Summary
Den eksperimentelle prosedyren på immunophenotyping av murine orthotopic PDAC homografts tar sikte på profilering svulst immuno-microenvironment. Tumorer er orthotopically implantert via kirurgi. Svulster 200-600 mm3 størrelse var høstet og avstand for å forberede encellede suspensjoner, etterfulgt av flere immun markør FACS analyse ved hjelp av ulike fluorescently merket antistoffer.
Abstract
Homograft (syngeneic) tumorer er arbeidshesten dagens immuno-onkologi (i/u) prekliniske forskning. Svulst microenvironment (TME), spesielt immun-komponentene, er avgjørende for prognose og prediksjon av behandlingsresultater, spesielt de av immunterapi. TME immun-komponenter består av forskjellige undergrupper av svulst-infiltrere immunceller assessable av multi-farge FACS. Bukspyttkjertelen ductal adenocarcinoma (PDAC) er blant de farligste malignances mangler gode behandlingstilbud, dermed et presserende og udekkede medisinske behov. En viktig årsak til den ikke-responsen på ulike behandling (kjemoterapi-, målrettet, I/O) har vært dens rikelig TME, bestående av fibroblaster og leukocytter som beskytte tumorceller fra disse behandlingsformer. Orthotopically implantert PDAC antas å mer nøyaktig gjenerobre TME av menneskelig pancreatic kreft enn konvensjonelle subcutaneous (SC) modeller.
Homograft svulster (KPC) er transplantasjon av musen spontan PDAC stammer fra genmodifiserte KPC-mus (KrasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). Det primære svulst vev er skåret i små fragmenter (~ 2 mm3) og transplantert subcutaneously (SC) til syngeneic mottakerne (C57BL/6, 7-9 uker gamle). Homografts ble deretter kirurgisk orthotopically transplantert til bukspyttkjertelen nye C57BL/6 mus, sammen med SC-implantasjon, som nådde svulst mengder 300-1000 mm3 17 dager. Bare svulster på 400-600 mm3 ble høstet per godkjent obduksjon prosedyre og renset for å fjerne tilstøtende ikke-tumor vev. De var dissosiert per protokoll en vev dissociator i én celle suspensjoner, etterfulgt av flekker med angitte paneler med fluorescently-merket antistoffer for ulike markører av ulike immunceller (lymfoide, myelogen og NK, DCs). Farget prøvene ble analysert bruker multi-farge FACS til å bestemme antall immunceller av ulike linjene, samt deres relative andelen i svulster. Immun profiler orthotopic svulster ble sammenlignet med de av SC svulster. De foreløpige dataene har vist betydelig opphøyet infiltrere TILs/TAMs i svulster over bukspyttkjertelen og høyere B-celle infiltrasjon i orthotopic i stedet for SC svulster.
Introduction
Bukspyttkjertelen ductal adenocarcinoma (PDAC) fører til nesten en halv en million dødelighet verden årlig, en av de topp 5 kreft morderne. Det er noen effektive behandlingstilbud og ikke godkjente immunotherapies; Derfor trengte nye behandlinger desperat. Kreft blir stadig mer anerkjent som immunologiske sykdommer, inkludert PDAC, i tillegg til de genetiske sykdommene som kjent i dag. Immunologiske og genetiske faktorer vil trolig avgjøre sykdom prognose samt behandling resultater. Svulster unngå vert immun overvåking og til slutt fremme for å føre til døden. Mange av disse immun prosesser skjer innenfor svulst microenvironment (TME)1,2,3,4 der ulike immunceller samhandle med kreftceller, med hverandre og med andre svulst stromal komponenter, direkte eller indirekte via cytokiner som til slutt bestemmer sykdom utfallet. Derfor er karakteristikk av svulst immun komponentene TME eller svulst immunophenotyping, inkludert subtyping, numeration og lokalisering av ulike linjene av immunceller, avgjørende for å forstå anti-tumor immunitet. Ved PDAC, det har blitt foreslått at forhøyet svulst-infiltrere undertrykkende makrofager (TAM) og B-celler har ført til forebygging av T-celle infiltrasjon og/eller aktivisering og høye nivåer av fibrosis5,6.
Den felles tilnærmingen til undersøker immun TMEs eksperimentelt ville være å bruke surrogat svulst prekliniske dyremodeller, hovedsakelig relevante musen svulst modeller7, spesielt musen syngeneic (homograft) eller genmodifisert musen modeller (GEMM) av kreft, på antatt likheten av mus og menneskelige for svulster og immunitet8,9. Det er forstått i virkeligheten at det er iboende forskjellene mellom de to arter10,11.
Transplantert musen tumorer har betydelig operativ fordeler fremfor spontan svulster7, nemlig synkronisert tumor utvikling, i motsetning til foreldre GEMM spontan tumor utvikling. Homografts av spontane murine svulster anses primære tumorer har aldri vært manipulert i vitroog speiling opprinnelige mus svulst histo- / molekylær patologi7, samt mulig immun profiler. Disse murine homografts anses ofte for å være "en mus versjon av pasient-avledede xenografts (PDXs)". De derfor har trolig en bedre translatability enn konvensjonelle syngeneic celle linje-avledet musen svulster12. Særlig er mange homografts avledet fra bestemte GEMM der bestemte menneskelig sykdom mekanismer, f.eks kreftfremkallende driveren mutasjoner, er konstruert, og disse homografts må derfor fordeler til sin kliniske relevans. Spesielt utvikle KPC GEMM musen PDAC i 15-20 ukens av alderen, som viser morphologically menneskelig sykdom med hovedsakelig godt - til moderat-differensiert kjertel arkitektur og høyanriket stroma. Denne modellen viser også genetisk funksjoner av menneskelig PDAC, nemlig Kras aktivering mutasjon og P53 tap av funksjon, som oppstår i 90% og 75% av human PDAC, henholdsvis5,6.
Områder av transplantasjon har også blitt foreslått for å spille en rolle i modellen translatability. Bestemt vev omgivelsene, for eksempel et tilsvarende orthotopic miljø, kan være en nisje for bestemte svulstene fremgang, i motsetning til uniform subcutaneous (SC) miljøer for ofte transplantert svulster. Det ville være av spesiell interesse hvis, og/eller, hva forskjell eksisterer mellom to transplantasjon områder, immun-microenvironment og relevansen til menneskelig kreft, f.eks. ved PDAC.
En av de viktigste aspektene av immun profilering, eller immunophenotyping, er å bestemme svulst-infiltrere immunceller av ulike linjene, tallene, relative andelen i svulster, samt aktivisering stater og steder. Dette inkluderer svulst-infiltratrating lymphoctyes (TILs, både T- og B-), tumor-infiltrere makrofager (TAMs), tumor-infiltrere naturlige drepe celler (NKs) og svulst-resident dendrittiske celler3,13,14 , 15 , 16 , 17og den subcellular lokaliseringen av visse celler18,19,20, etc. Fluorescens aktivert celle sortering (FACS) eller flow cytometri er en enkeltcelle registreringsteknologien som vanligvis brukes til å måle de spesifikke parameterne i en celle. Multi-farge flyt cytometri måler flere indikatorer på en enkelt celle3,4,21 , og er den mest brukte metoden for å bestemme tallene og relative andelen av forskjellige undergrupper av immunceller, inkludert de i svulster.
Denne rapporten beskriver fremgangsmåter for profilering svulst-infiltrere immunceller: 1) implantering av orthotopic PDAC musen svulst homografts, sammen med SC implantasjon; 2) tumor vev harvest og enkelt celle forberedelse via svulst avstandtagen; 3) flyt cytometri analyse av alle cellene stammer fra svulster som grunnlinjen; 4) sammenligning av planlagte profiler av begge transplantasjon tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller og amendment(s) eller prosedyrer som omfatter omsorg og bruk av dyr er vurdert og godkjent av kronen Bioscience institusjon for dyr og bruke Committee (IACUC) før gjennomføring av studier. Den omsorg og bruk av dyr vil vanligvis utføres AAALAC (Association for vurdering og akkreditering av laboratoriet dyr omsorg) internasjonale retningslinjer som rapportert i Guide og bruk av forsøksdyr, National Research Rådet (2011). Alle dyr eksperimentelle prosedyrer vil være under sterile forhold på SPF (spesifikke patogen-fri) anlegg og gjennomført i strengt samsvar med Guide og bruk av forsøksdyr fra forskjellige offentlige institusjoner (f.eks De nasjonale instituttene for helse). Protokollen må godkjennes av komité for etikk av dyr eksperimenter i anlegget institusjonen (f.eks institusjonelle IACUC komiteen).
1. forberedelse til Tumor transplantasjon
-
Dyr bolig
- Få generisk C57BL/6 mus fra en kommersiell oppdrett leverandør.
- Huset mus (5) i individuelle ventilert bur på følgende: temperatur: 20-26 ° C; fuktighet 30 – 70%. belysning syklus: 12 h lys og 12 h mørke.
- Bruk korn cob sengetøy som byttes ukentlig.
- For kosthold, gi bestråling sterilisert tørr granule mat under hele studietiden.
- For vann, gir dyr gratis tilgang til sterilt drikkevann.
-
Donor svulst fragment forberedelse
- Begynne ved å overvåke kroppsvekt (BW), via veier med en balanse, og svulst volum (TV), ved caliper måling, svulst rentebærende donor mus.
- Når TV når 500-1200 mm3, euthanize dyr i en biohazard hette som protokollen.
- Sterilisere huden rundt svulsten bruker iodophor vattpinner.
- Kirurgisk fjerne svulsten (detaljene beskrevet i del 3: obduksjon og tumor harvest) og plassere svulst i en Petriskål inneholder 20 mL PBS (pre chill media eller 4 ° C før euthanizing dyrene-buffer).
- Hvis det skadelige blod, overføre svulst i en Petriskål og vask svulst med PBS.
- Halvert svulsten, fjerne alle ekstra hud, fartøy, forkalkninger og nekrose.
- Velg bare intakt stykker av svulsten og plassere dem i et sterilt 50 mL sentrifuge rør og legge 20 mL PBS så transportere røret til et eget dyr rom for farmakologi studier.
2. Orthotopic og underhud (SC) Engraftment
-
SC vaksinering
- Skjær svulster i 2 mm diameter stykker ved hjelp av en skalpell, sette 1 del i hver trocar, SC implantasjon eller senere orthotopic implantasjon (se nedenfor).
- Bedøve mottaker dyret med 5% isoflurane, som vedlikeholdes av en forpart på 1%. Dyret vil begynne å slappe av, mister sine rettende refleks og bli immobile. Inntil denne dybden av anestesi kan de lett bli vekket av smertefulle stimuli; tillate anestesi å utdype til slike Svar å smerte er fraværende.
- Når anesthetized, fikse mus på en eksperiment bord i den helt sideleie. Sterilisere musen bruker iodophor vattpinner, særlig området rundt tumorer.
- Med en skalpell, gjør en 0.5 til 1.0 cm huden snitt på venstre flanke, bare skallen til hip.
- Tunnel under huden mot forlemen, to-tre centimeter, med sløv tang.
- Tas aseptisk overføre en kube av svulst fra mediet og sted dypt inne subkutan tunnel.
- Visuelt bekrefte at svulsten er dypt i tunnelen (og ikke i huden snitt).
- Lukke såret med såret klipp.
- Overvåke dyr innlegget inoculation før de har gjenopprettet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbence. Returnere dyr tilbake til papegøyene kun etter deres full gjenoppretting bedøvelsen. Fullfør anestesi loggen, og starte dyr helse diagrammet. Veie mottaker dyr daglig i tre dager
- Vaksinere 5-10 mus per gruppe for overvåking av tumor vekst for en standard prosedyre.
-
Bukspyttkjertelen orthotopic implantasjon
- Anestesi og analgesi
- Bruke en 2 mL ketamin injeksjon og 0.42 mL xylazine injeksjon (20 mg/mL) i 5.91 sterilt injeksjon eller saltvann i en dose mengde 0,06-0,1 mL/20-25 g kroppsvekt.
Merk: Ifølge dyrevelferd analgesi er nødvendig før og legge operasjon. 0.05-0,1 mg buprenorfin /kg, SC. Den første dosen er pre og deretter dosert 3 ganger hver 4 timer post-operasjonen kontinuerlig.
- Bruke en 2 mL ketamin injeksjon og 0.42 mL xylazine injeksjon (20 mg/mL) i 5.91 sterilt injeksjon eller saltvann i en dose mengde 0,06-0,1 mL/20-25 g kroppsvekt.
- Kirurgisk operasjon for orthotopic implantasjon
- Bedøve mus via intramuskulær injeksjon (IM) per trinn 2.2.1.
- Når dyrene er fullt anesthetized, fikse mus på en eksperiment bord i den helt sideleie.
- Vær musene helt sideleie. Desinfiser huden rundt milten med jod så de-iodinate med 75% etylalkohol.
- Finne et medium punkt av milten og gjør en 1 cm loddrett snitt på magen å avsløre milten.
- Trekke ut en del av bukspyttkjertelen vev under milten forsiktig med flat-tip pinsett og Sutur en mus homograft svulst stykke fra frø musen på bukspyttkjertelen mottaker mus av 9-0 absorberbare kirurgisk Sutur.
- Lukk magen med en 6-0 silke Sutur av dobbel søm. Oppnå homeostase ved komprimering.
- Etter endt svulst implantasjon, hvis verken blødning eller tumor vev lekkasje, holde dyr i en varm bur.
- Overvåke dyret inntil det gjenvinner tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency; tilbake dyret dyr rommet etter full gjenoppretting av bedøvelsen. Overvåke svulsten bærer mus ved palpating magen nær milten og velg ut musene bærer orthotopic svulster.
- Anestesi og analgesi
-
Svulst-bærende mus helse overvåking
- Sjekk vann og mat inntak daglig.
- Undersøke musen utseendet for en ungroomed håret belegge, klumper, tynnhet, unormal pusten eller ascites.
- Palpate magen for å sjekke om det er spontan svulst på leveren og milten.
- Veie mus ukentlig med en balanse.
- Hvis noen av følgende kliniske tegn er iakttatt, mus er ofret for prøvetaking og obduksjon: BW tap > 20%. nedsatt mobilitet (ikke kunne spise eller drikke); kunne ikke flytte normalt betydelig ascites og forstørret magen; innsats i åndedrett.
3. obduksjon og Tumor Harvest
- Inspisere visuelt og ved palpasjon for tilstedeværelsen av håndgripelig svulster før avslutning.
- For avslutning, først euthanize mus som godkjente protokollen, og åpne magen og visuelt undersøke bukspyttkjertelen for svulster.
- Klipp av svulsten av stolpe dødelig kirurgi og legge den i kaldt PBS. Sett alle dyr i en ren, uncharged, gjennomskinnelig euthanasia kammer med spesielle lokk med en port for levering av karbondioksid brukes.
- Utslipp gass i kammeret på en flow rate som produserer rask bevisstløshet med minimal nød til dyret. Optimal infusjonshastigheten for CO2 bør være rundt 2-2,5 L/min.
- Visuelt observere hvert dyr under euthanasia prosedyren å sikre alle dyr får tilstrekkelig konsentrasjoner og ikke gjenvinne bevissthet under euthanize prosedyren.
- Opprettholde gasstrømmen for minst 1 min etter tilsynelatende klinisk død å minimere muligheten for at et dyr kan gjenopprette (hvis apneic men ikke død).
- Fjern ved siden av ikke-tumor vev. Renset svulst kan bli fotografert raskt.
Tumor vev inn RPMI-1640 og holde på is før dissosiasjon.
Merk: Dyr carcasses er bagged og lagret i riktig fryseren å avvente fjerning.
4. tumor vev dissosiasjon og enkelt celle forberedelse
-
Forberedelse av reagenser
Merk: Den svulst dissosiasjon Kit inneholder 2 ampuller av enzymet D (lyofiliserte pulveret), 1 hetteglass med enzym R (lyofiliserte pulveret), 1 hetteglass med enzym A (lyofiliserte pulveret) og 1 mL av Buffer A.- Klargjør enzym D ved å gjenoppbygge det lyofiliserte pulveret i hvert hetteglass med 3 mL RPMI-1640. Forberede dele et riktig volum for å unngå gjentatte fryse-Tin-sykluser.
- Klargjør enzym R ved å gjenoppbygge det lyofiliserte pulveret i ampullen med 2,7 mL RPMI 1640. Forberede dele et riktig volum for å unngå gjentatte fryse-Tin-sykluser.
- Klargjør enzym A ved å gjenoppbygge det lyofiliserte pulveret i ampullen med 1 mL av Buffer A følger med kit. Gjør ikke vortex. Forberede dele et riktig volum for å unngå gjentatte gratis-Tin-sykluser.
- Klargjør enzym blandingen av tilføyer 2.35 mL av RPMI-1640, 100 µL av enzymet D, 50 µL av enzymet R og 12,5 µL av enzymet i hver gentleMACS C-rør.
-
Svulst dissosiasjon
- For hver svulst forberede en C-tube med svulst fordøyelsen blanding, se kapittel 4.1 for fordøyelsen buffer fortynning og forberedelser.
- Bruk 3 mL fordøyelsen buffer for svulst fragmenter < 0,8 g, og sikre svulsten er fullt fordøyd.
- Etikett med studie koden, svulst, musen ID, behandlingsgruppe, og svulst vekt.
- Samle svulsten fra musa, vaske svulst i kalde PBS og rense vevet festet på svulst (for eksempel blodkar, fett, fascia, etc.).
- Sette svulst i fordøyelsen medier i en brønn av et sterilt 6 godt plate.
- Hold svulst med sterilt pinsett/tang og skive med en skalpell. Skjær svulsten godt nok for å bryte i mindre biter (~ 1 mm3).
- Plasser svulst brikker tilbake inn i C-røret og bruke gjenværende fordøyelsen buffer vaske platen og deretter overføre væske inn i C-røret som er plassert på is inntil fordøyelsen.
- Slå på dissociator med varmeovner.
- Plasser svulst avstandtagen C-rør opp ned i ermene for ledige stillinger og justere status for rør posisjoner fra gratis til merket. Velg et dissosiasjon program (37_c_m_TDK_1), etterfulgt av valg av nødvendige mappen der listen over programmer vises.
- Etter avslutning av programmet, ta C-rør av dissociator og spinn kort (300 x g, 4 ° C) til pellets prøven.
- Nytt suspendere prøver og sette inn en celle sil over en 50 mL tube. Vask cellene gjennom cellen silen med 10 mL vaskebuffer å gi en enkeltcelle suspensjon.
- Sentrifuge rørene på 300 x g i 5 min, forkaste nedbryting og å suspendere cellene med 5 mL av vaskebuffer, antall levedyktige cellers bruker trypan blå og/eller av cellen teller og justere celle concentraton til 1 x 106 celler per rør eller per eksempel. Inkluder riktig isotype kontroll antistoffer flekker er bestemt
5. immun Panel Design og flyt datainnsamling
-
Panelet design
- Se tabell 1.
-
Immunostaining
- FC-blokk eksempel celler: nytt suspendere cellene i 200 µL av flekker buffer med 1 µg/mL Fc-blokken, etterfulgt av inkubasjon på is eller 4 ° C kjøling i 15 min i mørket.
- Flekk celler med ønsket antistoff/fluorescens panelene (f.eks. T-Cell panel, macrophage panelet, etc.): Legg antistoff blandingen fortynnet i Fc blokkerer buffer hver prøve, flekk i minst 30 min på isen i mørket.
- Legge til 1 mL av is kaldt PBS hver rør og å suspendere cellene forsiktig, etterfulgt av sentrifugering på 300 x g for 5 min. Forkast resulterende nedbryting.
- Gjenta for å vaske cellene to ganger.
- Flekken for intracellulær markører hvis nødvendig, følgende trinn 6-10, ellers hoppe til trinn 10.
- Nytt suspendere celle pellet av puls vortex og legge 200 µL av fiksering/Permeabilization arbeider løsningen for hvert utvalg. Puls vortex igjen, og deretter ruge på 4 ° C over natten (foretrukket) eller 30 min ved romtemperatur i mørket.
- Nedspinning cellene og fjerne nedbryting.
- Vask to ganger ved å legge 1 mL 1 x Permeabilization Buffer (laget av 10 x Permeabilization Buffer, fortynnet med destillert H2O) etterfulgt av sentrifugering og dekantere vin av nedbryting.
- Legg intracellulær markør antistoff i 1 x Permeabilization Buffer og ruge ved romtemperatur for 30 min i mørket.
- Vask celler to ganger med 1 mL 1 x Permeabilization Buffer. Virvel og Dekanter nedbryting.
- Resuspend celler i 150 µL flekker bufferen og analysere på en cytometer. På grunn av fiksering og permeabilization prosedyren FSC (fremover-lys XY) / SSC (sidelys XY) distribusjon av celle befolkningen vil være forskjellig for live celler. Derfor må porten og spenninger endres.
-
FMO kontroller (fluorescens Minus én kontroll)
Merk: Multi-farge flyt analyse er spesielt viktig for analyse av tumor-infiltrere immunceller. Derfor er det behov for å finne en måte å identifisere og gate celler i sammenheng med data spredt på grunn av flere fluorochromes i et gitt panel. FMO (fluorescens Minus One) kontroll er en viktig tilnærming til dette formålet.- Dette Inkluder ekstra mus i hver gruppe for FMO kontroller (minst 2 per Rx) og prosessen for hvert vev. Etter dissosiasjon, basseng vev. For eksempel i en studie med 4 Rx grupper, bør 8 ekstra tumorer behandles individuelt og deretter samlet i ett utvalg for FMOs.
-
Flyt Instrument oppsett
- Gjøre kompensasjon perler mens maskinen varmes opp (minst 20 min).
- Bruk CS & T perler for å sjekke ytelse.
- Spenning og kompensasjon: bruke UltraComp perler, vortex komp perler grundig før bruk.
- Merke et separat 12 x 75 mm2 eksempel rør for hver fluorochrome-konjugerte antistoffer.
- Legg 100 µL av flekker buffer til hver tube. Legge til 1 full dråpe (ca. 60 µL) av perler hver rør.
- Legg antistoffer og utføre flekker prosedyren akkurat som eksempel prosessen nevnt i kapittel 4.
- Legg til 0,5 mL flekker buffer hver, å helt nytt suspendere perle pellets via vortex.
- Angi flyten cytometer avdrag spenning per vevet for gitt eksperimentet.
- Kjør gjennom flyt cytometer for datainnsamling, av gating singlet perle befolkningen per FSC og SSC målinger.
- Angi strømningshastighet rundt 200-300 hendelser/s.
- Angi riktig erstatning for en gitt fluorescein [FITC]-konjugert antistoff, bruk en FL1 vs FL2 dot tomten.
- Plasser en kvadrant-port slik at negative perler er i nedre venstre kvadrant og positiv perlene er i øvre eller nedre høyre kvadrant. Juster verdiene som kompensasjon til median fluorescens intensitet (MFI) hver befolkningen (som vist i vinduet kvadrant statistikk) er omtrent like (dvs. for FL2-% FL1 FL2 MFI av både perler bør være lignende).
- Gjenta trinn 5.4.11 og 5.4.12 for alle rør.
- Fortsette å anskaffe den faktiske farget prøver. Kjør veiviseren for kompensasjon og lagre innstillingene med formatet "dato eksperiment dine".
6. flyt Data analyse og presentasjon
- Analysere data av Flowjo og/eller Kaluza.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Orthotopic implantering av PDAC resulterte i rask tumorveksten lik som sett for SC implantasjon. Etter donor svulst fragmenter ble implantert i mottakerens mus, både subcutaneously og orthotopically i henhold til protokoller beskrevet i trinnene 2.1 og 2.2, implantert KPC homograft svulstene vist lignende rask vekst som vist i figur 1A . KPC homograft svulster høstes ved ulike tidspunkt vises i figur 1B og representant H & E bilder vises figur 1 c. Våre data vist lignende vekst av FM og orthotopic implantater.
Levedyktig svulst celler og celler i TME, inkludert svulst-infiltrere immunceller, som stammer fra enten orthotopic eller SC implantasjon, kan effektivt gjenopprettes. Svulster høstet og fordøyd for å forberede enkeltcelle suspensjoner påfølgende FACS analyse ved hjelp av en kommersiell dissociator (figur 2A) i henhold til protokollen som beskrevet i trinn 4. Vi innhentet vanligvis rimelig høy levedyktig celle avkastning fra svulst prøvene av begge typer implantasjon (~ 80% levedyktighet basert på Trypan blå); representant FACS plottet viser levedyktige cellers fra svulsten, atskilt fra døde celler/celle rusk (figur 2B).
Svulst-infiltrere immunceller av ulike undergrupper har blitt identifisert i både orthotopic og SC implantert svulster, mens deres profiler har forskjeller. Enkelt celle suspensjon forberedt fra tumor vev ved hjelp av metoden beskrevet i trinn 4.2 ble utsatt for FACS analyse etter farging med en 16 farge indikatorer vist i tabell 1, som dekker ulike linjene fra viktige immunceller som samt kreftceller. Gating strategi eller immun avstamning hierarkiet med representant flyt tomter er vist i figur 3A. CD45, en markør for alle eldre immunceller, ble brukt til skille kreftceller og svulst-infiltrere immunceller. Alle immun linjene ble senere analysert fra CD45+ bestander som vises i panelet (tabell 1).
Ved siden av markører, Cellestørrelse brukes også til å skille ulike subpopulasjoner (figur 3B venstre) for å kvantifisere celle undergrupper, inkludert T, B-lymfocytter, makrofager og MDSCs, etc. Svulst infiltrere immun profil sammenligning av SC vs orthotopic homografts av pancreatic kreft. De store opplistede celle populasjonene av flere viktige delsett av svulst infiltrere immunceller vises Figur 3 c. Dataene viser tydelig at svulsten har betydelig økt immun celle infiltrasjon sammenlignet med bukspyttkjertelen sunne mus. I tillegg fant ulike prosenter av delsett av svulst-infiltrere immunceller i orthotopic vs. SC-homografts, for eksempel betydelig mer B-celler i orthotopic enn i SC.
| Markør | Immun celle befolkningen |
| CD45 | Totalt leukocytter |
| CD3 | Totalt T-celler |
| CD4 | CD4 + T hjelper celler |
| CD8 | CD8 + cytotoxic T-celler |
| CD44 / CD62L * | Naive, minne og effektor T-celler |
| CD69/CD44/OX40/CD25 etc* | Aktivisering markører |
| CD4 + CD25 + FoxP3 + | Regulatoriske T-celler |
| CD11b + Ly6c/Ly6g | G-MDSC og M-MDSC |
| CD11b + F4/80 | Makrofager |
| IA/IE/CD206 | M1 og M2 makrofager |
| CD3-CD335 + | NK celler |
| CD3 + CD335 + | NKT celler |
| CD19 | B-celler |
| TNF-a/IFN-r/IL-7/IL-3 etc* | Cytokiner |
| PD-1/PD-L1/CTLA-4/TIM-3 etc* | Checkpoint hemmere |
| Granzym B etc* | Etterspurte markører |
| KI67/Brd U/PNCA etc | Spredning |
| Live/dead (fixable) | Live/dead |
| * Merk: Ytterligere markører kan legges til etter behov | |
Tabell 1: 16-fargers flyt paneler designet for analyse av tumor-infiltrere musen immunceller.
Figur 1: både orthotopic og SC (subQ) implantert PDAC homograft svulster i C57BL/6 mus vist lignende vekst med eller uten gemcitabine behandling. (A) vekstkurve: SC-venstre og høyre orthotopic. Blå: Kjøretøy; Gull: Gemcitabine (initiert på dag 10 innlegg inoculation når gjennomsnittlig SC svulst volum 200 mm3). (B) tumor vev på ulike tidspunkt. (C) representant H & E flekker av begge typer homografts (40 x 10). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Tumor vev dissosiasjon å forberede levedyktig enkeltcelle suspensjon. (A) bruk av frakobling; (B) det levedyktig celler, atskilt fra døde celler, som vist av flyt analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: multi-farge flyt analyse av tumor-infiltrere immunceller av både orthotopic og SC PDAC homografts. Rådata fra hver svulst prøve anskaffet fra flyt cytometri instrument, etterfulgt av analyse med Flowjo FACS analyseprogramvare. (A) standard gating strategien for analysen, vises som et eksempel; (B) representant flyt gating og analyser data med standard gating strategi; (C) representant svulst-infiltrere immun cellsare vises med B-celler, Treg og makrofager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om studier med SC svulster er mer gjennomført, kan orthotopically implantert svulster modeller potensielt være mer relevant for prekliniske farmakologi studier (spesielt I/O undersøkelser) å gi forbedret translatability. Denne rapporten tar sikte på å hjelpe interesserte lesere/publikum å visualisere direkte teknisk prosedyrer som kan brukes i deres respektive forskning. Våre protokoller viser at orthotopic implantering av PDAC kan føre til effektiv tumor vekst, ligner på SC implantasjon. Våre observasjoner også synes å foreslå tilstedeværelsen av ulike immun profiler av TMEs fra de forskjellige implantations. De store utfordringene for å tilpasse orthotopic, sammenlignet med SC implantations, er at komplekse ferdigheter kreves, prosessen er tidkrevende, kirurgiske prosedyrer for implantasjon er arbeidskrevende og vanskeligheter med overvåking orthotopic svulst veksten i livet.
Det er fire viktige skritt for å sikre at orthotopic bukspyttkjertelen svulst eksperimenter er gjennomført: 1) den kirurgiske prosedyren av implantasjon; 2) grundig og presis overvåking av tumor utvikling; 3) betydningen av utfører pre eksperiment tester først å bli kjent med fremgangsmåten og vurdere ta rente og tumor vekst; 4) bruker enkeltcelle suspensjoner av dissosiert svulster som en alternativ engraftment-metode. Denne rapporten prosedyren er nyttig for leserne til å utføre forskning ved hjelp av denne bestemte homograft, samt andre bukspyttkjertelen orthotopic modeller med andre orthotopic modeller med magen-åpning kirurgi.
Flow cytometri eller FACS er det viktigste verktøyet for å utføre immunoprofiling. Immunophenotyping av tumorer av FACS er betydelig forskjellig fra celler fra ulike organer, som perifert blod, milt, lymfeknute og benmarg på følgende måter. Vanligvis er det en veldig liten prosent av immunceller i svulster (små utvalgsstørrelser). Den ekstreme heterogeniteten av svulster og lite antall immunceller stede gjør utvinne levedyktig sjeldne immunceller teknisk utfordrende, krever spesialutviklede tumor vev dissosiasjon involverer maskiner. Både tidligere poeng gjør samtidige flere parameter måling ved hjelp av multi-farge flowcytometri viktig. Multi-farge flyt krever kompleks markør panel design, kompensasjon og gating strategier, på grunn av fluorescens spectral overlapping. Denne rapporten forsøkte også å demonstrere det interesserte lesere/publikum prosessen med svulst immun profilering via definerte tumor vev dissosiasjon og multi-farge flyt cytometri analyse.
Tre viktige trinn kan være spesielt viktig å gi produktiv TIL analyse: først en høy avkastning av levedyktige cellers utvinnes fra avstand svulster med tilpassede svulst dissosiasjon prosedyrer; andre, optimalisert design av store multi-farge flekker paneler basert på tilgjengelige reagenser; tredje, en optimalisert gating strategi i analysen. Forfatterne vil fremheve opplæring og erfaring med operatørene av både datainnsamling og analyse er avgjørende for vellykket flyt cytometri analyse av TIL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere er gjeldende heltidsansatte Crown Bioscience, Inc.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Dr. Jody Barbeau - for kritisk lesing og redigering av manuskriptet, og takke Ralph Manuel utforme kunstverk. Forfatterne vil også gjerne takke Crown Bioscience onkologi Immuno-onkologi biomarkør team og onkologi I Vivo team, for deres store teknisk innsats.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | \ | SAS3119 | \ |
| Trocar 20 | \ | \ | 2 mm |
| Petri dish | \ | \ | 20 mm |
| 100x antibiotic and antimycotic | \ | \ | \ |
| Iodophor swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Alcohol swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Liquid nitrogen | Air chemical | \ | \ |
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | \ |
| antibodies | BD | \ | \ |
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | \ |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2 mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo software | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | \ |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10 cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10 cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8 mL |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | \ | software |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50 mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15 mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4 °C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | -20 °C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | -80 °C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
References
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
- Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
- Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
- Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
- Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
- Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
- Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
- Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
- Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
- Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
- Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).
