Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

레이블 없는 형광 현미경 검사 법에 의해, 인간의 저항 동맥에 콜라겐과 엘라 스 틴 압력 종속 마이크로아키텍처가 평가

doi: 10.3791/57451 Published: April 9, 2018

Summary

우리는 동시에 기계적 테스트 설명 하 고 절연, 동맥 벽의 3D 이미징 라이브 인간의 저항 동맥, 및 엘라 스 틴과 콜라겐 공간 조직 및 볼륨 밀도의 정량화에 대 한 피지 및 Ilastik 이미지 분석. 우리는 동맥 벽 역학의 수학적 모델에 이러한 데이터를 사용 하 여 논의.

Abstract

저항 동맥 개장의 병원 성 기여는 고혈압, 당뇨병 및 변화 증후군에서 설명 됩니다. 조사 및 건강 및 질병에 있는 인간의 저항 동맥의 기계적 성질을 이해 하기 위한 microstructurally 동기 수학적 모델의 개발을 이해를 돕기 위해 잠재력을가지고 어떻게 질병 및 치료 인간의 미세 혈관을 영향을 줍니다. 이러한 수학적 모델을 개발, microvascular 벽의 기계 및 마이크로아키텍처 속성 사이의 관계를 해독 하기 위해 필수적 이다. 이 작품에서는, 우리는 수동 기계 테스트 및 엘라 스 틴과 콜라겐 고립 된 인간의 저항 동맥의 동맥 벽에서의 마이크로 아키텍처의 동시 레이블-무료 3 차원 영상에 대 한 vivo 예 방법을 설명합니다. 관심의 어떤 종의 저항 동맥에 이미징 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 이미지 분석 측정 내부 탄력 있는 lamina 분기 각도 adventitial 콜라겐 직진도 피지 및 Ilastik 소프트웨어를 사용 하 여 결정 ii) 콜라겐과 엘라 스 틴 볼륨 밀도 사용 하 여 i) 압력 유도 된 변화에 대 한 설명 합니다. 그러나 가급적 모든 기계 및 이미징 측정 라이브, 끼얹는다 동맥에 수행 됩니다, 그리고, 다시 가압된 혈관의 후 고정 이미지와 표준 비디오 현미경 압력에에서 myography를 사용 하 여 다른 접근 방법 논의 했다. 이 대체 방법은 분석 방법에 대 한 다른 옵션이 있는 사용자를 제공 한다. 동맥 벽 역학의 수학적 모델에 기계 및 이미지 데이터의 포함을 논의 하 고 향후 개발 및 추가 프로토콜을 제안 하는.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

병원 성 기여 및 저항 동맥 리 모델링의 효과 고혈압, 당뇨병 및 변화 증후군1,2,3,,45에 설명 되어 있습니다. Microvascular 벽의 기계 및 마이크로아키텍처 속성 사이의 관계를 파악 하는 것은이 협회의 수학적 모델을 개발 하기 위한 필수적입니다. 이러한 모델 리 모델링 프로세스를 이해 하는 것을 향상 됩니다 고 철 모델 동맥 벽의 개장 대상 질환 관련 약리 전략을 테스트 하는 데 유용의 개발을 지원 합니다.

동맥 벽의 마이크로아키텍처 기계적 측정을 통합 하 여 동맥 벽 역학에 관한 방법과 마이크로아키텍처는 세포 외 기질 (ECM)의 대형에서 거의 독점적으로 수행 이해에 초점을 맞춘 사전 연구 쥐 또는 돼지6,7,,89,10,11에서 탄성 도관 동맥. 벽의 마이크로 구조의 화상 진 찰은 일반적으로 콜라겐, 엘라 스 틴과 제 2 고조파 발생의 autofluorescence를 활용 하는 비선형 광학 기술을 사용 하 여 수행 됩니다. Spatiotemporal 이미징을의 기질, 엘라 스 틴과 콜라겐, 얼룩이 지기를 위한 필요 없이 두 가지 주요 구성 요소 수 있습니다. 영상 전체 두께에 동맥 벽의 큰 도관 동맥 두꺼운 tunica 매체에 있는 빛의 분산 때문에 도전 이다. 그러나 어떻게 동맥 벽의 구조적 구성 요소의 마이크로아키텍처 관찰된 기계적 성질에 관련 된 결정, 3 차원 정보는 기계적 테스트 하는 동안 얻어야 합니다. 인간의 대동맥 같은 큰 동맥이 필요 합니다 biaxial 장착, 기계적 테스트 및 동맥 벽7,,910, 의 1-2 cm2 조각에 관심 영역의 이미징 12. 벽의 일부만 몇 군데 및 기계적으로 테스트할 수.

어떤 종류의 작은 동맥에 대 한 (예를 들어, 인간의 pericardial13, 폐14 및 피하15 동맥, 쥐 mesenteric 동맥16,,1718, 19 , 20, 마우스 cremaster, mesenteric, 대뇌, 대 퇴 및 경 동맥21,22,23,,2425,26, 전체 벽 두께의 27) 이미징이 가능 하며 기계적 테스트와 결합 될 수 있다. 기계적 성질 및 벽에서 구조적 조치의 동시 녹음 수 있습니다. 그러나, 직접 수학적 모델링 ECM의 3 차원 구조에서 관찰 된 변경 및 저항 동맥 벽의 변경 된 기계적 성질 사이 관계의 우리의 지식의 최선을 보고 되었습니다 따라 최근 인간의 저항 동맥13,15.

이 작품에서는, 수동 기계 테스트 및 엘라 스 틴과 콜라겐 고립 된 인간의 저항 동맥의 동맥 벽에서의 마이크로 아키텍처의 동시 3-차원 영상 비보 전 방법을 설명 합니다. 관심의 어떤 종의 저항 동맥에 이미징 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 이미지 분석 내부 탄력 있는 lamina 분기 각도 및 adventitial 콜라겐 직진도13 피지28를 사용 하 여 측정을 얻기 위해 설명 합니다. 콜라겐과 엘라 스 틴 볼륨 밀도 Ilastik 소프트웨어29 를 사용 하 여 결정 하며 마지막으로, 동맥 벽 역학의 수학적 모델에 기계 및 이미징 데이터를 포함 합니다.

설명 하는 수학적 모델링을 함께 기술 조사 설명 하 고 이해 하는 체계적인 접근 방법을 제공 하는 영상 및 이미지 분석의 목표는 저항 동맥의 ECM에 압력 유도 된 변화 관찰. 설명된 방법 20, 40, 100 mmHg에서 ECM의 구조를 비교 하 여 가압, 동안 선박에 ECM에 변화를 측정에 집중 된다. 이러한 압력은 각각의 더 준수 (20 mmHg), 뻣 뻣 한 (100 mmHg) 및 중간 (40 mmHg) 상태에서 동맥 벽의 구조를 결정 하기 위한 선정 됐다. 그러나, vasoactive 구성 요소, 히스테리시스 및 흐름에 의해 유도 된 변화를 포함 하 여 라이브 동맥의 혈관 벽에 어떤 과정 든 지 수 측정할 수, 조사 하 여 문제의 연구 가설에 따라.

라이브 동맥의 압력 (또는 다른) 유도 공부 하 고 변화는 ECM에 대 한 압력 myograph와 함께에서 2 광자 여기 형광 현미경 (TPEM)의 사용을 강조 했다. 첫째,이 동시 취득은의 높은 품질의 3 차원 레이블 없는 인수와 함께 동맥 벽 (직경 및 벽 두께)의 전체 3 차원 구조를 사용 하면 때문에 상세한 콜라겐과 엘라 스 틴의 이미지 엘라 스 틴 autofluorescence 및 콜라겐 두 번째 고조파 발생 신호 (SHG)30의 활용 하 여 설명13 마이크로아키텍처가. 둘째, TPEM 수 저-에너지 근처-적외선 여기 빛, photodamage 조직과 따라서, 혈관 벽 내에서 정확 하 게 동일한 위치에서 반복된 이미지의 최소화는 허용, 허용 반복 측정 분석의 관찰 변경합니다.

고정 동맥 압력의 공초점 이미지를 사용 하 여 다른 접근 방법의 사용 TPEM에 액세스 하지 않고 사용자가 뿐만 아니라 설명된 메서드를 사용 하는 기회 수 있도록 설명 되어 있습니다. ECM 구조와 볼륨 밀도 대 한 정보 예:31,32에 의해 설명 된 대로 직렬 구분 조직의 2 차원 분석에서 검색할 수 있습니다. 그러나,이 메서드를 사용 하 여 상태를 변경 하는 동안 뿐만 아니라 동맥의 길이 비늘 통해 3 차원 구조 정보를 검색 하는 가능성의 부족, 그것은 압력의 수사를 위해이 접근을 사용 하 여 권장 하지 고 치료는 ECM에서 3 차원 변화를 유도 한다.

여기에서 설명한 메서드를 적용할 수 사관에 대 한 최소 요구 cannulation 및 형광 현미경 confocal 또는 2 광자 여기와 함께에서 동맥의 가압에 대 한 설치 프로그램에 액세스입니다. 다음 프로토콜에서 설명 하는 설치 사용자 지정 내장된 거꾸로 2 광자 여기 형광 현미경에 내장 경도 힘 변환기와 맞춤식 압력 myograph 이다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

이 작품에 사용 하기 위해 인간의 정수 리 심장 막의 검의 컬렉션은 앞에서 설명한33후 서 면된 동의 수행 되었다. 인간의 조직 연구34 헬싱키의 선언 명시 된 원칙을 준수 하 고 (S-20100044 및 S-20140202) 남쪽 덴마크와 덴마크 데이터 보호 기관에 대 한 건강 연구 윤리에는 지역 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 수집 조직과 격리 (인간) 저항 동맥

  1. 수술 동안 절단 되는 즉시 관심의 조직 샘플을 수집 합니다. 4 ° c HEPES 전송 조직 생리 적 소금물 (HBS) 즉시 수집을 버퍼링 되 고 HBS에 저장.
    참고: 인간의 조직만 수집 됩니다 승인 다음 환자 서 면된 동의 서 관련 기관 및 윤리 위원회에 의해. Mm에서 HBS 구성: 144 NaCl, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH24 1.2, HEPES 14.9, 포도 5.5. NaOH로 pH 7.4에 조정 하 고 솔루션 비록 0.2 µ m 필터를 필터링.
  2. 마 취약을 씻어 하룻밤 4 ° C에서 살 균 HBS에서 수집 된 조직을 둡니다.
    참고: 선박 무결성 및 기능에 하룻밤 스토리지의 모든 효과 개별 연구 실험실에 의해 검사 되어야 한다.
  3. 신중 하 게 저항 크기의 동맥 (± 200 µ m 루멘 직경) 한 쌍의 날카로운 팁 집게와 마이크로 해 부가 위를 사용 하 여 격리 합니다.
  4. 이미징/압력 챔버를 못쓰게 하는 동안 얼음 HBS에 4 ° C에서 동맥을 저장 합니다.

2. 격리 된 동맥 압력 Myograph에 탑재

  1. Cannulae 보유자에 팁 직경 ~ 80 µ m의 유리 cannulae를 탑재 합니다. 팁 약 150 µ m을 챔버 유리 바닥 위에 놓습니다.
    참고: 45 ° 구부려 진 팁 cannulae 유리 바닥 위에 선박의 정확한 위치를 수 있습니다.
  2. 입구와 출구 튜브 1 %BSA HBS 압력 시스템에 연결.
    참고: BSA 내 피 세포의 기능을 유지 하기 위해 포함 됩니다.
  3. 정 당 2 개의 두 배 매듭 봉합을 사용 하 여 격리 된 동맥을 탑재 합니다.
    참고: 노트 미리 준비 고 필요할 때까지 두 배 접착 테이프에 저장 될 수 있습니다.
  4. HBS와 챔버를 입력 하 고 각 유리 정에 2 개의 두 배 매듭을 놓습니다.
    참고: 지금까지 조직적 톤을 표시 하는 동맥을 사용 하는 경우에 HBS 무료 HBS 3 µ M EGTA와 3 µ M 나트륨 nitroprusside 보충 칼슘 대체 되어야 한다.
  5. 날카로운 팁 집게의 두 쌍을 사용 하 여 한쪽에 동맥을 부드럽게 잡으십시오. 동맥의 루멘 열고 부드럽게는 정 맥에 그것을 슬라이드. 두 개의 노트를 사용 하 여 정에 수정.
  6. 부드럽게 루멘 HBS / 1%를 5 mmHg의 압력 BSA.
  7. 동맥의 다른 쪽 끝을 cannulate 하 고 2 개의 두 배 매듭을 사용 하 여 정 맥에 그것을 확보.
  8. 현미경 단계에는 myograph를 전송 하 고 5 mmHg에 동맥 압력 (입구 압력 출구 압력 =), 다음 30 분 동안 37 ° C에 열.
  9. 선택 사항: 보정 (1 g = 9.81 미네소타) 제조업체의 지침에 따라 경도 힘 변환기.
    참고: 그것은 중요 한 온도가 열 후 힘 변환기를 보정 필수적 이다.

3. 실험 수행: 이미징의 간선 직경, 벽 두께 및 콜라겐과 엘라 스 틴 마이크로아키텍처 TPEM를 사용 하 여

  1. 신속 하 게 스캔 5 mmHg에서 선박 직경 및 벽 두께 평가 하는 20 X 목표 (수 가늠 구멍 (NA) ≥ 0.8) 및 저전력 여기 빛을 사용 하 여 5 mmHg 압력 cannulated 동맥.
    참고: 거꾸로 현미경 사용 물 침수 목표; 똑바로 현미경 목표를 담그고 물 사용 하 여. 목표에 커버 슬립 두께 대 한 해결 하기 위해 수정 칼라 없는 경우 사용 하는 목적으로 사용 된 커버 슬립에 맞게 있는지 확인 합니다. 소프트웨어 설정 및 설명 사용자 interphase 현미경 및 사용 소프트웨어에 따라 달라질 수 있습니다.
    1. 광학 경로 설치.
      1. 마이 타이 2 광자 레이저를 활성화 하 고 820 nm 여기 빛을 설정 합니다.
        주의: 어떤 표시 뿐만 아니라 눈에 보이지 않는 레이저 빛에 노출을 하지 마십시오.
      2. 2 개의 채널에서 동시에 방출을 수집 합니다. 460 nm 긴 패스 dichroic 거울 및 수집 방출 가운데 520에 30-60 nm 넓은 대역 통과 필터를 사용 하 여 사용 하 여 photomultipliers 사이의 빛 방출 분할 (엘라 스 틴) 및 410 nm (콜라겐), 각각.
    2. 10 µs 레이저 면만 시간/픽셀 및 512 × 512 연속 스캔 100%의 시야에 대 한 픽셀을 사용 합니다.
    3. 수동으로 최대 직경을 관찰 하는 깊이 결정 하는 동맥을 통해 검사 합니다.
    4. 동맥의 가장 넓은 직경 취재 사각형 슬라이스를 선택 하 고 픽셀 크기 ≤ 300 nm/픽셀 (그림 2C) 단일 프레임 스캔. 낮은 빛 전원 및 라이브 동맥 photodamaging을 피하기 위해 가능한 픽셀 면만 시간으로 사용 합니다.
      참고: 것이 좋습니다 예를 들어직사각형,., 시간을 절약 하 고 조직의 광자 노출 (그림 2C) 제한에이 위치에 이차 이미지 보다는 100 × 1024 픽셀 이미지.
    5. 나중에 분석을 위해 이미지를 저장 합니다.
  2. 동맥의 최대 직경에 루멘 직경과 벽 두께 결정 합니다.
    1. 피지에서 이미지를 로드 합니다.
    2. 메인 메뉴를 클릭 하 여 눈금을 설정 | 분석 | 설정 규모 µ m/픽셀 픽셀 비율 (좋습니다 계속 픽셀 비율 1:1)을 입력 하십시오.
    3. 피지 도구 선택 및 동맥 루멘의 각 측면에 두 개의 내부 탄성 하기 사이 선을 인출 하 고 ctrl + M을클릭 합니다. 피지는 결과 테이블에는 기본으로 길이 보고합니다.
    4. 마찬가지로, 더 많은 선을 각 벽의 두께 측정 하 고 ctrl + M을 측정 하는 다음 태그를 클릭 합니다.
    5. 측정을 저장 합니다.
  3. 검색 전체 벽의 두께 동맥, 동맥의 길이 따라 관심의 1-3 지구에 대 한 좋은 품질을 가진 3D 이미지 스택을 취득 하 여 5 mmHg에서 이미지 콜라겐과 엘라 스 틴 마이크로아키텍처.
    1. 목표, 나 ≥ 1, 최적화 된 픽셀 크기와 z-간격 X 60을 사용 하 여 동맥의 전체 벽을 통해 이미지 스택을 가져옵니다.
      1. 광학 경로, 침수 매체에 따라 최적의 이미징 조건 (픽셀 크기와 z-단계 간격)를 계산 하 고 과학적인 볼륨 이미징 Nyquist 계산기 (https://svi.nl/NyquistCalculator)를 사용 하 여 굴절 인덱스 샘플.
        참고: 여기 섹션 3.4에에서 최적의 픽셀 크기와 z-조언 대 간격의 차이에 관심을 지불 하시기 바랍니다. 위의 최대 픽셀 크기의 사용에.
    2. 동일한 여기 및 방출 설정을 (3.1.1) 위에 사용 합니다.
    3. Z 스택의 두께 확인 하려면 위에서 설명한 대로 신속 하 게 혈관 벽을 검사 합니다.
    4. Z-스택 시작 및 끝 깊이, z 단계 간격 및 픽셀 밀도 (3.3.1.1의 계산)을 정의 하 고 z-스캔을 수행. 각 채널을 별도로 저장 합니다.
      참고: 이미지 다음 이미지 분석에서 곡률의 어떤 영향을 피하기 위해 선박 크기에 따라 충분히 작은 예를 들어 30 µ m x 30 또는 50 × 50 µ m 이어야 합니다.
  4. 동맥 직경, 벽 두께, 그리고 프로토콜의 나머지 압력에서 엘라 스 틴과 콜라겐 마이크로 아키텍처를 결정 합니다.
    1. 3.1-3.2 압력 10 및 20 mmHg에서 반복, 반복 압력 20 mmHg에서 3.3.
    2. 3.1 및 3.2 압력 40 mmHg에서 반복 합니다.
    3. 3.1-3.2 압력 60, 80, 및 100 mmHg에서 반복 하 고 반복 3.3 100 mmHg에서.
      참고: 3.1-3.3 모든 압력, 그리고 테스트를 가설에 따라 (예: 시리즈/조합의 증가 뿐만 아니라 감소 압력), 압력의 조합에 대 한 반복 수 있습니다. 오신 농도 0.3-1 µ M photobleaching의 경우 엘라 스 틴 autofluorescence 향상에 추가할 수 있습니다. Photobleaching은 저전력 구동 가능한 빛으로 적용 하 여 피할 수 있습니다.
    4. 각 압력 단계 후 신선한 37 ° C HBS 가진 myograph 챔버에 버퍼를 교체 합니다. 동맥 압력에 각 변경 다음 이미징 이전 5 분에 대 한 적응 하실 수 있습니다.
  5. 채널 스택 이미지 분석을 위한 별도로 저장 합니다.
  6. 동맥의 생존 능력을 테스트 합니다.
    1. 10 적용 안정적인 수축 관찰 µ M U46619 myograph 상공에서 10 µ M bradykinin의 추가 의해 따라.
    2. 3.1 화합물의 각각의 응용 프로그램을 다음 섹션에서 설명한 것 처럼 직경 및 벽 두께 기록 합니다.
    3. 동맥은 하지 완전히 열려진 bradykinin 및 기록 직경과 벽 두께의 추가 따라 3 µ M 나트륨 nitroprusside를 추가 합니다.
      참고: (혈관 침대 및 종) 동맥의 약리학 속성에 따라 다른 vasoconstrictor 및 (endothelium 종속) vasodilator 화합물 사용할 수 있습니다.
  7. 선택 사항: 가압된 동맥을 수정 하거나 콜라겐과 엘라 스 틴 볼륨 밀도 (단계 7)에 대 한의 이미지를 계속 합니다.
    1. 4% 포름알데히드 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 37 ° C 1 시간에서 x 1에 추가 합니다.
    2. 1 x PBS에 고정된 동맥 세 번 세척 하 고 매듭 외부 동맥의 부분만 만지기 cannulae에서 동맥을 부드럽게 밀어. 매듭 제거, 스토리지 튜브를 전송할 때 동맥을 들고 그들을 사용 하지.
    3. PBS x / 0.05 %1에 게 엘라 스 틴과 콜라겐 볼륨 밀도 또는 다른 목적에 대 한 이미지까지 4 ° C에서 나트륨 아 지 드.
      참고: 고정 된 동맥은 PBS x / 0.05 %1에서 3 개월 이상 저장 될 수 있다 나트륨 아 지 드 4 ° c.에

4. 스트레스 긴장 관계 및 내장 벽 강성 계산

  1. 수식 및 계산 계산 하는 스트레스, 긴장, 및 벽 강성 Bloksgaard, M. 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 단계를 따르십시오 13 그리고 여기 참조입니다.

5. 이미지 분석-(내부 탄력 있는 Lamina) IEL 분기 각도

  1. 피지에서 이미지 열기 스택입니다. 이동 파일 | 열기 이미지 이미지 스택을 선택 하.
    참고: 2-7 연속 z-섹션 (1-2 µ m 두께) IEL 취재의 최대 강도 예측 IEL 엘라 스 틴 섬유 분기 각도 피지28,35에서 각 도구를 사용 하 여 결정 하는 데 사용 됩니다. 그림 그림 4A 를 참조 하십시오.
  2. 이동 이미지 | 스택 | z 프로젝트... "최대 강도 투영" 이미지를 선택 하.
  3. 최대 강도 프로젝션 TIFF로 저장 합니다.
  4. "각도 도구"를 사용 하 여 가능한 많은 IEL 섬유 분기 포인트를 선택 하 고 이미지를 통해 체계적으로 작동. Ctrl + M 각 각도 측정을 클릭 합니다.
  5. 피지 결과 시트를 저장 합니다.

6. 이미지 분석-Adventitial 콜라겐 파형

  1. 피지에서 이미지 열기 스택입니다. 이동 파일 | 열기 이미지를 이미지 스택을 선택.
    참고: 최대 강도 계획 2-7 연속 z-섹션의 콜라겐 파형 Rezakhaniha, R에 의해 설명 된 대로36 피지 NeuronJ 플러그인 사용 하 여 결정 하는 데 사용 됩니다 취재 콜라겐 바로 외부 탄력 있는 lamina (장 어, 1-4 µ m 두께) 밖 . . 37 (그림 4B)입니다.
  2. 규모를 설정 합니다. 이동 분석 | 규모 설정 픽셀 크기를 입력 하.
  3. 이동 이미지 | 스택 | z 프로젝트... 와 함께 작동 하도록 이미지와 "최대 강도 투영"를 선택 하.
  4. 클릭 하 여 8 bitt TIFF 이미지 형식을 변경 이미지 | 종류 | 8 bitt 최대 강도 프로젝션 TIFF로 저장 하 고.
  5. 콜라겐 섬유 직진도 피지 뉴런 J 플러그인을 사용 하 여 측정 합니다.
    1. 피지를 클릭 하 여 NeuronJ 플러그인을 엽니다 | 플러그인 | 뉴런 J.
    2. 부하 이미지를 클릭 하 여 NeuronJ에서 8 비트 TIFF를 엽니다 | 선택 파일.
    3. 경시를 추가클릭 하 고 시작 및 각 섬유의 끝을 클릭 하 여 분석 하는 섬유를 선택 합니다.
    4. 대화 상자에서 추적 표시 (Lf) 및 정점 측정 을 선택, 측정 경시를 클릭 합니다.
  6. L0/Lf 계산에서 excel (또는 비슷한) 결과 저장 하 고.
    1. 복사 및 붙여넣기 excel 피지 뉴런 J 경시 및 정점 출력 (또는 유사한) L0 계산 및 꼭지점 측정에서 피타고라스의 정리를 사용 하 여. 줄에 첫 번째 및 마지막 포인트 2D 좌표계에서 사변의 끝의 위치를 나타냅니다.
      참고:는 L0/Lf [직선 (L0) 통해 콜라겐 섬유 번들 엔드-투-엔드 길이 / 전체 길이 (Lf)] 1 가까이 거의 직선 콜라겐 섬유를 나타냅니다.

7. 콜라겐과 엘라 스 틴 볼륨 밀도 대 한 이미징

  1. (고정된) 동맥 1 세척 PBS에 x와 어둠 속에서 1 x PBS에서 1 µ M 오신에 15 분 동안 그것을 얼룩. 고정된 동맥에 대 한 실 온에서이 단계를 수행 합니다.
    참고: 오신 엘라 스 틴 형광을 향상 시킵니다. 오신 경우 샘플은 얼룩 솔루션에 오랜된 시간에 대 한 콜라겐과 세포 세포질 같은 다른 구조를 얼룩 것입니다. 다른 구조의 얼룩이 너무 강렬 하지 않으면, 오신 0.3 μ m의 농도 낮추거나 세척을 반복.
  2. 씻어 동맥 3 x 1 x PBS에서
    1. 고정 동맥: 이미징 동맥을 탑재.
      주의: 비 가압 혈관의 영상 기하학 양적 정보 검색을 허용 하지 않습니다. 절대 양이 필요한 때, 이들은 항상 라이브, 가압 동맥에 얻은 합니다. 볼륨 비율 비 가압 동맥에이 방법으로 얻을 수 있습니다.
      1. 장소 두 조각의 두 배 접착제 테이프 1-1.5 c m 간격 개체 유리에. 두 배 접착 테이프 약 100 µ m 두께입니다. 테이프를 장착할 동맥의 직경에 맞게 하나 이상의 레이어를 적용 합니다.
      2. 광장 한가운데에 유리에 PBS의 10-20 µ L를 놓고 PBS 드롭에서 동맥을 배치 합니다.
        참고: 드롭 작은 고을 피하기 위해 커버 슬립을 장착 위치에서 동맥을 추진 가능한 평면 이어야 한다.
      3. coverslip 놓고 이중 접착 테이프에 누릅니다.
      4. 1 x PBS에 coverslip 개체 유리 사이 저수지를 채우십시오. 그것은 샘플의 건조를 피하기 위해 매 시간 마다 리필.
  3. 콜라겐과 엘라 스 틴에 대 한 이미지-스택 볼륨 밀도 나 20 X 목표를 사용 하 여 얻을 여전히 좋은 광학 해상도 (2D 그림, 2 세대 그리고 2 H) 하면서 가능한 동맥 벽의 많은 커버 > 1.
    참고:는 coverslip 아래 고정된 동맥의 이미징에 대 한 물 침수 목표를 사용 하 고 중요 한 동맥의 이미징에 대 한 목표를 담그고 물을 사용. 목표에 커버 슬립 두께 대 한 해결 하기 위해 수정 칼라 없는 경우 일치 하는 목표에 coverslip 있는지 확인 합니다. 가급적 최적의 픽셀 크기와 z-간격을 사용 합니다. 나이 키스 트 계산기 (단계 3.3.1.1.)를 사용 하 여이 계산 합니다. 또는, 300 nm의 최소 픽셀 크기와 z-1 µ m의 간격을 사용 합니다. 그것은 사용자를 내부 분석 결과 변화를 결정할 수 있도록 동맥의 길이 따라 3 개의 이미지를 구하는 것이 좋습니다.
  4. 820 nm 여기 빛 및 수집 방출 사용 하 여 30-60 nm 넓은 대역 통과 필터를 사용 하 여 이미지 엘라 가운데 520에 nm.
  5. 엘라 스 틴과 다른 autofluorescent 단백질의 어떤 자극을 방지 하 고 방출 사용 하 여 10-30 nm 넓은 대역 통과 필터 가운데 495에 수집을 990 nm 여기 빛을 사용 하 여 이미지 콜라겐 nm.
  6. 별도로 TIFF 파일로 이미지 스택을 각 채널에서 저장

8. 이미지 분석 엘라 스 틴과 콜라겐 볼륨 밀도 Ilastik를 사용 하 여 추출에 대 한

  1. TIFF 이미지 스택을 HDF5 선택 파일을 클릭 하 여 피지28,35 를 사용 하 여 변환 | 다른 이름으로 저장... HDF5.
  2. 컴퓨터 하드 드라이브, 한 엘라 스 틴, 콜라겐 이미지 스택 하나에 각각 두 개의 데이터 파일 폴더를 만듭니다. 관련 이미지 스택을 관련 폴더에 복사 합니다.
  3. 엘라 스 틴, 콜라겐, 한 중 Ilastik 소프트웨어에 각각 두 개의 새로운 Ilastik 프로젝트를 만듭니다.
    1. Ilastik를 열고 | 새 프로젝트 만들기 | 픽셀 분류 | 새 프로젝트 | 데이터 추가 및 선택 이미지 폴더 단계 8.2에서에서 만든.
      주: Ilastik 마법사를 따릅니다.
  4. 소프트웨어를 훈련 한 3D 이미지 스택을 가져옵니다.
    1. 입력 데이터 애플릿 선택 | 주요 작업 영역 | 원시 데이터 탭 | 추가 새로운... | 별도 이미지를 추가 원하는 이미지 데이터를 선택 하 고
  5. 소프트웨어에 관련 된 기능을 선택 합니다.
    1. 오픈 기능 선택 애플릿 | 기능 선택 는 새로운 대화 상자를 엽니다. 자세한 내용은 그림 5A 를 참조 하십시오.
  6. 훈련 애플릿 아래 레이블 추가 단추를 사용 하 여 두 개 이상의 레이블을 추가 합니다.
    참고: 각 레이블을 구분 하는 개체 형식에 대응 됩니다. 이 작품에서 세 레이블을 엘라 스 틴 사용 됩니다: 엘라 스 틴 자체, (제외)에 밝은 반점, 및 배경 (제외).
  7. 페인트 브러시 스타일 주석 도구를 사용 하 여 raw 이미지 스택 위에 라벨을 그립니다.
    1. 적절 한 레이블을 선택: 브러시 도구와 그리기 시작을 클릭 합니다.
  8. 이미지 스택 분석 하 고 라이브 업데이트 사용을 클릭 하 여 비슷한 기능을 찾고 하는 Ilastik 라는 표시.
  9. 확인 신중 하 게 예측 지도 (그림 5D).
    참고: 프로세스 raw 이미지에서 완전 한 예측 지도를 그림 5에 표시 됩니다. Ilastik 사용 하 여 이미지를 세그먼트에 예측 지도 레이블 픽셀은 더 될 것에 따라 스택 (그림 5D) 관련.
  10. 임계값을 적용 합니다.
    1. 임계 처리 애플릿선택, 적절 한 방법, 입력된 레이블, 부드러운, 임계값 및 필터 매개 변수를 크기 선택한 마지막으로 적용을 클릭 합니다.
      참고:이 개별 개체에 이미지의 유사 하 게 레이블이 지정 된 부분을 분리. 엘라 스 틴과 콜라겐 같은 고도로 연결 된 조직 분리 될 필요는 없습니다, 따라서, 0.4의 임계값이 적용 됩니다 (기본값은 0.5). 그림 5E5F 임계값을 적용 한 결과를 보여 줍니다.
  11. 결과 만족 될 때까지 Ilastik의 훈련을 반복 (엘라 스 틴, 콜라겐 각각은 각각 분석에 대 한 인식).
    1. 자주 전환 훈련 및 세분화 (및 또한 때때로 임계 처리) 애플릿을이 과정. 다시 Ilastik를 교육의 효과의 예는 그림 6에 표시 됩니다.
  12. 비슷한 이미지 데이터를 분석 하는 일괄 처리: 일괄 처리 예측 입력된 선택 선택 하 고 관련 파일을 추가.
    참고:는 Ilastik 출력 엘라 스 틴 (콜라겐)의 부재와 조의 존재를 나타내는 1 (하나) (0) 나타내는 0 의사-1 비트 3D 이미지 스택 (이미지 마스크)의 모음입니다 (실제 비트 깊이 8-비트).
  13. 이미지 마스크와 raw 이미지 파일을 시각적으로 비교 하 여 각 이미지 스택에 대 한 결과 확인 합니다.
  14. Ilastik 마스크 (단계 8.4-8.9)을 최적화 하 고 다시 모든 이미지 스택을 불만족 결과 분석.
  15. Ilastik 이미지 마스크를 사용 하 여 MATLAB에서 엘라 스 틴과 콜라겐 볼륨 밀도 계산
    1. MATLAB을 엽니다.
    2. Ilastik 이미지 마스크 MATLAB "현재 폴더" 폴더 선택 창.
    3. MATLAB 편집기로 보충 파일 1 에서 MATLAB 스크립트를 복사 하 고 컴퓨터 하드 드라이브에 MATLAB 폴더에 volumeCalculator.m로 코드를 저장 합니다.
    4. 픽셀 크기와 픽셀 높이 스크립트 라인에 입력 한다
      pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; % 미크론 * 미크론
      pixelHeight = 0.9; % 미크론
    5. 스크립트를 저장 합니다.
    6. MATLAB 명령 창으로 이동 하 고 입력 "volumeCalculator (' 경로 데이터 ')" 스크립트를 로드.
    7. 클릭 입력 합니다. 각 이미지 마스크 이제 정리 하 고 (알려진된) 픽셀/복 볼륨 (z 축 해상도 곱한 픽셀의 물리적 크기)를 곱한. MATLAB에서 출력은 엘라 스 틴과 콜라겐 각 이미지 스택의 총 볼륨입니다.
  16. 결과 저장 합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

이 작품에 사용 된 이미지에 대 한 맞춤식 압력 myograph는 그림 1에 표시 됩니다. 작은 볼륨 (2 mL)와 ii) 가까이, 그리고 유리 바닥 (그림 1B) 병렬 cannulae 포지셔닝을 위한 가능성 i)는 챔버는 myograph의 디자인에 대 한 특별 한 주의 지불 했다. 챔버의 바닥에는 50 × 24 mm #1.5 유리 coverslip (교체) 맞는. 압력 컨트롤러는 표준 1 L 유리 병 및 혈압 (커 프 스 제거)에서 건축 되었다. 흐름 요구 사항 myograph 설정, 서보 압력 컨트롤러를 사용 하 여 것이 좋습니다.

그림 2 에서는 실험 프로토콜에 명시 된 기간 동안 단일 이미지와 이미지 스택을 위한 권장된 위치를 보여 줍니다. 그림에서는 탑재 된 동맥의 전송 가벼운 현미경 이미지 그림 2A에 포함 되어 있습니다. 탑재 된 동맥의 매듭-매듭 길이 약 1.6 m m 이다. 까지 넓은 직경 (그림 2B), 관찰 하 고이 시점에서, 직경 및 벽 두께 동맥 검사 (그림 2C) 결정. 마찬가지로, 동맥의 전송 빛 이미지 그림 2D, 위치 표시에 포함 이며 권장 이미지 스택 (그림 2E) 콜라겐과 엘라 스 틴 (그림 2F, 작은 마이크로아키텍처가 결정의 폭 그림2d에서 광장) (그림 2G) 콜라겐과 엘라 스 틴 (그림 2 H) 볼륨 밀도 (더 큰 사각형, 그림 2D)를 결정 하기 위한 이미지 스택 뿐만 아니라. 이 방법을 사용 하 여, 압력 직경 곡선, 뒤에 해당 응력-변형 곡선의 계산을 생성 하기 위한 데이터 압력, 직경 및 벽 두께 측정 (그림 2C)에서 얻을 수 있습니다.

Bloksgaard 외 알에 따라 응력-변형 관계의 단일 지 수 적합. 13 참조 여기, β 값, 벽 강성 증분 탄성 계수, Einc에 비례의 형상 독립적인 측정을 제공 합니다. 엘라 스 틴과 콜라겐의 마이크로아키텍처가에 압력 유도 된 변화 사이의 관계에 대 한 직접 분석 수 Einc 콜라겐과 엘라 스 틴에 대 한 어떤 이미지에 마이크로아키텍처가 가져온, 다른 압력 계산 그리고 다른 압력 (그림 3)에서 증분 탄성 계수. IEL 분기 각도 콜라겐 직진도의 측정은 그림 4에 나와 있습니다.

관심, 예를 들면 고혈압 vs normotensive 환자, 두 개 이상의 그룹을 비교 하는 기계적 데이터의 해석에 대 한 중요 한 엘라 스 틴과 콜라겐의 내용의 결정이 이다. 이 위해, Ilastik, 특정 이미지 기능을 인식 하기 위하여 훈련 될 수 있다 프리웨어 이미지 분석 소프트웨어에서에서 자동 분석 방법 개발 되었다. Ilastik에서 작업 흐름은 그림 5에 나와 있습니다.

엘라 스 틴과 콜라겐 볼륨 밀도 대 한 자동 검색에 대 한 얻은 이미지는 좋은 신호 대 잡음 비율은 중요 하다. 인간의 샘플에서 콜라겐에서 중요 한 autofluorescence 콜라겐 SHG 신호 이외에 자주 관찰 됩니다. 이 엘라 스 틴의 검출에 대 한 신호 대 잡음 비율을 감소합니다. 그림 6 에서는 어떻게 "녹색"에 중요 한 콜라겐 autofluorescence 샘플에 얇은 엘라 스 틴 섬유의 더 나은 인식 될 수 있습니다 다시 Ilastik 프로그램의 훈련 / 엘라 스 틴 채널. 콜라겐 SHG 채널에 autofluorescence 신호의 피가 통해 문제가 경우, SHG 신호는 더 이상 여기 파장을 사용 하 여 얻는 도움이 될 수 있습니다. 채널을 통해 출혈 하는 경우 발생 합니다 오신와 얼룩 후 오신의 적용된 솔루션의 농도 낮춰야 한다. 오신은 쉽게 씻 겨, 그래서 반복된 세척 얼룩진된 샘플의 신호도 저하 될 수 있습니다.

Figure 1
그림 1 . 사용자 정의 내장 형광 이미징에 대 한 압력 myograph. (A) 살포 약 실 유리 모 세관, micromanipulators에 연결 된와 힘 변환기 (경도 힘)에 탑재 되는. (B) 2 mL 챔버 이미징입니다. 거꾸로 현미경을 사용 하 여 이미징 용이 cannulae의 45 ° 굴곡. (C) 압력 컨트롤러입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . Myography 압력 및 형광 이미징 전략을 결합 하 여. (A) 전송 (B) 동맥의 전체 폭의 스캔의 일러스트와 함께 동맥의 빛 이미지 콜라겐 SHG 녹색과 자홍색으로 엘라 스 틴 autofluorescence에 표시 됩니다. (C). 동맥 루멘 (여기 238 µ m) 직경과 벽 두께 (여기 17 및 18 µ m 위쪽 및 아래쪽, 각각) 동맥의 적도 지역 (관찰 하는 가장 큰 지름)에 따라 결정 됩니다. (Z-스택 (E) 콜라겐 직진도, 결정에 대 한 10-50 µ m 가늠 자에서 얻은 내부 탄력 있는 하기의 (F) 분기 각도 위치 (G) z-스택 50-100 μ m에서의 일러스트와 함께 동맥의 D) 전송 빛 이미지 (H) 엘라 스 틴과 콜라겐 볼륨 밀도 얻기에 대 한 소수 자릿수입니다. B/c: 이미지 (바 20 µ m), 높이 300 µ m (바 10 µ m), 50 µ m x E/f: 50 G/H 130 × 130 × 30 µ m (바 = 30 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . Microstructural 변화 adventitial 콜라겐 및 내부 탄력 있는 lamina (IEL)과 20, 40, 100 mmHg에서 원주 증분 탄성 계수에 대 한 그들의 관계. (A)는 IEL에 엘라 스 틴 섬유의 분기 각도. (B) 외부 탄력 있는 lamina에 가까운 adventitial 콜라겐 섬유의 직진도. p-값과 F 값에 따라 반복된 측정을 사용 하 여 결정 했다 단방향 배치법: p/F-values a: 0.0014/24.18, b: 0.0002/37.38. (C) IEL 분기 각도 Einc와 되를 상관 한다. (D) 콜라겐 직진도 Einc와 선형으로 상관 한다. 데이터는 ± SE Microstructural 의미 표시 됩니다 변경 (A와 B, 그리고 C와 D의 x-axes) 중요 한 이미징 동안 전자inc (C 및 D) myography 표준에서 압력을 복종 하는 20 다른 동맥에 대 한 계산 대상이 6 저항 동맥에 대 한 결정 myograph 압력. 다른 개인에서 각 동맥을 공부 했다. 이 그림은 Bloksgaard 에서 수정 되었습니다. 13. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . IEL 분기 각도 피지에 콜라겐 직진도의 측정 그림. (A) IEL 분기 각도 수동으로 표시 되 고 피지 각 도구를 사용 하 여 측정. (B) 콜라겐 직진도 섬유 (오렌지)의 실제 엔드-투-엔드 길이 나눈 직선 (흰색)를 통해 단일 콜라겐 섬유의 엔드-투-엔드 길이 비로 피지 뉴런 J 플러그인을 사용 하 여 결정 됩니다. 바 크기: 20 µ m.

Figure 5
그림 5 . Ilastik 워크플로. (선택 된 기능의 표시 A) 기능 선택 창입니다. (엘라 스 틴 섬유, 밝은 반점 (바라지 않는) 및 배경 (C) 레이블 B) 예 raw 이미지 각각 빨강, 녹색 및 파랑에 강조. (D) (C)에 표시 된 레이블 이미지 (B)에 대 한 예측 지도 결과. ((E) 하기 전에 (d) 예측 지도 기반으로 하는 E) 세분화 그리고 (F) 후 0.5의 임계값을 적용. 노란 색깔 차별된 기능 (엘라 스 틴)에 해당 하는 연결 된 픽셀을 보여 줍니다. 바 크기: 25 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 . 예를 들어 이미지 Ilastik 예측의 최적화 전후 다시 콜라겐 (최적의 신호 대 잡음 비)에서 높은 배경 형광 샘플에 엘라 스 틴 섬유의 인식에 대 한 Ilastik 훈련의 효과 보여주는 지도. (A) 원본 이미지, 특히 얇은 엘라 스 틴 섬유 (이미지 B의 왼쪽) 세분화에 포함 되지 않은 첫번째 Ilastik 분석 결과 (B) 및 (C) 최종 결과 예측 지도의 최적화에 따라. 바 크기: 25 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 제발이이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

이 작품이 나타냅니다 접근을 위한 표준화 된, 결합 된 이미징 및 압력 myography, 저항 동맥과 압력 관련 된 변화는 동맥의 구조에서의 기계적 특성의 동시 평가 대 한 귀중 한 우리의 제안을 0에서 100 mmHg의 압력 범위 벽. 그러나 제시 방법은 사용자 지정 건설된 장비를 사용 하 여 개발 되었다,, 어떤 압력 myograph 2 광자 여기 형광 현미경에 맞는 경우 사용할 수 있습니다, 두 장비의 디자인 수 동맥 벽의 영상. 모양, 폭 및 목적과 조건 되는 이미징 수행 됩니다의 거리에 특별 한 주의 지불 합니다. 똑바로 현미경 샘플 및 목표 간의 굴절율 차이 피하기 위해 거꾸로 현미경 물 침수 목표의 사용을 권장 하는 반면 물 찍기 목표를 사용을 해야 합니다. 또한, 관심에 지불 되어야 합니다 coverslip 두께 목적과 목표 (있는 경우)에서 보정 칼라를 사용 하 여 하는 coverslip 사이 불일치에 대 한 보정을 적용 하거나 coverslip 두께 목표와 일치 하 여 사용.

설명된 프로토콜에서 장점은 이미징 엘라 스 틴 autofluorescence과 콜라겐 SHG에 대 한 낮은 에너지, 근처-적외선 빛의 가져온 것입니다. 시간의 연장된 기간에 대 한 이미지 수 있습니다. 이 연구에 사용 된 인간의 저항 동맥에는 IEL는 상호 엘라 스 틴 섬유13,33, 인간의 피하 저항의 IEL의 구조와 유사한 경도 정렬 된 섬유와 같은 네트워크 구성 동맥 (hSCA)38,39. 분기 각도 IEL에 엘라 스 틴 섬유의 변화 했다 평가 및 엘라 스 틴의 마이크로아키텍처에 변화를 평가 하기 위해 측정 압력37 증가 함께 adventitial 콜라겐 섬유의 점진적 풀기의 함께 사용 하 고 콜라겐 각각. 엘라 스 틴과 콜라겐 마이크로아키텍처가 평가 대 한 이미지는 서로 다른 압력에서 동맥 벽 내 관심의 동일한 지역에서 얻은 했다. 반복 측정 분석 수 있습니다. 가능한 경우, 조사 각 차원에서 이미지 크기 10-50 µ m와 관심, 3 영역에 이미지를 얻는 목표 수 있습니다. 그러나, 샘플, 특히 동맥 벽의 두께 따라 타협 관심 스캔된 영역 수와 실험의 가능한 기간 사이 만들 수 있다. 인간의 pericardial 저항 동맥의 경우 동맥 실험의 적어도 8-12 h 동안 살아 남아 있었다. 관심의 여러 지역 검색의 내부-간 샘플 변화 대 평가 허용 하 고 얻은 결과에 따라서 결론을 지원.

Phototoxic 손상 유도 방지 하는 주의 하는 것이 중요 하다, 높은 전력 여기 빛을 사용 하 여 이미징 살아있는 조직 표본에서 작업할 때 피해 야 한다. 이 비추어 것이 좋습니다 또는 콜라겐과 엘라 스 틴에 대 한 큰 이미지 스택 실험 프로토콜의 끝에 볼륨 밀도 얻기 위해 고정된 샘플에. ECM 분 대의 절대 수량 필요한 경우 볼륨 밀도에 정착 액의 어떤 영향 정량 고 고려 해야 합니다. 고정 및 permeabilization 동맥의 수 또한 필요할 때 관심의 세포내 대상의 얼룩. 이 프로토콜에서 엘라 스 틴에 대 한 얼룩은 수행 라이브 동맥에 오신을 사용 하 여. 다른 얼룩 (예를 들어, phalloidin42)와 함께 적용 될 수 있습니다 특정 프로브 (예를 들어, 알 렉 사 633 hydrazide40) 및 (예를 들어, CNA3541), 콜라겐 엘라 스 틴의 얼룩 또는 DNA 평가 촉진 하기 체적 밀도와 동맥 벽의 다른 구조의 구조 조직. 이 기회를 제공할 수 있습니다 연구소 단일 광자 공초점 현미경으로 저항 동맥에 microstructural 변화를 조사 하는 기회. 같은 동맥에서 세그먼트는 다른 조건 하에서 취급, 압력 하에서 고정 고 적용 된 치료의 효과를 비교할 나중 단계에서 몇 군데 될 수 있습니다. 관심의 대상 다시 cannulated, 다시 가압 및 스테인드 혈관 영상으로 시각화 한다. 구조적인 변화는, 엘라 스 틴 돌이킬 수 없는 및 따라서 것 이다 반동 하 고 간주 고정된 동맥43,44의 3 차원 구조를 변경 하는 경우 다시 cannulation 및 재 가압이 필요 합니다. 고정 된 동맥에 구조적인 변화를 결정의 단점은 여러 세그먼트 비교를 위해 고정 해야 하 고 반복 측정 분석을 수행할 수 없습니다.

데이터 이미지를 사용 하 여 얻은 벽 그리고 긴장, 계산 하 고 혈관 벽의 역학을 이해 Bloksgaard, M.13에 설명 된 대로 지원에 직접 사용할 수 있습니다. 이 작품에서 수학적 모델은 엘라 스 틴의 본질적인 강성 특성에 적용 된 및 콜라겐 모집 긴장45,46 기준으로 추정 하 고 동맥 벽의 콜라겐 구성 요소 계산 스트레스 긴장 관계입니다. 영상 지원 결과 수학적 모델링에서 그 콜라겐 인간의 저항 동맥에 이미 낮은 완곡 한 긴장과 스트레스를 벽에 채용 되었다. 엘라 스 틴과 콜라겐이이 프로토콜에서 설명의 마이크로 아키텍처의 양적 측정 추가 될 수 있습니다 확장, 경 동맥6,,847, 에서 실시 한 광범위 한 작품에서 영감을 48 , 49 및 대동맥7,9,10,,5051: 추가 분석 평가 공간 배급과 콜라겐의 마이크로아키텍처 포함 될 수 있습니다 및 엘라 스 틴 섬유 섬유 방향 각도 (방향 경도 축 기준) 뿐 아니라 동맥 벽의 다른 층에서. 벨 외 알. 15 강성과 동맥 벽의 각 계층에서 스트레스를 계산 하기 위해 IEL 다층 분석 모델을 포함 하는 adventitial 콜라겐의 압력 유도 된 개편 해결. 이러한 저자15 인간의 피하 저항 동맥 건강 한 자원 봉사자, 그리고 관련된 구조와 3와 30 mmHg에서 벽 스트레스에서 각각 얻은 사용.

이 프로토콜에서 제안된 된 방법 잘하면 더 조사와 건강 및 질병에 있는 인간의 저항 동맥의 기계적 성질을 이해 하기 위한 microstructurally 동기 수학적 모델의 개발 동기. 또한 경도 축 따라 콜라겐과 엘라 스 틴 방향 각도 포함 하도록 메서드의 추가 수정, 부드러운 근육 세포 볼륨 밀도, 공간 분포와 동맥 벽, 콜라겐과 엘라 스 틴 분포 내에서 방향 및 tunica 매체, 및 엘라 스 틴 조직에 방향과 tunica adventitia에 배포, 이미징 데이터 고혈압, 당뇨병에에서 개장 과정의 이해를 촉진 하는 수학적 모델의 개발을 앞으로 먹 일 수 있다 고 대사 증후군입니다. 마찬가지로, 관상동맥 미세 혈관52,53, 첸 및 Kassab 제안으로 인간의 저항 동맥의 미세 기반 모델에서 매크로-(전체 동맥) 동맥 기계적 반응의 예측을 제공할 수 있습니다. 그리고 각 구성에 대 한 micro-(structure) 기계 수준입니다. 이러한 모델 구조 매개 변수의 양적 데이터 및 개별 레이어 및 건강 한 지원자 및 다른 질병으로 고통 받아 환자에서 발생 하는 동맥의 동맥 벽에 있는 성분의 기계적 성질에 따라 해야 합니다. 다른 약물 치료를 받고 있습니다. 데이터는 표준화 된 방식으로 수집 하 고 다른 위험 요소, 질병, 치료와 개인에 걸쳐 프로필을 비교. 메서드는 어떻게 질병 및 치료에 영향을 미치는 인간의 미세 이해 돕기 위해.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 실험실과 현미경의 사용에 대 한 덴마크어 분자 생체 이미징 센터에서 학부의 자연과학 대학 남부의 덴마크를 감사합니다. Myography 및 이미징 Kristoffer Rosenstand 및 Ulla Melchior에 압력을 가진 우수한 기술 지원을 인정 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Science Tools 15401-12
Fine Science Tools 11251-23
Nikon SMZ800N
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 761028 for dissection purpose
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark 1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
Ethicon Ethilon 11-0
Custom built DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. B3259
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. A7030
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. C5670
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. G7021
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. E3889
Merck Millipore, Hellerup, Denmark 1.00496.9010 Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution 
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. H3784
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P9666
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P5655
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. M2643
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S2002
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5886
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5761
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific 10010015
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. PHR1423
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. Z370525
 Tocris Bioscience, Bristol, UK 538944
Nikon Custom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
Nikon CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
Nikon CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, Denmark H7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). ChromaET 460 nm long pass dichroic
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Chroma ET402/15X 
Scotch TM
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19, (2), 187-194 (2010).
  2. Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14, (5), 1037-1043 (2010).
  3. van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47, (3), 183-202 (2010).
  4. Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7, (3), 205-212 (2012).
  5. Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59, (2), 367-374 (2012).
  6. Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292, (6), H2754-H2763 (2007).
  7. Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106, (12), 2684-2692 (2014).
  8. Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115, (11), 1683-1693 (2013).
  9. Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
  10. Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137, (5), 051001 (2015).
  11. Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16, (1), 213-225 (2017).
  12. Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9, (71), 1275-1286 (2012).
  13. Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. (2017).
  14. Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5, (2), (2016).
  15. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311, (6), H1560-H1568 (2016).
  16. Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168, (3), 686-703 (2013).
  17. Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291, (1), H193-H201 (2006).
  18. Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552, (Pt 1), 185-195 (2003).
  19. Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37, (1-2), 205-210 (2007).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291, (2), H804-H812 (2006).
  21. Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15, (2), 419-432 (2015).
  22. Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15, (1), 011108 (2010).
  23. Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13, (4), 044022 (2008).
  24. Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309, (4), H574-H582 (2015).
  25. Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31, (12), 2889-2896 (2011).
  26. Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27, (7), 379-397 (2017).
  27. Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  29. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. 2011 8th Ieee International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro, 230-233 (2011).
  30. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, (1 Pt 1), 493-508 (2002).
  31. Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33, (1 Pt 2), 569-574 (1999).
  32. Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60, (2), 97-109 (2012).
  33. Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients' Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52, (1), 1-11 (2015).
  34. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310, (20), 2191-2194 (2013).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  36. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58, (2), 167-176 (2004).
  37. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11, (3-4), 461-473 (2012).
  38. Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4, (2), 20130058 (2014).
  39. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311, (6), H1560-H1568 (2016).
  40. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9, (3), 273-276 (2012).
  41. Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6, (4), 247-260 (2007).
  42. Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98, (3), 428-436 (2013).
  43. Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103, (2), 121-122 (1981).
  44. Fung, Y. C. Biomechanics : mechanical properties of living tissues. 2nd, Springer-Verlag. (1993).
  45. Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9, (9), e1107998 (2014).
  46. VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285, (5), H1986-H2000 (2003).
  47. Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34, (31), 7575-7583 (2013).
  48. Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
  49. Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42, (3), 488-502 (2014).
  50. Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10, (80), 20120760 (2013).
  51. Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12, (105), 20150111 (2015).
  52. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49, (12), 2548-2559 (2016).
  53. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7, (1), 9339 (2017).
레이블 없는 형광 현미경 검사 법에 의해, 인간의 저항 동맥에 콜라겐과 엘라 스 틴 압력 종속 마이크로아키텍처가 평가
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).More

Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter