Summary
本稿で説明されたプロトコルは、神経筋接合部で自然を記録するマウス挙オーリス長(ラル) 筋とシナプス後電位の神経誘発 (電流クランプ) と電流 (電圧クランプ) を使用します。この手法の使用は、正常と病気の条件の下でのシナプス伝達のメカニズムに重要な洞察を提供できます。
Abstract
このプロトコルは、電流クランプとクランプ電圧条件下で神経筋接合部からレコードのシナプス伝達に手法を説明します。オーリスの挙筋(ラル) の前のヴィヴォ準備は、薄い筋肉の運動神経終板に電極を串刺し神経筋接合部の簡単な可視化を提供するために使用されます。このメソッドは、運動終板の膜特性と同様に自発ミニチュア終板電位と電流 (mEPPs と mEPCs)、神経誘発神経終板電位と電流 (エップスおよび Epc) の録音できます。このメソッドから得られた結果を含める素量 (QC)、小胞リリース サイト (n) の数、小胞の放出 (prel)、シナプス促通、うつ病と筋膜時定数 (τ の確率m) 入力抵抗とします。このテクニックの人間の病気のマウス ・ モデルへの適用は、病気の状態でキーの病態を強調表示し、新規治療戦略の特定できます。完全に電圧遮断単一シナプス、によってこのメソッドは、シナプス伝達の現在利用可能な最も詳細な分析の 1 つを提供します。
Introduction
シナプス機能を検査するためのエクセレント モデルの動的神経や骨格筋のシステム関係に洞察力を提供するいますと、神経筋接合部のシナプス伝達を勉強します。オーリスの挙筋(ラル) は薄い筋肉、神経筋接合簡単に可視化することを可能にします。以前のレポートは、シナプスの薬物や毒素を調べるとラル1,2の骨格筋線維型の特性を特徴とした、ラルを使用しての利便性を説明しています。数多くの研究は、神経筋生理学3,4,5,6,7、8を調べる、ラルを使用しています。電気生理学、簡単にラルの神経筋接合部を観察する能力を運動終板に電極を正確に配置可能し、シナプス伝達を記録容量クランプの問題が大幅に減少します。電流クランプ記録膜時定数 (τm) 入力抵抗 (Rで) などの筋膜特性が容易に得られます。さらに、これらのプロパティは、同じの筋線維が筋膜特性にシナプス機能の直接比較を可能にする、神経筋伝達を記録するために使用から測定できます。これらのデータ分析は、多くの神経筋疾患と変更されたアクティビティの状態の物理的なメカニズムに重要な洞察を提供できます。
ここで説明する手法の重要な側面は、クランプ電圧の非線形電流クランプで検出された対象ではない、筋膜特性の独立してシナプスの録音用です。神経筋伝達を調べる現在のクランプではなく電圧クランプを使用する利点は、1950 年代の9での努力を開拓によって設立されました。電流クランプの下で 10-15 mV の振幅を超えるエップスは mEPP 振幅9の線形製品ではありません。たとえば、平均 mEPP は 1 mV、5 の EPP mV 5 mEPPs (5 の QC); の製品といえます一方、40 の EPP mV 以上 40 mEPPs の製品になります。この非直線性大きいエップスでは、膜電位と平衡電位のアセチルコリン受容体の違いは、EPP の原動力 (~-10 mV)、大きいエップスの間に大幅に減少します。電圧クランプ実験中に筋膜電位が変化しないために、この問題は電圧クランプ実験で避けます。欠点は、電圧クランプ実験電流クランプ記録よりも完了までに技術的により困難なことです。これを念頭において、マクラクランとマーティンは、エップス10電流クランプ記録の非線形性の簡単な数学的な補正を開発しました。修正は11,12,13をうまくが、重要なは、筋膜特性が乱れていないと仮定します。
筋膜特性、特に条件または筋肉を混乱させる病気の状態を勉強して場合を考慮する重要です。たとえば、ハンチントン病の R6/2 トランスジェニック モデルからの骨格筋は、安静時塩化カリウム電流14,15で進歩的な減少による脱です。結果として、mEPPs、エップスは R6/2 骨格筋で増幅されます。確かに、付加的な要因は、mEPPs とエップスを変更できます。変更は SNARE タンパク質8に関連しているように見えたエップス、ハンチントン病マウス (R6/1) の別のモデルで動作します。変更された神経筋伝達を引き起こすメカニズムを評価するためには、電圧クランプを使用して変更された筋膜特性の影響を除去するために有益となります。最近の研究では、ここで説明する手法を使用して両方の電流と電圧クランプ条件下で R6/2 神経筋伝達を調べた。モーターの常数全体だった電圧クランプと少ない 1% 誤差より終板16の長さの定数内で 2 つの電極を配置することによってそれはその電圧クランプと R6/2 筋の神経筋伝達の対照的な測定値が得られた電流クランプ レコードを修正.これは筋膜プロパティが変更された場合、非線形性のエップスを修正することができないことを強調表示し、筋膜特性の独立した電圧クランプ記録を得ることの利点を示しています。ここに提示されたプロトコルは、条件またはシナプスとシナプス後膜の特性に影響を与える病気の状態を調べることに最適です。
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Protocol
動物のケアおよび使用委員会のライト州立大学に従ってすべての動物の手続きを行った。
1. マウス安楽死
- 発煙のフード麻酔チャンバー気密ガラスにマウスを置きます。
- イソフルラン (飽和状態、または ~ 25%) の致死量吸入を介してマウスを公開します。呼吸することができますも見られなくなるまで、商工会議所にマウスを移動します。
- 商工会議所から、マウスを削除し、安楽死の副次的な方法として頚部転位を実行します。
2. 背中、首、頭の背側表面から髪の毛の除去
- 電気シェーバーを使用すると、マウスの前後、首、頭の背側表面の毛の大半を削除できます。また、周りと左耳上の髪を削除します。
注: 世話を耳の周りの皮膚を剃るとき、肌シェーバーの刃に巻き込まれることができます、基になる筋肉組織を損傷する恐れが。 - 残りの髪を削除する剃毛エリアに綿棒で脱毛クリームを適用されます。約 1 分待ってとスクイズ洗浄ボトルを使用して水で脱毛クリームを洗い流し、残っているクリームや綿棒を使用して髪を拭うし、乾燥肌をなでます。
3. 皮膚挙筋オーリス長筋を公開するには
- ステレオ解剖顕微鏡の下で肩甲骨のレベルでマウスの背面に小さな切開 (ちょうど深く十分に皮膚に浸透する) を作る。図 1 a・ Bに示すようにパスを次の顕微解剖はさみを使って皮膚をカットします。
- 微細鉗子 (第 5) などを使って、肩甲骨近くカットに沿って肌を引き出します。春のはさみを使ってカット耳に近づいている間、基になる筋肉組織から皮膚を分離する結合組織です。重要なは、露出した筋肉組織の偶発的な切断を避けるために肌に指摘したブレードで結合組織を切る。
- 定期的に露出した筋肉 (mM) では、次の Na+の外部バッファーなどの生理食塩液を灌流: 4 144 NaCl、KCl、1.2 CaCl2、0.6 MgCl2、5 グルコース、1 の NaH2PO4、pH 7.4、NaOH で 300 ± 5 ミリ モル/kg の浸透圧で、。結合組織は、左の耳にまでカットされています、一度マウスから皮膚を完全に削除し、それを破棄する耳の周りの皮膚をカットします。
注: ラル耳の底に付着し、皮膚を除去しながら簡単に損傷することができます。ラルの切断を避けるために耳の周りの皮膚の周り 1 mm を残してお勧めします。
4.オーリス挙筋と周囲組織の除去
- 春はさみを使用して、脊柱、肩甲骨の間に接続するラル、劣っている切削の筋肉で開始します。正中線の右側に、右の肩甲骨から開始し、正中線の右側に残っている間、マウスの吻側端に向かってカットします。継続頭蓋の筋肉組織の最後にすべての方法を介して切断します。
注:図 2に示すように、ラルは耳と、正中線の内側に接続最も表面的な筋肉です。他のイメージは、ヨーロッパ グリーン17本は、ラールの優秀な手描きの画像を示しています。 - 鉗子を使用して、正中線の右側にすぐに切断組織をつかむし、注意深く持ち上げ、左耳に向かって組織を左ラルに劣っている筋肉のいくつかの層を除去する頭蓋に対して押されたはさみの刃に切削を開始します。すべてのレイヤーの削除中に、ラルを誤って切断を避けるために一時的に接続されているままにします。
- 平行刃でカットし、押しつけ頭蓋 innervates ラル、外耳道の周りをラップ、耳の内側の筋肉に入る神経の切断を避けるために。限り、できるだけ添付神経の維持、外耳道を通って切断を続行します。
注: ラルを供給する神経顔面神経の枝し、後の手順で使用されます保存する必要があります。 - 単に過去の耳の腹の部分図 1 bに示すように同じパスに沿って耳の三半規管は脂肪組織をカットします。また、マウスから筋肉を完全に削除する右側に行っていたように、左の肩甲骨に沿ってカットします。
5.挙オーリス筋筋の分離
- ラルと周囲の組織をコンテナーに配置します。シリコーンのエラストマー底部とシャーレのような底に固定できます切り裂かれたティッシュのコンテナーを使用します。入浴、生理食塩液で組織をよく洗います。
- 耳の基本に沿って耳の耳介を切断、耳の軟骨の部分を残して、ラルに接続されています。劣る側が (ラルは、上皿の底) を向いているので、筋肉を反転します。
- 代わりに、準備を保持する外耳道を介しての昆虫ピンなどのピンを配置します。小さいピン、ピン、ラルの正中線の反対側に残りのティッシュを使用しています。筋肉を伸ばし、皮膚を通して小さなピンを配置し耳の外側の部分に皮膚を軽く引いて鉗子を使用して。図 3に示すように、組織が皿に万全になるまで、この手順を繰り返します。
注意: ピンの小型解剖は鍼の先端を希望の長さに切断することによって可能です。これらの小さなピン、組織への損傷を最小限に抑える、長作動距離の対物レンズを水浸漬で使用することができます。 - (優れた耳介、外転のオーリス筋,およびinterscutularis)、ラルをカバーしている筋肉 (図 4に示されている) を削除を開始、してそれらは結合組織によって、ラルと結び付けられて、近く特に厳しい、正中線、第 5 鉗子と春のはさみを使用しています。
- プルアップする鉗子を使用して覆う筋層に引っ張られて筋層向けブレードで結合組織を切るし、切断したり、ラルの刻み目をつける人を避けるために世話をします。正中線に向かってカットし、正中線への道の約 4 分の 3 を切断を停止します。その後、各筋層を削除する正中線に平行カットします。ラルだけ残るまでの筋層を削除する保持します。
- ラル、電極の串刺しの刑に補助の対象となる残りの結合組織の一部を削除します。優しく、ラルから膠原病を引くと春のはさみを使って切って号 5 鉗子を使用します。組織プロセスのラルの損傷のリスクなしそう簡単に行うことができますを削除します。神経筋接合部の可視化を妨害するラルの下面に残った下の筋層を支配する任意の太い神経を削除します。
6. 神経の分離
- 神経刺激装置を使ってラルを innervates 神経を識別する (たとえば、2 つの白金線に接続されているパルス発生器);筋肉に外耳道からを実行するいくつかの神経があります。いくつかの電流を供給する神経刺激を神経に触れる (現在は約 5 V に異なります)。筋肉の契約、正しい神経が確認されています。
- 慎重に神経に近い組織をつかむし、耳を周囲組織から神経を分離する春はさみを使用します。被害を最小限に抑える、神経のほとんどを保つ記録の皿に神経を保護する後で使用されるいくつかの周囲の組織に埋め込みます。
注: 開く外耳道の内側に、ラルを innervates 運動神経があります。 - 双極刺激電極を使用している場合は、神経、筋肉から遠位の地域のまわりでだけ周囲の組織を削除します。吸引電極を使用している場合は、神経の断端周囲の組織を削除します。
注: これは良い停止点です。これは良い停止点です。場合休憩は必要な解剖のラール準備維持できますの生理学的なソリューションまたは有害な代謝物が蓄積しないように時間のカップルのための一定の血流に。有害な代謝物が蓄積しないようにソリューションまたは定数の灌流の大ボリュームを使用します。 - 次に、固定を解除し、筋肉を直立化合物顕微鏡下での電気生理学実験用灌流チェンバに転送します。
注: 使用ソフト下部組織がしっかりとすることができますと灌流チャンバー固定 (図 5 a)。 - ピン端 (耳と正中線) と筋肉の端に沿って筋。神経筋線維に垂直を置き、神経の端に残されていたいくつかの余分な組織を皿の底にピン留めします。常に生理食塩液を浴びて組織を維持します。
注: 丸く、ラルの筋線維の直下に昇格した素材に便利ですも。このサポートは、電極串刺しの刑でエイズし、横倒しになって 50 mL の円錐管にキャスト シリコーン ・ エラストマーの小さなセクションから行うことができます。エラストマーの丸みを帯びたセクションは、少量の新鮮なシリコーンを用いた灌流チャンバーの底に保護できます。灌流チェンバの図は図 5 b・ Cで。筋線維は、新しくキャスト シリコーン ・ エラストマー (これは非常に疎水性) に非常にしっかりと付着することし、破損可能性があります。コートに便利だかブロックが新しく、イムノブロットでブロックの手順と同様に、タンパク質とシリコーンをキャストします。それをブロックするには、我々 が新しくキャスト シリコーン、ウシ血清アルブミンの溶液で夜通し孵化します。
7. 電気生理学機器のセットアップ
- 準備または神経筋接合部、ミトコンドリア染料 4-(4-diethylaminostyryl) 1 methylpyridinium18、光に敏感であり光から貯えられるべきであるなどの可視化を支援するための染料の因数を解凍します。また、電極のソリューションを解凍します。渦することすべての溶質は、ソリューションにすべて因数。1 μ M を含む生理食塩液を準備 μ-コノトキシン GIIIB (μ-CTX) および 80 μ M BTS (省略可能)。
- 顕微鏡ステージにラルと灌流チャンバーを固定します。3 M の KCl、寒天橋を通って記録室に接続されているで満たされたカップに参照電極を配置します。参照電極を製造元の指示に従って増幅器に接続します。
- この時点で、神経の神経刺激電極を配置します。彼らは刺激のためによく働く、吸引電極または小さなバイポーラ電極を使用します。
- 録音に刺激のアーチファクトの数を最小限に抑えるため可能な限り筋肉から刺激電極を配置します。
注: 刺激電極を制御する必要があります必要に応じて電圧振幅を制御することができます刺激分離ユニット。
- 録音に刺激のアーチファクトの数を最小限に抑えるため可能な限り筋肉から刺激電極を配置します。
- ゆっくりと収縮が観察されるまで、刺激・ アイソレーション ・ ユニットに電圧ノブを回して電圧を上げます。収縮が最初に観察されたポイントは、しきい値です。しきい値を特定したら、1.5 で刺激・ アイソレーション ・ ユニットの電圧に設定 * しきい値 (または実験によって定義されている)。
注:図 6は、正立型顕微鏡とボール ジョイントのマニピュレーターを使用して神経に配置されている小さなバイポーラ電極下筋準備を示しています。それは刺激しながら十分にしきい値を超える可能性の低い電圧に有利です。低刺激電圧記録中に刺激のアーチファクトの数が減ります。また、刺激物のサイズを小さく筋肉から刺激電極を配置すること。時々 神経末が神経に沿っての刺激を配置すべき場所を実験する必要がありますので、解剖から破損します。 - 入浴生理食塩水ソリューションを削除し、5 μ M 4-ディ-2-Asp に置き換えます。神経筋接合部の可視化 (図 7) 適切な蛍光を達成するために 10 分の 4 ・ ディ ・ 2 Asp にラルの準備を公開します。
- 2 つの電極ソリューション、3 M の KCl と 75 のアスパラギン酸, 5 MgCl2、15 Ca(OH)2、5 ATP ナトリウム, 5 クレアチンリン酸二ナトリウム (mM) で成る K+の内部ソリューション, 5 グルタチオン、pH 7.2 コ 30 グリコールエーテルジアミン四酢酸、20 モップを準備します。
注: ソリューション事前に準備する必要があります。K+の内部ソリューションは因数-20 ° C で保存ことができます。 - 塗りつぶし引っ張られたガラス管 3 M KCl と電圧検出電極の電流通過電極; K+の内部ソリューション (の準備ステップ 7.6) を使用します。ガラス管に簡単に合わせて 1 mL の注射器に接続されている狭い非金属針 (~ 34 ゲージ) を使用します。空気の泡を削除する毛細血管を軽く各電極、いっぱいが 10-15 MΩ の抵抗を持っていることを確認します。
注: を確認し、データ集録ソフトウェアを使用して両方の電極の抵抗値に注意してください。 - 10 分後に、4-ディ-Asp ソリューションで、通常の Ca2 +ソリューションを交換します。
8 蛍光を用いた神経筋接合部の同定
- 正立型顕微鏡を使用すると、標準の明視野と蛍光照明、図 7Aのように準備に沿って筋線維に垂直蛍光緑の神経筋接合部の明るいバンドを探します。神経筋接合部を識別するために使用する低倍率水浸対物レンズ (~ 10 X)
注: 顕微鏡は、FITC キューブを搭載するべき (Ex: 480/40、ダイクロイック: 505LP、Em: 535/50) と LED、レーザー、ハロゲン ランプ、または蛍光水銀ランプ。写真漂白、明視野と蛍光照明を交互に抑える。
注: このバンドは通常より近位部正中線よりも耳のベースに。バンドは、神経筋接合部が最も集中している地域です。 - 高倍率水中浸漬目的 (~ 40 X) に切り替え、電気生理学 (図 7 b) と調査する上層部に筋の神経筋接合部を識別します。
- 製造元の指示に従って、適切な headstages のピペット ホルダーにいっぱいピペットを固定します。マニピュレーターを使用して、特定の神経筋接合部 (図 7) の 100 μ m 内筋膜上の電極を配置します。主に明るいフィールド顕微鏡を用いた電極を位置します。蛍光を使用して、神経筋接合部を基準電極の位置を確認します。
- まず、低倍率 (~ 10 X) 目的を使用して電極を見つけ、電極の最終位置決め用高倍率 (~ 40 X) 目的に切り替えて。この時点で筋肉に電極を突き刺す、まず電極を調整しないでください。
9. チューニングと電極を刺し
- 目的の繊維上に電極が配置されます、ゼロしブリッジ バランス (または類似のアプローチ) による電圧検出電極を調整、製造元の指示に従って電極静電容量を中和します。また、ゼロ電流通過電極。
- 繊維の表面に両方の電極をもたらします。ゆっくりと位置調整繊維に向かう途中電極の電極の神経筋接合部に関して方向づけられたまま、8.3、8.4 の手順で説明するよう。
- 両方の電極は、筋肉繊維の表面を連絡して後、は、最初鈍い電流通過電極を突き刺します。串刺し電極を容易にするのに (余分な容量補償の短いパルス) の話題、簡単な電流パルスまたはテーブルをやさしくタッピングなどのテクニックを使用します。
- 負の膜電位が特定されるまで、データ集録ソフトウェアでオシロ スコープまたはオシロ スコープのプロトコルを使用して、電極を刺しされていることを示す信号を監視します。
- Impaled の電流通過電極のレベルに筋肉にシャープな電圧検出電極を押し下げます。両方の電極を互いに合わせて、一度電圧感応電極の電流通過電極に適用される同じ技術を使用して自由に動けなきます。
- アンプ、コント ローラーを使って成功した串刺しの刑にマーシャ リング電極による膜損傷を補うために現在通過電極を現在保持している一定の負を適用します。-80 に向かってゆっくりと充電を開始するセル mV、潜在的な希望の休憩にセルをもたらすに必要な保持として電流の増加 (すなわち-85 に-80 mV)。
注: 保持を必要とする繊維からの録音を避けるため現在の不健康な繊維からの録音の可能性を最小限に野生型筋-25 nA より絶対値で大きい。 - 繊維は潜在的な目的休憩分のカップルのため安定している筋膜特性または神経筋伝達を記録に進みます。
10. シナプス後膜特性とシナプス伝達を記録
- 運動終板 Rでτmの決定に使用する対応する膜電圧応答を測定する正と負の現在の手順の等しい数を適用することによって電流クランプの録音を開始します。受動的な特性を確保するため、定常状態に到達、線形電圧電流関係16,19,20を持っている小さな電圧応答を使用します。破損または異常な神経線維からの録音を避けるため、このような繊維の mEPP 頻度 > 3 Hz。
- 次に、製造元の指示に従って 2 電極電圧クランプを入力します。-85 の膜電位の電圧クランプ繊維 mV。クランプ電圧設定は、mEPCs の検出を許可する信号対雑音比を達成すべき。
注: 十分な電圧制御の維持問題になることができます。我々 はこれらの問題を最小限に抑える 2 つの方法を使用します。最初に、繊維が刺し運動終板の 100 μ m 内で前述21これらの繊維の長さの定数内にあります。第二に、我々 はアンプの DC の復元機能を使用します。この機能は、非常に高いクランプ電圧ゲインを設定します。我々 の以前の仕事詳細でこのメソッドと終板の電圧クランプ16を評価するための方法を説明しました。 - 一度、電圧クランプでシナプス電流 (mEPCs と eEPCs) を記録、実験の要件に基づく神経刺激、さまざまなプロトコルを使用して。
- レコードの自発的な mEPCs および Epc シナプス変調 (円滑化または変調) 素量を評価するために Epc のレコードに 1 つを可能にする低周波神経刺激プロトコル (≤0.5 Hz) を使用します。シナプス促通やうつ病を評価するには、高周波神経刺激プロトコル (50 Hz で 10 パルス) を使用します。
- データ集録ソフトウェアの使用は、制御パルス発生器を使用してトリガーすることができます刺激分離ユニットを介して目的の周波数で神経を刺激します。
- 電圧クランプの録音が終わったら、アンプに電流クランプ設定に戻す、すべての流れをオフに、光ファイバーから電極を取り外します。電極は目詰まりしないチェックまたは記録中に基準電圧のドリフト。
注: ドリフトに関する電極電圧必要があります細胞外の溶液に 0 ボルト繊維マーシャ リングする前に設定されました。たとえば、記録された電圧電圧漂流実験中の場合はあるでしょう。
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Representative Results
図 8は、12 週齢野生型 R6/2 マウスから電流パルス (図 8 a) と電流クランプの下の 1 つのラール繊維から電圧応答 (図 8 b) の例を示します。MEPPs の存在は、これらのレコードに運動終板から撮影されたことを示します。レコードは、通常の生理食塩液で得られました。これらの電流クランプのレコードは、その繊維16,19,20Rでτmを決定する分析できます。
EPC とクランプ電圧条件下で得られた 2 つの mEPCs の代表的な録音は、図 9 aに表示されます。EPC の前簡単な現在のたわみは、神経刺激によるアーティファクトです。MEPCs および Epc の解析を行うことができますイベント検出ソフトウェアで迅速。このツールには、記録内のイベントを自動的に検出することができますテンプレートを作成する研究者ことができます。イベントを重ねられ、データ解析ソフトウェアにエクスポートすることができます。図 9 bは、スーパーイン ポーズの Epc と代表的な繊維から mEPCs (インセット) を示しています。
図 1: の一般的な場所、オーリスの挙筋筋肉
ラルの筋肉は頭の背側表面にあります。赤の点線は、背側 (A) および (B) 側面を除去するため皮膚を切断するためのパスを強調表示します。耳の底に付着、ラル、耳の周りの皮膚の約 1 mm は、ラールの切断を避けるためにそのまま従って。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 公開オーリスの挙筋筋肉
ラル (黄色と緑) は皮膚のすぐ下にあるし、強調表示された領域で最も表面的な筋肉です。筋肉は、頭蓋 (イエロー) の 2 つの部分がありますと尾 (緑) 地域。頭蓋領域は、最初の 4 つの頚椎で正中線から出現し、耳介の基部の前方の部分に向かって実行される.正中線は、参照、鼻に向かって肩甲骨 (白い矢印) から実行される結合組織のバンドです。右と左ラル筋は頭蓋に正中線で接続します。ラルの頭蓋の部分は尾の部分よりもはるかに広いです。尾の部分は第 4、第 5 頸椎椎体の正中線付近にアタッチし、耳介の基部の後部に接続します。解剖中の図の括弧で囲まれた点線でマークされているラルを切断を防ぐために軟骨の耳の周りの皮膚の数ミリを維持します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 粗郭清、オーリスの挙筋周囲の筋肉
動物から削除されると、組織はセクション 5.3 で説明した細かいピンを使用してシリコーン並ぶエラストマー皿に (下にラル)、下ピン留め、背側です。皿の底に固定されて、穿刺部位の筋層を削除できます。外耳道を介して昆虫ピンは、白の破線矢印で示されます。黄色の矢印は、不要な筋肉の除去のための理想的なピン配置を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 筋層に直接劣る、オーリスの挙筋
強調青はオーリスの外転筋(AAL)、耳介 scupularis (AS) は、赤と黄色は、 interscutularis (IS)。ラルがメイン、この画像で筋肉の基になります。リファレンスについては、耳と周囲の皮膚は黒の実線で囲まれます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: シリコーンのエラストマー裏地、カスタムの灌流チャンバー
表示カスタム 35 mm 灌流皿、電気生理学的記録(A)ラルを確保するために使用されます。シリコーン ・ エラストマーは、組織に追悼の適切なサーフェスを作成する使用されています。商工会議所の中央には繊維を射すくめるとき便利です丸みを帯びたプラットフォームです。プラットフォームには、ときに、マーシャ リング中に電極と下向きの力を適用するプロセスの下から筋線維がサポートしています。このプラットフォームは、50 mL のコニカル チューブのカーブにフォームにシリコーン ・ エラストマーを許可によって形作られました。このスライスはシリコーンのエラストマーが丸みを帯びた、詳細シリコーン ・ エラストマーとチャンバーの底に接着します。BとCで灌流チェンバより明確に見ることができる側のビューと同様に、料理の説明表現が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 電気生理学実験のセットアップ
小さなバイポーラ電極は、ラルの神経を刺激するために磁気ボール ジョイント マニピュレーターの場所で開催されます。顕微鏡ステージは、(冷蔵庫の磁石を作るため工芸品やハードウェアの店で見つけることができます) と接着剤の磁気材料の使用と磁気プラットフォームを簡単に保持させることができます。また、headstages と電極ラル サンプル上に配置。重要な楽器は、ようと水浸漬、セラミック傾斜コーンとベベルの目的。角度付き端部により電極配置しやすく、セラミック材料は、電気的なノイズを最小限に抑えます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 神経筋接合部識別
すべての画像は、5 μ M 4-ディ-2-Asp (緑) 神経筋接合部の可視化を可能にする染色ラルを表示します。神経筋接合部の A (A) 明るいバンドが見られる (黄色の矢印) をすることができます 10 × 対物を通して筋を表示するとき。白の破線矢印で示されるように、軸索分岐を見てもできます。(B) 小さな共焦点スタック (5 x 1 μ m) の 3 つの神経筋接合部 (黄色の矢印)。健全な筋線維筋鞘繊維 (白い矢印) に沿って黒い斑点として表示される複数の筋核と同様に明確な縞があります。しばしば神経筋接合部の神経軸索をも観察できます。(C) A 繊維ガラス電極で串刺しはステンド グラスの神経筋接合部。電極はホワイトのハイライトをより簡単に見ることができるように拡張されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 記録膜特性の電流クランプ
注入電流パルス (A)、(B) 潜在的な応答記録、ラルの 1 つの繊維から得られた膜は、生理食塩液でびっしょり。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: 2 電極電圧クランプ録音
EPC と 2 つの mEPCs の生のトレースは、2 電極電圧クランプ (A) に記録されます。スーパーイン ポーズの Epc と単繊維 (B) から mEPCs (インセット)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
準備および神経筋伝達電流または電圧クランプ条件下での測定のためマウス ラル筋肉の使用は、ここで説明。ラルを解剖するために考慮すべきいくつかの重要なポイントがあります。電極と電極串刺しの刑で筋肉エイズから過剰な結合組織のクリーニングは結合組織串刺しの刑にそれらを配置する場合ことができます暗礁。しかし、離れて撮影することができます結合組織を削除簡単に筋肉の損傷の可能性を制限します。神経の分離を実行して、それは非常にデリケートなので注意してください。神経の損傷を避けるためには、皿に神経を確保するため、ピンを配置できる神経の端に接続されている周囲の組織の一部を残すことをお勧めします。また、神経刺激装置を配置するときに、神経を粉砕しないように注意してください。最後に、電極が光ファイバーに刺し、順序は重要です。鈍電極は、自由に動けなく容易ではないと、まず刺しする必要があります。鋭い電極が最初に留められていた場合、鈍の電極は、ファイバーから出てくる鋭い電極をおそれ、膜を貫くそれ前に筋線維を押し下げる可能性が。これは繊維に不要な膜の損傷を原因となる鋭い電極と 2 回目を突き刺す必要なります。また、こと使用されているアンプを同時に計測電流と電圧電流通過電極の電極を刺しされていることを示す膜電位の負の偏向を観察できるので、便利です。
ラルは有益なことができるの 1 つの機能は、両方の筋肉を同時に削除する機能です。これは、同じ動物の電気生理学と分子生物学の実験を実行するために素晴らしいことができます。これは、軽微な変更をここで説明と本質的に同じプロトコルに従うことによって実現できます。1-3 左と同様に右サイドに記載されているすべての見出しの下のすべての手順に従ってください。ステップ 4 では、筋肉を削除する右耳の腹側の切削を開始することをお勧めします。前述したように、常に、ラルに接続されている下の筋を残し可能な限り深くカットする頭蓋骨に対して押されたブレードを保ちます。過去の正中線に, 可能な限り深く刃を保つ右耳に向かってカットし続けます。この時点で、手順の残りの部分がこのプロトコルで記述されて、だけ両方の筋肉の残りの手順を実行します。掃除されている、筋肉と分子解析後の冷凍 1 ラールを切ることができる、電気生理学の他使用することができます。それは、同じ動物の両方の筋肉の電気生理学の研究を行うことは困難でしょう。筋肉を分離するには、正中線を切断しなければならない、いくつかの筋線維が可能性があります損傷します。
ラルは、長い薄い本来モーター常数と優れた体外灌流1,3,4,5 を容易に識別できるので、神経筋伝達を確認する使用されています ,6,7,8。4-ディ-2-asp の使用、に加えて他のグループは低濃度22ローダミン共役ブンガロトキシン部位を使用しています。生理学的検査、シグナリング、プリンやハンチントン病16,20欠陥に対する、ラルを使いました。ラルは、また生細胞イメージング研究に理想的です。たとえば、いくつかの研究では、シナプス小胞のリリースと吸収23,24を測定するのに、ラルを使用しています。これを行うことができます FM 1-43 などの染料を使用しています。
蛍光染色で、常数を簡単に観測できる、ために、電極は筋線維の長さの定数内運動終板に近接配置できます。終板と高いコンプライアンス 2 電極電圧クランプ システムの使用電極配置が捜査官 1% のエラーが16未満の潜在的な神経終板を完全に制御できます。電流クランプ条件10の下で記録されたシナプス電位の非線形和の一般的に使用される修正は実験条件によって引き起こされるシナプス後膜の変化を考慮しないために、これは重要になることができますおよび/または病気の状態。たとえば、減らされた休憩鏡板コンダクタンスはシナプス後電位19, であっても非線形和の修正が増幅されます。対照的に、シナプス電流の電圧クランプは非線形和エラーに服従しないとシナプス後膜特性の影響は受けません。これを示すには、我々 は最近から終板電位ハイパー興奮性ハンチントン病骨格筋16電流と比較して対照的な結果を示しています。
神経筋伝達を研究するため、ラルを使用して最終的な主な利点は単一シナプスからの録音があります。神経筋伝達は単一から記録された、完全に電圧クランプ鏡板は現在利用可能なモデリングとシナプス結合の複雑さを解くのために理想的であるシナプスの伝達にいくつかの最も詳細かつ正確なデータを提供します生理学。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ありがとう博士マーク ・ m ・ リッチとダニエル ・ ミランダ編集コメント、アフマド ・ Khedraki (A.A.V. にスタートアップ資金) の金融支援この手法、およびライト州立大学の確立を助けるため。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
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