes med kalsium gratis HBS supplert med 3 µM EGTA og 3 µM natrium nitroprusside. - Hold arterien forsiktig på ene enden med to par skarp tips tang. Åpne lumen av arterien og skyv det inn i kanyle. Fikse på kanyle bruker to knop.
- Bruke et trykk på 5 mmHg å forsiktig skylle lumen med HBS / 1% BSA.
- Cannulate den andre enden av arterien og fest den på kanyle bruker to doble knop.
- Overføring av myograph til mikroskopet scenen og pressurize arterien til 5 mmHg (innløp press = stikkontakt trykk), deretter varme 37 ° c i 30 min.
- Valgfritt: Kalibrere langsgående force svingeren i henhold til produsentens instruksjoner (1 g = 9,81 mN).
Merk: Det er viktig å kalibrere force svingeren etter oppvarming som ømfintlig.
3. Utfør eksperiment: Bildebehandling av arteriell Diameter, veggtykkelse og kollagen og Elastin mikroarkitektur med TPEM
- Raskt skanne cannulated arterien til 5 mmHg ved hjelp av en 20 X mål (numerisk blenderåpning (NA) ≥ 0,8) og lav makt eksitasjon lett for å vurdere fartøyet diameter og veggen tykkelse på 5 mmHg.
NOTE For invertert mikroskoper, bruk en vann nedsenking målsetting; oppreist mikroskoper, bruke vann dipping mål. Hvis målet ikke har en korreksjon krage korrigere cover slip tykkelse, sørg for å matche brukte cover slip med målet brukes. Programvare og beskrivelser kan variere avhengig av bruker-interphase og mikroskopet og programvare som brukes.- Sette den optiske banen.
- Aktivere Mai Tai to-fotonet laser og sett den til 820 nm eksitasjon lys.
FORSIKTIG: Ikke eksponert for synlig samt usynlig laserlys. - Samle utslipp samtidig i to kanaler. Delt utslipp lys mellom photomultipliers med en 460 nm lang pass dichroic speil og samle utslipp med 30-60 nm bredt Båndpassdesign filtre sentrert på 520 nm (elastin) og 410 nm (kollagen), henholdsvis.
- Aktivere Mai Tai to-fotonet laser og sett den til 820 nm eksitasjon lys.
- Aktiver kontinuerlig skanning med 10 µs laser bor tid/bildepunkt og 512 × 512 piksler for 100% synsfelt.
- Manuelt avsøke igjennom arteria å fastsette hvor maksimale diameter er observert.
- Velg et rektangulært stykke som dekker arterias bredeste diameter og skanne et enkeltbilde med piksel størrelse ≤ 300 nm/piksel (figur 2C). Bruk lav eksitasjon lys kraft og pixel holdetiden som mulig for å unngå photodamaging arteria live.
Merk: Det anbefales å få en rektangulær, f.eks., 100 × 1024 piksler bilde, i stedet for kvadratisk bilde på denne posisjonen for å spare tid og begrense vev Foton eksponering (figur 2C). - Lagre bildet for senere analyser.
- Sette den optiske banen.
- Bestemme lumen diameter og veggen tykkelse på arterien maksimale diameter.
- Laste bildet i Fiji.
- Angi skalaen ved å klikke Main menyen | Analysere | Angi skala og angi µm/bildepunkt og pixel ratio (det anbefales å holde pixel forholdet 1:1).
- Velg linjeverktøyet Fiji og trekke en linje mellom de to interne elastisk laminae på hver side av den arteriell lumen, og klikk ctrl + M. Fiji rapporter lengde som standard i resultatene tabellen.
- Likeledes, tegne linjer for å måle tykkelsen på hver vegg, og klikk ctrl + M for å måle f├╕lgende markering.
- Lagre målinger.
- Bildet kollagen og elastin mikroarkitektur på 5 mmHg ved å skanne hele tykkelsen på arterieveggen, få 3D bildestakker med god kvalitet for 1-3 områder av interesse langs arterien.
- Få bildestakker gjennom hele veggen av arteria bruker en 60 X mål, NA ≥ 1, optimalisert pixel størrelser og z-avstanden.
- Beregn optimale imaging forhold (pixel størrelser og z-trinn avstanden) i samsvar med optisk veien, nedsenking medium og prøve refraktiv indekser ved hjelp av vitenskapelige volum tenkelig Nyquist kalkulatoren (https://svi.nl/NyquistCalculator).
Merk: Vennligst vær oppmerksom her forskjellen mellom optimal pikselstørrelsen og z-avstanden versus råd i avsnitt 3.4. over på bruk av en maksimale pikselstørrelsen.
- Beregn optimale imaging forhold (pixel størrelser og z-trinn avstanden) i samsvar med optisk veien, nedsenking medium og prøve refraktiv indekser ved hjelp av vitenskapelige volum tenkelig Nyquist kalkulatoren (https://svi.nl/NyquistCalculator).
- Bruk samme excitation og utslipp innstillinger som ovenfor (3.1.1.).
- Raskt skanne fartøyet veggen som beskrevet ovenfor for å angi tykkelsen på z-stakken.
- Definer z stabel starten og slutten dybde, z-trinn avstanden og tettheten (beregnet i 3.3.1.1.), og utføre z-søket. Lagre hver kanal separat.
Merk: Bilder må være liten nok f.eks 30 x 30 µm eller 50 × 50 µm avhengig fartøy å unngå noen innflytelse av kurvaturen i påfølgende bildet analysene.
- Få bildestakker gjennom hele veggen av arteria bruker en 60 X mål, NA ≥ 1, optimalisert pixel størrelser og z-avstanden.
- Bestemme arteriell diameter, veggtykkelse og elastin og kollagen mikroarkitektur på gjenværende presset av protokollen.
- Gjenta 3.1-3.2 på press 10 og 20 mmHg, Gjenta 3.3 på trykk 20 mmHg.
- Gjenta 3.1 og 3.2 på trykk 40 mmHg.
- Gjenta 3.1-3.2 på press 60, 80 og 100 mmHg Gjenta 3.3 på 100 mmHg.
Merk: 3.1-3.3 kan gjentas for alle presset og kombinasjoner av press (f.eks en serie/kombinasjon av økende også som mindre press), avhengig av hypotese til testes. Eosin i konsentrasjon 0.3 - 1 µM legges til forbedre elastin autofluorescence ved photobleaching. Photobleaching kan unngås ved å bruke som strømsparingsmodus eksitasjon lette som mulig. - Erstatt bufferen i det myograph kammeret med fersk 37 ° C HBS etter hvert trykk trinn. Tillate arteria å tilpasse for 5 min før imaging etter hver endring i press.
- Lagre kanal stabler separat for bildet analyser.
- Teste levedyktighet av arterien.
- Bruke 10 µM U46619 i det myograph kammeret etterfulgt av tillegg av 10 µM bradykinin når en stabil innsnevring er observert.
- Registrere diameter og veggen tykkelse som beskrevet over i Seksjon 3.1 etter anvendelsen av hver av forbindelser.
- Legg 3 µM natrium nitroprusside når arterien ikke er fullt utvidet etter tillegg av bradykinin og post diameter og veggen tykkelse.
Merk: Avhengig av farmakologiske egenskaper for arterien rundt (vaskulær seng og arter) andre vasoconstrictor og (endotelet avhengige av) vasodilator forbindelser kan brukes.
- Valgfritt: Fikse arteria trykksatt eller fortsette med imaging av kollagen og elastin for volum tettheter (trinn 7).
- Legge til 4% formaldehyd i 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS) i 37 ° C i 1 time.
- Vask arteria fast tre ganger i 1 x PBS og skyv arteria off cannulae, berører bare delene av arteria utenfor knuter. Ikke Fjern knuter, bruke dem for å holde arterien ved overføring til en oppbevaring tube.
- Butikken i 1 x PBS / 0,05% Natriumazid på 4 ° C til bildebehandling for elastin og kollagen volum tettheter eller andre formål.
Merk: Fast arterier kan lagres i minst 3 måneder i 1 x PBS / 0,05% Natriumazid på 4 ° C.
4. beregning av Stress belastning relasjoner og indre veggen stivhet
- Følg formlene og trinnene i beregningen for beregning av stress, stammer og veggen stivhet som beskrevet av Bloksgaard, M. et al. 13 og referanser her.
5. image Analysis - (intern elastisk Lamina) IEL forgrening vinkler
- Åpne bildestakk i Fiji. Gå til filen | åpent bilde å velge bildestakk.
Merk: Max intensitet projeksjoner av 2-7 påfølgende z-deler som dekker IEL (1-2 µm tykkelse) brukes for å bestemme IEL elastin fiber forgrening vinkler bruke verktøyet vinkel i Fiji28,35. Se figur 4A illustrasjon. - Gå til bilde | stabler | z prosjektet... å velge bilder og "Max intensitet projeksjon".
- Lagre max intensitet projeksjon som TIFF.
- Velg så mange IEL fiber forgrening poeng som mulig ved hjelp av "vinkel verktøyet" og arbeide systematisk gjennom bildene. Klikk ctrl + M for å måle hver vinkel.
- Lagre Fiji resultater arket.
6. image Analysis - Adventitial kollagen Waviness
- Åpne bildestakk i Fiji. Gå til filen | åpne image å velge bildestakk.
Merk: Max intensitet anslag av 2-7 påfølgende z-partiene dekker kollagen rett utenfor den eksterne elastisk lamina (ÅL, 1-4 µm tykkelse) brukes for å bestemme kollagen waviness bruker Fiji NeuronJ plugin36 som beskrevet av Rezakhaniha, R . et al. 37 (Figur 4B). - Angi skalaen. Gå til analysere | angi skala angi bildepunktdimensjoner.
- Gå til bilde | stabler | z prosjektet... å velge bilder å jobbe med og "Max intensitet projeksjon".
- Endre bildetype til 8 bitt TIFF ved bilde | type | 8 bitt og lagre max intensitet projeksjon som TIFF.
- Måle kollagen fiber rett linje med Fiji Nevron J Plugin.
- Åpne NeuronJ plugg ved å klikke Fiji | Plugins | Nevron J.
- Åpne 8-biters TIFF i NeuronJ ved å klikke Load Image | Velg filen.
- Klikk Legg til tracings, og velg fibre å analysere ved å klikke på starten og slutten av hver fiber.
- Klikk mål tracings, velge vise sporing (Lf) og vertex målinger i dialogboksen.
- Beregne L0/Lf i excel (eller lignende) og lagre resultatene.
- Kopier og lim inn Fiji Nevron J tracings og toppunkt utgang til excel (eller lignende) og beregne L0 bruke Pythagorass teorem fra toppunktet målinger. Første og siste punkt på linjen indikerer plasseringen av hypotenusen i et 2D koordinatsystem.
Merk: En L0/Lf [kollagen fiber bunt-gjennomgående lengde via en rett linje (L0) / full lengde (Lf)] nær 1 angir en nesten rett kollagen fiber.
- Kopier og lim inn Fiji Nevron J tracings og toppunkt utgang til excel (eller lignende) og beregne L0 bruke Pythagorass teorem fra toppunktet målinger. Første og siste punkt på linjen indikerer plasseringen av hypotenusen i et 2D koordinatsystem.
7. imaging for kollagen og Elastin volum tettheter
- Vask arteria (fast) 1 x i PBS og flekken det i 15 min i 1 µM eosin i 1 x PBS i mørket. For fast arteriene, utføre dette trinnet ved romtemperatur.
Merk: Eosin forbedrer elastin fluorescens. Eosin vil flekke andre strukturer som kollagen og cellen cytoplasma hvis prøven er igjen i flekker løsningen for lengre tid. Hvis flekker på andre strukturer er for intens, redusere konsentrasjonen av eosin til 0,3 µM eller gjenta vask. - Vask arteria 3 x 1 x PBS
- For fast arteriene: montere arteria for bildebehandling.
Forsiktig: Bildebehandling av ikke-trykksatt tillater ikke henting av geometriske kvantitativ informasjon. Når absolutt mengder, bør dette alltid fås på live, trykksatt arterier. Volum-prosenter kan fås på ikke-trykksatt arteriene med denne metoden.- Plassere to stykker av dobbel selvklebende tape 1-1,5 cm fra hverandre på et objektglass. Dobbel teip er ca 100 µm tykk. Bruk ett eller flere lag av tape til diameteren av arterien skal monteres.
- Plassere 10-20 µL av PBS på glasset i midten av plassen, og plassere arterien i PBS drop.
Merk: Fall bør være liten og flat som mulig for å unngå skyve arterien ute av posisjon ved montering cover slip. - Sett i dekkglassvæske og trykk på dobbel teip.
- Fyll tanken mellom dekkglassvæske og objektglass med 1 x PBS. Fylle den hver time for å unngå tørking av prøven.
- For fast arteriene: montere arteria for bildebehandling.
- Få bildestakker for kollagen og elastin volum tetthet med en 20 X-målet med NA > 1 å dekke så mye av arterieveggen som mulig samtidig ha en god optisk oppløsning (figur 2D, 2 G og 2 H).
Merk: Bruk en vann nedsenking målsetting for bildebehandling av fast arterier under en dekkglassvæske, og bruk vann dipping målsetting for avbilding av avgjørende arterier. Hvis målet ikke har en korreksjon krage korrigere cover slip tykkelse, pass på at dekkglassvæske til målet. Fortrinnsvis bruk optimal pixel størrelser og z-avstanden. Beregne dette bruker Nyquist kalkulatoren (trinn 3.3.1.1.). Alternativt bruke en minste pikselstørrelse av 300 nm og z-avstanden på 1 µm. Det anbefales å få tre bilder langs arteria å tillate brukeren å bestemme intra-analysen variasjon. - Bildet elastin 820 nm eksitasjon lys og samle utslipp bruker en 30-60 nm bredt Båndpassdesign filter sentrert på 520 nm.
- Bildet kollagen bruker 990 nm eksitasjon lys å unngå noen magnetisering av elastin og andre autofluorescent proteiner og samle utslipp bruker 10-30 nm bredt Båndpassdesign filter sentrert på 495 nm.
- Lagre bildestakker fra hver kanal separat som TIFF-filer
8. bildeanalyser for utpakking Elastin og kollagen volum tetthet med Ilastik
- Konvertere TIFF bildestakker til HDF5 ved hjelp av Fiji28,35 ved å klikke Velg fil | Lagre som... HDF5.
- Opprett to data fil-mapper på datamaskinen harddisken, for elastin, for kollagen bildestakker, henholdsvis. Kopier relevante bildestakker til den aktuelle mappen.
- Opprette to nye Ilastik prosjekter i Ilastik programvaren, en av elastin, en for kollagen, henholdsvis.
- Åpne Ilastik | Opprett nytt prosjekt | Pixel klassifisering | nytt prosjekt | legge til data og Velg bildemappen opprettet i trinn 8.2.
Merk: Følg veiviseren for Ilastik.
- Åpne Ilastik | Opprett nytt prosjekt | Pixel klassifisering | nytt prosjekt | legge til data og Velg bildemappen opprettet i trinn 8.2.
- Importere en 3D bildestakk å trene programvaren.
- Merk Input Data applet | hovedarbeidsområdet området | Rå Data-kategorien | Legge til nye... | Legge til egen bilde(r) og velg ønsket bildedataene
- Velg aktuelle funksjonene i programvaren.
- Åpne funksjonen utvalget applet | Velg funksjonen som åpner en ny dialogboks. Se figur 5A for detaljer.
- Legge til minst to etiketter ved hjelp av knappen Legg til etikett under trening appleten.
Merk: Hver etikett vil tilsvare en objekttype som skal deles. I dette arbeidet, brukes tre etiketter for elastin: elastin seg selv, lyse flekker (å bli ekskludert), og bakgrunnen (å bli ekskludert). - Tegne etiketter på den rå bildestakk ved hjelp av maling pensel stylet merknadsverktøyet.
- Velg den aktuelle etiketten: Klikk pensel verktøyet og begynne å tegne.
- Be Ilastik å analysere bildestakk og se etter lignende funksjoner ved å klikke Aktiver Live Update.
- Sjekk nøye prediksjon kartet (figur 5 d).
Merk: Prosessen fra råbildebehandling til kart fullstendig prediksjon er vist i figur 5. Ilastik bruker prediksjon kartet til å segmentere bildet stable som etiketten en piksel er mer sannsynlig å være tilknyttet (figur 5 d). - Bruke en terskel.
- Merk terskelverdi applet, velger du en passende metode, input etikett, glatt, terskel størrelse filterparametere og til slutt klikker du bruk.
Merk: Dette segregerer tilsvarende merket deler av bildet i separate objekter. Sterkt knyttet vev, som elastin og kollagen trenger ikke segregerte, derfor en terskel på 0,4 brukes (standard er 0,5). Figur 5E og 5F illustrerer resultatet av å bruke en terskel.
- Merk terskelverdi applet, velger du en passende metode, input etikett, glatt, terskel størrelse filterparametere og til slutt klikker du bruk.
- Gjenta opplæring av Ilastik til resultatet er tilfredsstillende (bare elastin, henholdsvis kollagen er anerkjent for de respektive analysene).
- Ofte veksle mellom trening og segmentering (og noen ganger også terskelverdi) appleter under denne prosessen. Et eksempel på effekten av omskolering Ilastik er vist i figur 6.
- Satsvise analysere lignende bildedata: Velg satsvise prediksjon inngangsvalg og legge til relevante filer.
Merk: Ilastik utgang er en samling av pseudo - 1 bit 3D bildestakker (Bildemasker) med 0 (null) viser fraværet av elastin (eller kollagen) og 1 (én) viser tilstedeværelse bestemmelsene (faktiske bitdybden er 8-biters). - Kontrollere resultatene for hver bildestakk ved visuelt sammenligne bilde maskene og raw-bildefilene.
- Optimalisere Ilastik masken (trinn 8,4-8,9) og re-analysere noen bildestakker med tilfredsstillende resultater.
- Beregne elastin og kollagen volum tettheter fra Ilastik Bildemasker bruker MATLAB
- Åpne MATLAB.
- Velg mappe med ilastik Bildemasker i MATLAB "gjeldende mappe" vindu.
- Kopier skriptet MATLAB supplerende fil 1 å MATLAB-editor og lagre koden som volumeCalculator.m i MATLAB-mappen på datamaskinen harddisken.
- Angi pixel størrelser og pixel høyde i skriptet linjene
pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; % mikron * mikron
pixelHeight = 0,9; % mikron - Lagre skriptet.
- Gå å MATLAB kommandovinduet og angi "volumeCalculator (" sti-til-data ")" laste skriptet.
- Klikk Angi. Hvert bilde maske er nå oppsummeres og multiplisert (kjent) piksel/voxel volumet (fysiske dimensjoner i en piksel multiplisert z oppløsning). Utdataene fra MATLAB er det totale volumet av elastin og kollagen i hver bildestakk.
- Lagre resultatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spesialbygde press myograph for bildebehandling som brukes i dette arbeidet er vist i figur 1. Spesiell oppmerksomhet for design av myograph ble betalt til i) chamber med liten volum (2 mL) og ii) mulighet for posisjonering cannulae nær til, og parallelt med glass bunnen (figur 1B). Bunnen av kammeret passer en 50 × 24 mm #1.5 glass dekkglassvæske (utskiftbare). Trykk kontrolleren ble bygget fra en standard 1 L glassflaske og en sphygmomanometer (mansjett fjernet). Bruk av en servo trykk kontroller anbefales for en myograph oppsett med flyt krav.
Figur 2 viser de anbefalte stillingene for å skaffe enkeltbilder og bildestakker under eksperimentet skissert i protokollen. Illustrasjon, er en overføring * lys bilde av arteria montert inkludert i figur 2A. Knute å knute er montert arterien ca 1,6 mm. Arterien er skannet til bredeste diameter er observert (figur 2B), og på dette punktet, diameter og veggen tykkelsen er fastslått (figur 2C). Likeledes, en overføring lys bilde av arterien er inkludert i figur 2D, viser plasseringen og anbefalt bredde av bildestakker for å bestemme microarchitectures av kollagen (figur 2E) og elastin (figur 2F, liten torget i figur 2D) samt bildestakker for å bestemme kollagen (figur 2 g) og elastin (figur 2 H) volum tettheter (kvadratet, figur 2D). Bruker denne tilnærmingen, kan data for å konstruere press diameter kurver, etterfulgt av beregningen av tilsvarende stress-belastning kurvene fås fra trykk, diameter og veggen tykkelse målinger (figur 2C).
En enkelt eksponentiell tilpasning av stress-belastning forholdet etter Bloksgaard et al. 13 og referanser her, gir β-verdien, et geometri uavhengige mål på veggen stivhet proporsjonal med trinnvis elastisk modulus, Eøkes. Beregne Einc på ulike presset på hvilke bilder for kollagen og elastin microarchitectures ble oppnådd, lar en direkte analyse av forholdet mellom trykket indusert endringene i microarchitectures av kollagen og elastin og trinnvis elastisk modulus på ulike trykk (Figur 3). Måling av IEL forgrening vinkler og kollagen rett linje er illustrert i Figur 4.
Viktig for tolkningen av mekanisk data sammenligne to eller flere grupper av interesse, f.eks vs normotensive pasienter med hypertensjon, er en bestemmelse av elastin og kollagen. For dette utviklet en automatisk analysemetode i Ilastik, en freeware bilde analyseprogramvare som kan utdannet å gjenkjenne visse funksjoner. Arbeidsflyten i Ilastik er illustrert i figur 5.
For automatisk gjenkjenning av elastin og kollagen for volum tettheter er det viktig at det er et godt signal-til-støy-forhold i bilder innhentet. I prøver fra mennesker, er betydelig autofluorescence fra kollagen ofte observert i tillegg til kollagen SHG signalet. Dette reduserer signal-til-støy forholdet for påvisning av elastin. Figur 6 illustrerer hvordan omskolering av programmet Ilastik kan resultere i bedre anerkjennelse av tynne elastin fiber i et utvalg med betydelig kollagen autofluorescence "grønn" / elastin kanal. Hvis gjennomslag autofluorescence signalet i kollagen SHG kanalen er et problem, kan få SHG signalet med en lengre eksitasjon bølgelengde hjelpe. Hvis kanalen blø gjennom oppstår etter farging med eosin, konsentrasjonen av anvendt løsning av eosin skal senkes. Eosin er lett vasket ut, så gjentatte vask av farget prøven kan redusere signalet for.
Figur 1 . Spesialtilpassede press myograph for fluorescens bildebehandling. (A) perfusjon kammer med glass kapillærene knyttet til micromanipulators, som er montert på en force transducer (langsgående kraft). (B) 2 mL imaging kammer. 45° bøying av cannulae forenkler imaging bruker en invertert mikroskop. (C) Trykk kontrolleren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Kombinert press myography og fluorescens imaging strategi. (A) overføring lys bilde av arterien med illustrasjon av (B) skanning av full bredde på arterien. Kollagen SHG vises i grønt og elastin autofluorescence i magenta. (C). Arterial lumen diameter (her 238 µm) og veggtykkelser (her 17 og 18 µm topp og bunn, henholdsvis) bestemmes på ekvator (største diameter observert) av arterien. (D) overføring lys bilde av arterien med illustrasjon av plasseringen av z-stabler som på en 10-50 µm skala for å bestemme (E) kollagen rett linje, (F) forgrening vinkler av de interne elastisk laminae og (G) z-stabler på en 50-100 µm skala for å oppnå kollagen og elastin (H) volum tettheter. Bilder B/C: høyde 300 µm (bar 20 µm), E/F: 50 x 50 µm (bar 10 µm), G/H 130 × 130 × 30 µm (bar = 30 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Microstructural endringer i adventitial kollagen og det interne elastisk lamina (IEL) og deres forhold til omkrets trinnvis elastiske moduli på 20, 40 og 100 mmHg. (A) Branching vinkler av elastin fibrene i IEL. (B) meste adventitial kollagenfibre nær den eksterne elastisk lamina. p-verdier og ifølge F-verdiene ble fastsatt ved bruk av gjentatte målinger veis VARIANSANALYSE: p/F-values A: 0.0014/24.18, B: 0.0002/37.38. (C) IEL forgrening vinkler korrelerer nonlinearly med Eøkes. (D) kollagen rett linje korrelerer lineært med Eøkes. Dataene vises som betyr ± SE. Microstructural endringer (A og B og x-axes C og D) var bestemt for 6 motstand arterier utsatt for viktig imaging mens Einc (C og D) ble beregnet for 20 andre arterier utsatt for press myography i standard Trykk myograph. Hver arterien studerte var fra en annen person. Dette tallet er endret fra Bloksgaard et al. 13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Illustrasjon av målinger av IEL forgrening vinkler og kollagen rett linje i Fiji. (A) IEL forgrening vinkler merkes manuelt og målt ved hjelp av verktøyet Fiji vinkel. (B) kollagen rett linje bestemmes ved hjelp av Fiji Nevron J plugin som forholdet mellom ende-til-ende lengden på en enkelt kollagen fiber via en rett linje (hvit) delt på faktiske ende-til-ende lengden av fiber (oransje). Bar størrelse: 20 µm.
Figur 5 . Ilastik arbeidsflyten. (A) funksjonen vinduet med indikasjon på valgte funksjoner. (B) eksempel raw-bilde med (C) etiketter for elastin fibre, lyspunkter (uønsket) og bakgrunn uthevet i rødt, grønt og blått, henholdsvis. (D) resulterer prediksjon kart bilde (B) med etiketter i (C). (E) segmentering basert på prediksjon kartet i (D) før (E) og etter (F) søker en terskel på 0,5. Gul farge viser de tilkoblede bildepunktene som tilsvarer funksjonen segregerte (elastin). Bar størrelse: 25 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Eksempel bilder før og etter optimaliseringen av Ilastik kart som viser effekten av re-trening Ilastik for anerkjennelse av elastin fiber i et utvalg med høye fluorescens fra kollagen (sub-optimal signal til støyforhold). (A) originalbildet, (B) resultatet av første Ilastik analyse, hvor særlig tynn elastin fiber (venstre bilde B) ikke er inkludert i segmenteringen og (C) resultatet etter optimalisering av prediksjon kartet. Bar størrelse: 25 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende fil Klikk her for å laste ned denne filen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet representerer vårt forslag for en standardisert, kombinert bildebehandling og trykk myography tilnærming, verdifulle samtidige vurdering av de mekaniske egenskapene av motstand arterier og press-relaterte endringer i oppbygning av hovedvei veggen over en trykket varierer fra 0 til 100 mmHg. Presentert tilnærmingen ble utviklet Bruk egendefinerte bygget, men noen press myograph som passer på en to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskop kan brukes når utformingen av både utstyr tillater avbilding av arterieveggen. Spesiell oppmerksomhet bør vies til form, bredde og arbeidsavstand målet og betingelsene som avbilding utføres. Oppreist mikroskop krever bruk av vann dipping mål, mens bruk av vann nedsenking mål anbefales for invertert mikroskop å unngå forskjeller i refractive indekser mellom prøven og målet. Videre bør oppmerksomhet vies til dekkglassvæske tykkelse, enten ved å bruke en korreksjon for en konflikt mellom målet og dekkglassvæske med korreksjon kragen på målet (hvis tilgjengelig) eller tilsvarende dekkglassvæske tykkelsen med sikte brukt.
I beskrevet protokollen tas nytte av lav-energi, nær infrarød lys for bildebehandling autofluorescence elastin og kollagen SHG. Dette gjør bildebehandling for lengre perioder. I menneskelig motstand arteriene brukt i denne studien, består IEL av et langs justert fiber-lignende nettverk av sammenhengende elastin fiber13,33, som ligner strukturen i IEL av menneskelig subkutan motstand arteriene (hSCA)38,39. Endringer i forgrening vinkler av elastin fibrene i IEL ble evaluert og brukes sammen med tiltak for gradvis uncoiling for adventitial kollagenfibre med økende press37 for å vurdere endringer i mikroarkitektur elastin og kollagen henholdsvis. Bildene for å vurdere elastin og kollagen microarchitectures ble oppnådd på samme område av interesse i arterieveggen på ulike trykk. Dette gjør gjentatte målinger analyser. Når etterforskeren kan sikte på å skaffe bilder i minst 3 områder av interesse, med bildet størrelse 10-50 µm i hver dimensjon. Avhengig av prøven, spesielt tykkelsen på arterieveggen, har imidlertid et kompromiss mellom antall skannede områder av interesse og mulig varigheten av forsøket. Ved menneskelig perikard motstand arteriene forble arteriene levende minst 8-12 h eksperimentering. Skanne flere områder av interesse tillater evaluering av intra-kontra Inter eksempel variasjon og støtter konklusjonen på fått resultatene.
Det er viktig å legge merke til at for å unngå inducing fototoksisk skade, bildebehandling med høy effekt eksitasjon lyset bør unngås når du arbeider med levende vevsprøver. I lys av dette, anbefales det å få de store bildestakker for kollagen og elastin volum tettheter på slutten av den eksperimentelle protokollen, alternativt på fast prøver. Når absolutte antallet ECM-komponenter, bør noen effekt av bindemiddel på volumet tettheter kvantifisert og tatt hensyn til. Fiksering og permeabilization av arteries kan videre farging av intracellulær mål av interesse når nødvendig. I denne protokollen utføres flekker for elastin med eosin på live arterien. Farging av elastin av bestemte sonder (f.eks alexa 633 hydrazide40) og kollagen (f.eks CNA3541), kan brukes sammen med andre flekker (f.eks phalloidin42) eller DNA, til en lettere vurdering volumetrisk tettheter og strukturelle organiseringen av andre strukturer rundt i arterieveggen. Denne muligheten kan gi forskningslaboratorier single-fotonet AC confocal utstyrt med en mulighet til å undersøke microstructural endringene i motstand arterier. Segmenter fra samme arterien kan være behandlet under ulike forhold, fast under press og fotografert på et senere tidspunkt å sammenligne effekten av anvendt behandling. Mål av interesse bør visualiseres imaging re cannulated, nytt trykksatt og farget fartøyene. Nytt cannulation og re pressurization kreves når strukturendringer regnes som elastin ikke kan fikses og dermed vil rekyl og endrer 3D strukturen fast arterien43,44. Ulempen med å bestemme strukturelle endringer i fast arterier er at flere segmenter å bli løst for sammenligning, og gjentatt-måling analyser kan ikke utføres.
Dataene innhentet med imaging kan direkte brukes til å beregne veggen stresset og påkjenningen og støtte forstå mekanikken i vaskulære veggen, som beskrevet i Bloksgaard, M. et al13. I dette arbeidet, en matematisk modell ble brukt for å karakterisere iboende stivhet av elastin og kollagen komponenter arterieveggen og beregne kollagen rekruttering stammer45,46 på grunnlag av beregnet stress belastning relasjoner. Bildebehandling støttes resultatene fra matematisk modellering, at kollagen i menneskelig motstand arterier ble allerede rekruttert på lav omkrets belastning og veggen stress. Kvantitative tiltak av mikroarkitektur av elastin og kollagen som er beskrevet i denne protokollen kan ytterligere utvidet, inspirert av det omfattende arbeidet utført på carotis arteriene6,8,47, 48 , 49 og aorta7,9,10,50,51: flere analyser kan inkludere vurdere den romlige fordelingen og mikroarkitektur av kollagen og elastin fiber innen de forskjellige lagene arterieveggen samt fiber retning vinkler (orientering med hensyn til den langsgående aksen). Bell et al. 15 adressert press indusert omorganiseringen av IEL og adventitial kollagen inkludert flerlags analytiske modell for å beregne stivhet og stress i hvert lag av arterieveggen. Disse forfatterne15 brukt menneskelig subkutan motstand arterier innhentet fra friske frivillige, og relaterte struktur og veggen påkjenninger på 3 og 30 mmHg, henholdsvis.
Metoden foreslått i denne protokollen forhåpentligvis motiverer videre undersøkelser og utvikling av microstructurally motiverte matematiske modeller for å forstå de mekaniske egenskapene av menneskelig motstand arterier i helse og sykdom. Med ytterligere endringer i metoden å inkludere også kollagen og elastin retning vinkler langs den langsgående aksen, glatt muskel celle volum tetthet, romlige fordelingen og orientering i arterial veggen kollagen og elastin distribusjon og orientering i tunika media, og elastin organisasjon og distribusjon i tunica adventitia, bildebehandling data kan feed videre utvikling av matematiske modeller, tilrettelegge forståelse av remodeling prosessen hypertensjon, diabetes og Metabolsk syndrom. Tilsvarende, som foreslått av Chen og Kassab for koronar mikrosirkulasjonen52,53, kan mikrostruktur-baserte modeller av menneskelig motstand arterier gi spådommer om arteriell mekanisk svar på makro-(hele arterien) og micro-(structure) mekanisk nivåer for hver bestanddel. Slike modeller må være basert på kvantitative data strukturelle parametere og mekaniske egenskaper enkeltlag og bestanddeler i arterieveggen av arteriene som stammer fra både friske frivillige og pasienter som lider av ulike sykdommer, mottar ulike farmakologiske behandlinger. Dataene er samlet på en standardisert måte og forhold på tvers av individer med ulike risikofaktor, sykdom og behandlingseffekt profiler. Metoden har potensial til å hjelpe forstå hvordan sykdommen og medisinske behandlinger påvirker menneskelig blodsirkulasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker dansk molekylær biomedisinsk bildebehandling sentrum på fakultetet of Natural Sciences, University of Southern Denmark, for bruk av laboratorier og mikroskop. Kristoffer Rosenstand og Ulla Melchior er anerkjent for utmerket kundestøtte med presset myography og bildebehandling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Science Tools | 15401-12 | ||
| Fine Science Tools | 11251-23 | ||
| Nikon | SMZ800N | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose | |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | ||
| Smiths medical Intl, UK | |||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | ||
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | ||
| Mettler toledo | |||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | ||
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | ||
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | ||
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | ||
| Nikon | Custom built | ||
| Spectra Physics, Mountain View, CA | |||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | ||
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | ||
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | ||
| Scotch TM | |||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
References
- Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
- Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
- van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
- Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
- Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
- Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
- Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
- Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
- Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
- Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001 (2015).
- Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
- Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
- Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
- Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
- Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
- Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
- Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
- Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
- Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108 (2010).
- Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022 (2008).
- Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
- Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
- Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
- Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. 2011 8th Ieee International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro, , 230-233 (2011).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
- Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients' Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
- Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
- Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
- Fung, Y. C. Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , 2nd, Springer-Verlag. (1993).
- Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998 (2014).
- VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
- Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
- Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
- Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
- Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760 (2013).
- Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111 (2015).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339 (2017).
