Summary
Bu raporda açıklanan protokol nöromüsküler kavşak spontan kaydetmek için fare levator auris longus (LAL) kas ve postsinaptik potansiyeller (akım tipi kelepçe) sinir uyarılmış ve akımlar (gerilim tipi kelepçe) kullanır. Bu tekniğin kullanımı hastalık ve normal koşullar altında sinaptik aktarım mekanizmaları içine anahtar anlayışlar verebilir.
Abstract
Bu iletişim kuralı geçerli-kelepçe ve gerilim-kelepçe koşullar altında nöromüsküler kavşak üzerinden kayıt sinaptik iletimi için bir teknik anlatılmaktadır. Çünkü bu motor endplate, elektrot kazığa oturtma için nöromüsküler kavşak kolay görselleştirme sağlar bir ince kas levator auris longus (LAL) ex vivo hazırlanması kullanılır. Bu yöntem için kayıt spontan minyatür endplate potansiyelleri ve akımlar (mEPPs ve mEPCs), endplate sinir uyarılmış potansiyeller ve akımlar (EPPs ve EPCs), aynı zamanda motor endplate membran özelliklerini tanır. Bu yöntem elde edilen sonuçları quantal (QC), vezikül yayın siteleri (n) sayısı, vezikül yayın (prel), sinaptik kolaylaştırma ve depresyon yanı sıra kas zarı zaman sabiti (τ olasılığı içerik m) ve giriş direnci. Bu tekniğin uygulamaya fare modelleri insan hastalık hastalığı Birleşik Devletleri anahtar patolojiler vurgulayın ve roman tedavi stratejileri belirlemek. Tam voltaj-tek bir synapse sıkma tarafından bu yöntem bir sinaptik iletimi şu anda mevcut en ayrıntılı analizlerini sağlar.
Introduction
Nöromusküler kavşakta sinaptik iletimi okuyan gergin ve iskelet kas sistemleri arasındaki dinamik ilişki içine anlayışlar sağlar ve sinaptik Fizyoloji incelenmesi için mükemmel bir model. Levator auris longus (LAL) kolayca görüntülenmeyecektir nöromüsküler kavşak için izin veren bir ince kas var. Önceki raporlar sinaptik uyuşturucu ve toksinler incelemek ve iskelet kas fiber türü özellikleri LAL1,2nitelendirmiştir LAL kullanma kolaylığı anlatmıştık. Çok sayıda çalışma LAL nöromüsküler fizyolojisi3,4,5,6,7,8incelemek için kullandık. Elektrofizyoloji için yetenek kolayca LAL nöromüsküler kavşak gözlemlemek için microelectrodes motor endplate, doğru yerleşimini sağlar ve sinaptik iletimi kayıt alanı kelepçe sorunları büyük ölçüde azaltır. Membran zaman sabiti (τm) ve (Riçinde) giriş direnci gibi kas membran özelliklerini geçerli-kelepçe kayıtları kolayca elde edilir. Ayrıca, bu özellikleri kas zarı özellikleri sinaptik işleve doğrudan karşılaştırması için izin nöromuskuler iletim kaydetmek için kullanılan aynı kas liflerinden ölçülebilir. Bu veri analizi birçok nöromüsküler hastalıklar ve Birleşik değişmiş faaliyet fiziksel mekanizmalarının içine anahtar anlayışlar verebilir.
Burada açıklanan tekniği önemli bir yönü olmayan linearities akım-kelepçe içinde karşılaşılan tabi değildir ve kas membran özelliklerini bağımsız sinaptik kayıtları için gerilim tipi kelepçe kullanımıdır. Nöromuskuler iletim incelemek için gerilim-kelepçe akım tipi kelepçe karşı kullanmanın yararları 1950'lerde9çabalarında öncü tarafından kuruldu. Geçerli-kelepçe altında 10-15 mV genlik içinde aşan EPPs mEPP genlik9doğrusal bir ürün değildir. Örneğin, ortalama mEPP 1 mV, bir EPP 5 mV 5 mEPPs 5 (QC); ürün olarak kabul Oysa, bir EPP 40 mV 40'tan fazla mEPPs ürün olacak. Membran potansiyeli ve asetilkolin reseptörü denge potansiyeli arasındaki farktır EPP için sürüş zorlamak için daha büyük EPPs, bu non-lineer oluşur (~ -10 mV), büyük EPPs sırasında önemli ölçüde azaltır. Çünkü kas membran potansiyeli gerilim tipi kelepçe deneyler sırasında değişmiyor bu sorun gerilim tipi kelepçe deneylerde önlenmiş olur. Bir dezavantajı gerilim tipi kelepçe deneyler daha geçerli-kelepçe kayıt tamamlamak teknik olarak daha zor olmasıdır. Bunu aklýnýzda tutarak, Sigara linearities akım tipi kelepçe kayıtları EPPs10hesapları basit bir matematiksel düzeltme McLachlan ve Martin geliştirdi. Düzeltmeleri de11,12,13iş ama önemlisi, kas zarı özellikleri değil kesintiye varsayıyorum.
Kas zarı özellikleri koşulları ya da kas bozabilir hastalık durumlarında eğitim düşünün özellikle önemlidir. Örneğin, Huntington hastalığı R6/2 transgenik modelinden kas iskelet dinlenme klorür ve potasyum akımları14,15hyperexcitable bir progresif azalma nedeniyle olur. Sonuç olarak mEPPs ve EPPs R6/2 iskelet kas güçlendirilmiş. Kesinlikle, Ek etkenler mEPPs ve EPPs değiştirebilir. SNARE-proteinler8' e ilgili gibi görünüyordu EPPs değişiklikleri bulunan farklı bir model Huntington hastalığı fare (R6/1) ile çalışma. Neden değiştirilmiş nöromuskuler iletim mekanizmaları değerlendirmek için gerilim tipi kelepçe kullanarak değiştirilmiş kas zarı özellikleri etkilerini ortadan kaldırmak faydalı olacaktır. Bir son çalışmada, R6/2 nöromuskuler iletim burada açıklanan tekniği kullanarak her iki akım ve gerilim kelepçe koşullar altında incelenmiştir. Motor endplates tamamını gerilim-% 1 hata klempe ile daha az iki microelectrodes endplate16uzunluğu sabit içinde yerleştirerek. Bu gerilim tipi kelepçe gösterildi ve R6/2 kas nöromuskuler iletim zıt ölçümleri vermiştir akım tipi kelepçe kayıtları düzeltti. Bu kas zarı özellikleri üzerinde değişiklik yapılmış Eğer EPPs sigara linearities düzeltmek zor olabileceğini vurgular ve kas membran özelliklerini bağımsız voltaj-kelepçe kayıtlarını edinme yararları göstermektedir. Burada sunulan Protokolü koşulları veya sinaptik iletimi ve postsinaptik membran özelliklerini etkileyen hastalık durumlarında incelenmesi için idealdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan yordamları hayvan bakım ve kullanım Komitesi Wright Devlet Üniversitesi uygun olarak yapıldı.
1. fare ötenazi
- Bir duman başlık, hava geçirmez bir cam odası anesthetizing fareyi getirin.
- Fareyi isoflurane (doyurarak veya ~ % 25) ölümcül bir doz için inhalasyon yoluyla ortaya çıkarmak. Nefes gözlenen kadar odasında fareyi bırakın.
- Fare odasından kaldırın ve ötenazi, ikincil yöntem olarak yerindençıkmasına servikal gerçekleştirmek.
2. kaldırma saç baş, boyun ve sırt Dorsal yüzeyinden
- Bir Elektrikli tıraş makinesi saç baş, boyun ve fare arkasında dorsal yüzeyi çoğunluğu kaldırmak için kullanın. Ayrıca, çevresinde ve sol kulak saç kaldırmak.
Not: dikkat çekmek ne zaman tıraş kulak çevresindeki deri, deri tıraş bıçakları yakayı ele ve temel kas dokusuna zarar verebilir. - Saç dökücü krem bir pamuk bez ile kalan saç kaldırmak için traş bölgeye uygulanır. Yaklaşık 1 dakika bekleyin ve krem saç kaldırma sıkmak yıkama şişe kullanarak su ile durulayın sonra uzak kalan herhangi bir krem veya pamuklu çubukla kullanarak saç fırça ve cilt kuru pat.
3. deri Levator Auris Longus kas ortaya çıkarmak için kaldırmak
- Stereo diseksiyon mikroskop altında fare scapulae düzeyde arkasında küçük bir insizyon attım (Cilt için sadece derin yeterli) olun. Şekil 1A-Bgösterilen yolunu izleyerek mikro diseksiyon makası kullanarak deriyi kesme.
- (No 5 gibi) iyi forseps kullanarak, scapulae yakın kesme boyunca cilt kaldırın. Bahar makas kullanılarak, bağ dokusu deri kulak yaklaşırken temel kas dokusundan ayırmak için kesme. Önemlisi, bağ dokusu maruz kalan kas dokusunun yanlışlıkla kesme önlemek için deri içine sivri Bıçaklar ile kesti.
- Düzenli olarak maruz kalan kas (mM) oluşur aşağıdaki Na+ dış arabellek gibi bir fizyolojik serum fizyolojik solüsyonu ile sıvı: 144 NaCl, 4 KCl, 1.2 CaCl2, 0.6 MgCl2, 5 glikoz, 1 NaH2PO4, pH 7.4 NaOH ile ve bir osmolalite 300 ± 5 mmol/kg vardır. Bir kez cilt tamamen fare kaldırmak ve onu atmak için kulak çevresindeki deri kesilmiş sol kulak için bağ dokusu kesilmiş oldu.
Not: LAL kulak tabanına verdiği ve cilt kaldırılırken kolayca zarar görebilir. Yaklaşık 1 mm LAL kesme önlemek için kulak tabanı etrafında deri bırakmak iyidir.
4. kaldırma Levator Auris Longus kas ve çevresindeki doku
- Hangi omurga arasında scapulae bağlanmak için LAL, aşağı kesim kasları tarafından bahar makas kullanarak başlatın. Sadece orta hat, sağına doğru kürek başlangıç ve orta hat sağ tarafında kalan süre rostral fareyi, sonuna doğru kesti. Devam sonuna kadar kas dokusu sonuna kadar kafatası üzerinde kesme.
Not: LAL kulak ve orta hat, medial tarafına bağlı en yüzeysel kas Şekil 2' de gösterildiği gibidir. Diğer resimleri, AK Greene17 tarafından bir kitap LAL mükemmel, çizilmiş görüntüleri gösterir. - Forseps orta hat, hemen sağındaki kesme doku kapmak sonra yavaşça kaldırın ve doku sol kulak doğru sol LAL aşağı olan birkaç kat kas kaldırmak için kafatası karşı baskı makas bıçaklı kesme başlamak için kullanın. Tüm geçici olarak yanlışlıkla LAL kaldırma sırasında kesme önlemek için bağlı katmanların bırakın.
- Bıçaklar ile paralel olarak kesmek ve belgili tanımlık kulak kanal kaydırılır ve kas kulak medial tarafında girer LAL innervates sinir kesme önlemek için kafatası karşı baskı. Kadar mümkün olduğunca bağlı sinir tutmak belgili tanımlık kulak kanal içinden devam.
Not: LAL sağlayan sinir uzakta-in yüz sinir dalları ve daha sonra yordamda kullanılacaktır olarak muhafaza edilmelidir. - Şekil 1B adımında kulak ventrolateral kısmı üzerinde gösterilen aynı yol boyunca kulak kanalına geçince mi yağlı doku kes. Ayrıca, sol kürek kemiği kas tamamen fare kaldırmak için sağ tarafta olduğu gibi kesti.
5. Levator Auris Longus kas yalıtım
- LAL ve çevresindeki doku, bir konteyner içine yerleştirin. Bir konteyner içinde disseke doku gibi bir petri silikon elastomer alt ile altına tutturulmuş kullanın. Banyo ve doku bir fizyolojik serum çözümde sık sık yıkayın.
- Boyunca Bankası için LAL bağlı kulak kıkırdak parçası bırakarak kulak, kulak pinna kesti. Böylece aşağı yüzün (LAL çanak alt) yukarı dönük kas çevir.
- Hazırlık tutmak için belgili tanımlık kulak kanal aracılığıyla bir böcek pin gibi bir iğne yerleştirin. O zaman daha küçük iğne, PIN LAL midline karşı tarafta kalan doku kullanarak. Forseps kullanarak, yavaşça deri yan kısmındaki kas germek dışarı ve bir iğne deri yoluyla yerleştirmek için kulak çekin. Şekil 3' te gösterildiği gibi iyi yemek için güvenli dokudur kadar bu adımı yineleyin.
Not: Küçük diseksiyon pimleri akupunktur iğneleri ipuçları için istenilen uzunluğa kesim tarafından yapılabilir. Bu küçük pin doku hasarı en aza indirmek ve su-daldırma mikroskop objektif uzun çalışma uzaklıkları ile birlikte kullanılabilir. - Begin, kasları (gösterildiği şekil 4) kaldırma bu LAL (auricularis üstün, kaçıran auris longus ve interscutularis) kapsayan ve bu LAL için bağ dokusu ile bağlı ve özellikle dar yakınındaki orta çizgi, No 5 forseps ve bahar makas kullanarak.
- Yukarı çekmeye forseps kullanarak örten kas katmandaki bağ dokusu ile varlık makara kas katmanı doğru odaklı bıçaklar ve kesme veya LAL nicking önlemek için dikkat ediniz. Orta çizgi doğru kesme ve orta hat giderken yaklaşık dörtte üçü kesmeyi bırak. Sonra her kas katmanı kaldırmak için orta hat için paralel kesti. Kadar sadece LAL kalır kas tabakaları kaldırma devam et.
- Elektrotlar kazığa oturtma içinde AIDS LAL kapsayan kalan bağ dokusu bazılarını kaldırın. Yavaşça No 5 forseps bağ dokusu LAL uzak çekmek ve uzak bahar makas kullanarak kesmek için kullanın. Sadece o kadar kolay sürecinde LAL zarar riski olmadan yapılabilir doku kaldırın. Nöromüsküler kavşak görselleştirme engel LAL alt yüzeyinde kalan aşağı kas tabakaları innervate herhangi bir büyük sinirler kaldırın.
6. sinir yalıtım
- Sinir Stimülatörü kullanarak LAL innervates sinir belirle (örneğin, iki Platin teller bağlı bir darbe üreteci); kulak kanalına kaslar için çalışan birkaç sinirler bulunur. Sinirleri bazı akım sağlayan sinir Stimülatörü ile touch (geçerli V 5 civarında değişir). Ne zaman kas sözleşmeleri, doğru sinir olduğu belirlendi.
- Dikkatle doku sinir yakınındaki kapmak ve bahar makas sinir kulak çevreleyen dokusundan ayırmak için kullanın. Hasarı en aza indirmek için daha sonra kayıt çanak sinir güvenliğini sağlamak için kullanılan bazı çevreleyen doku gömülü sinir çoğunu tutun.
Not: LAL innervates motor sinir medial ve açılış belgili tanımlık kulak kanal tarafında bulunur. - İki kutuplu bir uyarıcı elektrot kullanarak, sinir, kas distal bölgenin etrafında sadece çevreleyen doku kaldırın. Emme bir elektrot kullanarak, sinir kesme sonundaki çevreleyen doku kaldırın.
Not: Bu iyi durdurma noktadır. Bu bir iyi durdurma noktadır. Eğer bir ara disseke LAL hazırlık bir fizyolojik çözüm ya da bir kaç saat zararlı metabolitleri değil birikir sağlamak için sürekli perfüzyon sürdürülebilir. Çözüm ya da sabit perfüzyon büyük miktarda zararlı metabolitleri değil birikir emin olmak için kullanın. - Ardından, çözme ve perfüzyon odasına dik bir bileşik mikroskop altında Elektrofizyoloji deneyler için kas transferi.
Not: Kullanım ile yumuşak bir alt doku güvenli bir şekilde olabilen bir perfüzyon Odası (şekil 5A) tutturulmuş. - İğne ucunda (kulak ve orta hat) ve kas kenarı boyunca kas. Sinir kas lifleri dikey konumlandırma ve sinir sonunda sağlam kaldı bazı aşırı doku ile çanak dibine pin. Her zaman bir fizyolojik serum çözümde banyo doku tutun.
Not: Yükseltilmiş malzeme doğrudan altında LAL kas lifleri yuvarlak yararlıdır. Bu ekstra destek elektrot kazığa oturtma AIDS ve yan tarafında yalan bir 50 mL konik tüp döküm silikon elastomer küçük bir bölümünden yapılabilir. Elastomer yuvarlak bölümünü taze silikon az miktarda kullanarak perfüzyon odası altına güvenli. Perfüzyon odası bir diyagram şekil 5B-Cile gösterilir. Kas lifleri (ki çok hidrofobik) yeni oyuncular silikon elastomer için çok sıkı uygun ve daha da zarar görebilir. Ceket için yararlıdır veya blok yeni protein, bir immunoblot engelleme adımına benzer silikon döküm. Bunu engellemek için biz yeni oyuncular silikon sığır serum albümin konsantre bir çözümde gecede inkübe.
7. Elektrofizyoloji ekipman kurulumu
- Hazırlamak veya aliquots gibi ışığa duyarlı ve ışıktan uzak muhafaza edilmelidir mitokondrial boya 4-(4-diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium18, nöromüsküler kavşak görselleştirme yardım etmek için bir boya, buzlarını. Ayrıca, elektrot çözümleri çözme. Girdap tüm solutes çözüm olduğundan emin olmak için tüm aliquots. 1 µM içeren bir fizyolojik serum çözüm hazırlamak µ-Conotoxin GIIIB (μ-CTX) ve 80 µM BTS (isteğe bağlı).
- Perfüzyon odası mikroskop sahneye LAL ile güvenli. 3 M agar Köprüsü üzerinden kayıt odası'na bağlı KCl Place referans elektrot bir bardağa dolu. Referans elektrot amfi üreticinin yönergelerini başına bağlayın.
- Bu noktada, sinir uyarıcı elektrot sinir üzerinde konumlandırın. De sinir stimülasyonu için çalışırken bir emme elektrot veya küçük bir iki kutuplu elektrot kullanın.
- Uyarıcı elektrot gibi kas uyarımı yapı kayıtları sayısını en aza indirmek için mümkün olduğunca uzak getirin.
Not: Uyarıcı elektrot gerilimi genlik gerektiği gibi kontrol edebilirsiniz bir uyarıcı yalıtım birimi ile kontrol edilmelidir.
- Uyarıcı elektrot gibi kas uyarımı yapı kayıtları sayısını en aza indirmek için mümkün olduğunca uzak getirin.
- Yavaş yavaş kasılmalar gözlenen kadar uyarıcı yalıtım birimi üzerinde gerilim düğmeyi çevirerek gerilim yükseltmek. Hangi ilk daralma gözlenmiştir eşik noktasıdır. Bir kez tanımlanan eşik, gerilim uyarıcı yalıtım birimi üzerinde 1,5 ayarla * eşik (veya deneme tarafından tanımlandığı gibi).
Not: Şekil 6 dik bir mikroskop ve Bugi manipülatör kullanarak sinir yerleştirilmiş küçük iki kutuplu elektrot altında kurmak kas hazırlık göstermektedir. Hala yeterince eşiğin olurken mümkün uyarılması için en düşük fiyat voltajı için olumlu. Daha düşük bir uyarıcı gerilim kayıtları sırasında stimülasyon yapı sayısını azaltır. Ayrıca, uzak Kas uyarıcı elektrot yerleştirme stimülasyon obje boyutunu azaltır. Bazen sinir Stimülatörü nereye yerleştirileceğini ile deneme gerekli olabilir bu yüzden sinir sonu diseksiyon zarar görür. - Banyo tuzlu çözüm kaldırın ve 5 µM 4-Di-2-Asp ile değiştirin. LAL Hazırlık'a 4-Di-2-Asp nöromüsküler kavşak görüntüleme (Şekil 7) için yeterli Floresans elde etmek 10 min için maruz.
- İki elektrot çözümleri, 3 M KCl ve K+ iç çözüm (mM) oluşan 75 aspartat, 5 MgCl2, 15 Ca(OH)2, 5 ATP disodyum, 5 phosphocreatine disodyum, 5 glutatyon, 20 BEZLERİ, 30 EGTA, pH 7.2 KOH ile hazır olun.
Not: Çözümleri önceden hazırlanmalı; K+ iç çözüm aliquots-20 ° C'de depolanan - Dolgu çekti cam ile 3 M KCl. gerilim algılamalı elektrot için kılcal K+ iç çözüm (hazırlanan adım 7,6) akım geçen elektrot için kullanın; 1 mL şırınga bağlı bir Ametal dar iğne (~ 34 ölçer) kolayca cam kılcal doldurmak için kullanın. Yavaşça hava kabarcıkları kaldırmak için kılcal dokunun; Dolgulu elektroda direnci 10-15 MΩ olduğundan emin olun.
Not: Kontrol ve veri toplama yazılımı kullanarak her iki elektrot direnç not edin. - 10 dakika sonra normal Ca2 + çözüm 4-Di-Asp Çözümle değişimi.
8. nöromüsküler kavşak Floresans kullanarak tanımlaması
- Standart parlak alan ve floresan aydınlatma ile dik bir mikroskop kullanarak, floresan yeşil nöromüsküler kavşak dikey şekil 7Aiçinde gösterildiği gibi hazırlık boyunca kas lifleri için çalışan bir parlak bant arayın. Nöromüsküler kavşak tanımlamak için bir düşük büyütme su-daldırma hedefi (~ 10 X) kullanın
Not: Mikroskop FITC küp ile donatılmış olmalıdır (Ex: 480/40, Dichroic: 505LP, Em: 535/50) ve bir LED, lazer, halojen lamba veya civa lamba floresan için. Fotoğrafı beyazlatma, alan parlak ve floresan aydınlatma arasında geçiş yapar en aza indirmek için.
Not: Bu genellikle daha proksimal orta hat kulağa tabanına grubudur. Grup nöromüsküler kavşak en yoğun olduğu bölgedir. - Daha yüksek bir büyütme su-daldırma amaç (~ 40 X) geçin ve Elektrofizyoloji (şekil 7B) ile incelemek için bir nöromüsküler kavşak kas üst tabakası üzerinde tanımlamak.
- Başına üretici yönergelerine uygun headstages pipet tutucular içine doldurulmuş Pipetler güvenli. Yukarıda tanımlanan nöromüsküler kavşak (şekil 7C) 100 µm içinde kas membran elektrotlar yerleştirmek için micromanipulators kullanın. Öncelikle alan parlak mikroskobu kullanılarak elektrotlar yerleştirmek; Floresans elektrotlar nöromüsküler kavşak göreli konumunu doğrulamak için kullanın.
- Öncelikle, bir düşük büyütme (~ 10 X) hedefi elektrotlar bulun ve sonra son elektrotlar konumlandırma için daha yüksek bir büyütme (~ 40 X) amaç için geçiş yapmak için kullanın. Elektrotlar kasına bu noktada kazığa oturtmak değil, ilk elektrotlar radyo istasyonu ayarlayın.
9. Aksesuar ve elektrotlar Impaling
- Elektrotlar istenen fiber konumlandırılmış bir kez sıfır ve köprü Dengeleme (ya da benzer bir yaklaşım) gerilim algılamalı elektrot ayarlamak ve üretici yönergelerine başına elektrot kapasitans nötralize. Ayrıca, akım geçen elektrot sıfır.
- Her iki elektrot lif yüzeyinin aşağı getir. Yavaş yavaş böylece elektrotlar nöromüsküler kavşak ile ilgili olarak odaklı kalır lif aşağı yolda elektrotlar konumunu 8.3 ve 8,4 adımlarda açıklandığı gibi ayarlayın.
- Sonra her iki elektrot kas lif yüzeyine temas etmiş, künt akım geçen elektrot ilk kazığa oturtmak. Elektrot kazığa oturtma kolaylaştırmak için buzz (aşırı kapasite tazminat kısa bakliyat), kısa geçerli bakliyat veya hafifçe dokunarak tablo gibi teknikleri kullanın.
- Elektrot Impaled gösterir negatif membran potansiyeli tespit kadar bir osiloskop veya osiloskop protokolü veri toplama yazılımı kullanarak olan sinyali, izlemek.
- Daha net voltaj algılamalı elektrot Impaled akım geçen elektrot seviyesine kas üzerine bunalıma girmek. Her iki elektrot doğrultusunda bir başka bir kez, akım geçen elektrot ile uygulanan aynı teknikleri kullanarak gerilim algılamalı elektrot kazığa oturtmak.
- Başarılı kazığa oturtma, denetleyicinin amplifikatör için kullanarak üzerine sürekli negatif elektrot kazığa oturtma nedeniyle Membran zarar telafi etmek için geçerli geçen elektrot ile güncel tutan bir uygulanır. Hücre-80 doğru yavaş yavaş şarj etmek Başlarken mV, holding olarak geçerli gerekli istenen istirahat için potansiyel cep getirmek için artış (Yani,-80 -85 için mV).
Not: kayıt gerektiren bir holding liflerinden önlemek geçerli mutlak değerde sağlıksız liflerinden kayıt olasılığını en aza indirmek için-25 nA vahşi tipi kas daha büyük. - Fiber için birkaç dakika istenen dinlenme potansiyel, stabil sonra kas zarı özellikleri veya nöromuskuler iletim kayıt için devam etmek.
10. kayıt postsinaptik membran özellikleri ve sinaptik iletimi
- Geçerli-kelepçe kayıtları ile eşit sayıda motor endplate Riçinde ve τmbelirlemek için kullanılan karşılık gelen membran gerilim yanıtları ölçmek için pozitif ve negatif geçerli adımları uygulayarak başlar. Pasif özellikleri sağlamak için kararlı bir duruma ulaşmak ve bir doğrusal gerilim-akım ilişki16,19,20küçük gerilim yanıt kullanın. Kayıt ile bozuk veya sağlıksız Sinir liflerinden önlemek, mEPP frekans böyle lifleri var > 3 Hz.
- Sonra iki elektrot gerilimi-kelepçe üretici yönergelerine başına girin. Gerilim Tipi Kelepçe lifler -85 membran potansiyelini, mV. Gerilim Tipi Kelepçe ayarlar mEPCs olarak algılanmasını sağlayan sinyal noise oranları elde etmek.
Not: Bakımı yeterli gerilim kontrolü bir sorun olabilir. Bu sorunları en aza indirmek için iki yöntem kullanabilirsiniz. İlk olarak, lifler motor endplate 100 µm içinde daha önce açıklandığı gibi bu lifler21uzunluğu sabit içinde olduğu Impaled. İkinci olarak, biz amplifikatör DC geri yükleme özelliğini kullanın. Bu özelliği bir çok yüksek voltaj-kelepçe kazanç ayarlar. Önceki çalışmalarımız bu yöntem ayrıntılı olarak açıklanan ve gerilim klempe endplate16değerlendirmek için bir yöntem sıraladı. - Bir kez kayıt gerilim-kelepçe, sinaptik akımları (mEPCs ve eEPCs) çeşitli sinir stimülasyonu protokolleri kullanarak deneme gereksinimlerini temel alarak.
- Kayıt kendiliğinden mEPCs ve bir kayda EPCs sinaptik Modülasyon (kolaylaştırma veya modülasyon) quantal içerik değerlendirmek için olmadan sağlayan bir düşük frekanslı sinir stimülasyonu Protokolü (≤0.5 Hz) kullanarak EPCs. Sinaptik kolaylaştırma veya depresyon değerlendirmek için bir yüksek frekans sinir stimülasyonu Protokolü (50 Hz değerinde 10 bakliyat) kullanın.
- Veri toplama yazılımı ile kontrol edilir bir darbe Oluşturucu'yu kullanmamanızı tetiklenebilir bir uyarıcı yalıtım birimi üzerinden istenilen frekansta sinir uyarmak.
- Bir kez gerilim tipi kelepçe kayıtları yapılır, amplifikatör bir akım tipi kelepçe ayara dönmek, Bütün akımlar off ve elektrotlar elyaf çıkarın. Elektrotlar değil tıkalı haline onay veya kayıt sırasında temel gerilim içinde drift.
Not: lif kazığa oturtma önce ayarlanmış olarak drift ile ilgili elektrot gerilimi ekstraselüler çözümünde, 0 volt olmalıdır. Örneğin, kaydedilmiş Gerilim Gerilim deneme sırasında sürüklendi Eğer belirsiz olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 8 geçerli bakliyat (şekil 8A) ve bir LAL fiber akım tipi kelepçe altında gerilim yanıtlarının (şekil 8B) bir 12-hafta-yaşlı vahşi türden R6/2 fare gösterilmektedir. Bu kayıtlar motor endplate alınmıştır mEPPs varlığını gösterir. Kayıtları normal fizyolojik serum çözümde elde edilmiştir. Bu akım tipi kelepçe kayıtları Riçinde ve τm bu lif16,19,20belirlemek için analiz edilebilir.
EPC ve gerilim tipi kelepçe koşullarda elde edilen iki mEPCs temsilcisi bir kayıt Þekil 9Aiçinde gösterilir. EPC önceki kısa geçerli saptırma sinir stimülasyonu tarafından neden eserdir. MEPCs ve EPCs analizi yapılabilir olay algılama yazılımı ile daha hızlı. Bu araç daha sonra otomatik olarak kayıt içinde olayları algılayabilir bir şablon yapmak araştırmacı verir. Olayları üst üste ve herhangi bir veri analiz yazılımı verilebilir. Şekil 9B üst üste EPCs ve mEPCs (gömme) temsilcisi fiber gösterir.
Resim 1 : Genel konumunu Levator auris longus kas
LAL kas kafa dorsal yüzeye bulunur. Kırmızı noktalı çizgi cilt temizleme dorsal (A) ve yanal (B) yüzey için kesme yolu vurgulamaktadır. LAL kulak tabanına ekler, böylece yaklaşık 1 mm kulak tabanı etrafında deri LAL kesme önlemek için sağlam kalmalıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Maruz Levator auris longus kas
LAL (sarı ve yeşil) Cilt altında bulunur ve vurgulanan alanı içinde en yüzeysel kas. Kas, beyin (sarı) iki bölüm vardır ve Kaudal (yeşil) bölgeler. Kafatası bölge ilk dört servikal vertebra, orta hat üzerinden ortaya çıkar ve Bankası lobülü ön parçası doğru çalışır. Başvuru için orta hat scapulae (beyaz ok) burun doğru çalışır bağ dokusu bir grubudur. Sağ ve sol LAL kas orta hat üzerinde kafatası bağlayın. Kafatası LAL Kaudal bölümünden daha çok geniş bir bölümüdür. Kaudal kısmını dördüncü ve beşinci servikal vertebra, orta hat yakınındaki ekler ve lobülü Bankası arka bölümüne bağlanır. Diseksiyon sırasında resimde bir parantez Kesikli çizgiyle işaretlenir LAL kesme önlemek için kıkırdak kulak çevresindeki deri birkaç milimetre tutun. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Ham diseksiyon Levator auris longus ve çevresindeki kas
Bir kez belgili tanımlık hayvan--dan çıkarmak, ince iğne 5.3 bölümünde açıklandığı gibi yapılmış kullanarak bir silikon elastomer kaplı çanak içine (LAL altta), aşağı sabitlenmiş, dorsal yan dokudur. Bir kez yemek sonuna kadar güvenli, üstteki kas tabakaları-ebilmek var olmak çıkarmak. Kulak kanalı aracılığıyla böcek bir PIN beyaz bir kesik ok ile gösterilir. Sarı oklar istenmeyen kas kaldırılması için ideal PIN yerleşim gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Kas katmanı için doğrudan aşağı Levator auris longus
Vurgulanmış kaçıran auris longus (AAL) mavi, kırmızı auricularis scupularis (AS) ise sarı renkte interscutularis (IS). LAL ana kas görüntü bu temel olduğunu. Başvuru için kulak ve çevresindeki deri bir katı siyah çizgiyle anlattı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Silikon elastomer kaplı, özel perfüzyon odası
Gösterilen özel 35 mm perfüzyon çanak LAL Elektrofizyolojik kayıtlar (A)için güvenlik altına almak için kullanılır. Silikon elastomer bir yüzey dokusu hasretini için uygun oluşturmak için kullanılmıştır. Odanın ortasına lifler impaling yararlıdır yuvarlak bir platformdur. Platform ne zaman elektrotlar aşağıya doğru bir güçle kazığa oturtma sırasında uygulama işleme altında kas lifleri üzerinden destekler. Bu platform için eğri şeklinde bir 50 mL konik tüp için silikon elastomer izin vererek şeklinde oldu. Bir dilim yuvarlak silikon elastomer olabilir o zaman daha fazla silikon elastomer ile odası altına yapıştırılmış olabilir. Çanak yanı sıra yan üzerinde görünümü, Seviyelendirilmiş bir temsilidir B ve C nerede perfüzyon odası daha net görülebilir içinde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Elektrofizyoloji deneme kurulumu
Küçük bir iki kutuplu elektrot yerde LAL sinir uyarmak için bir manyetik Bugi manipülatör ile düzenlenmektedir. Mikroskop sahne kolayca manyetik bir platform (gibi bir zanaat veya donanım mağaza Buzdolabı Mıknatıslar yapmak için bulunabilir) yapışkan bir manyetik malzeme kullanımı ile tutmak için yapılabilir. Ayrıca headstages ve bir LAL örnek konumlandırılmış elektrotları gösterilmiştir. Önemli bir araç su-daldırma, eğimli amacı seramik bir daldırma koni ile gösterildiği gibidir. Eğimli sonunda daha kolay elektrot yerleştirme için sağlar ve seramik malzeme elektriksel gürültü en aza indirir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : Nöromüsküler kavşak kimlik
Tüm resimleri 5 µM 4-Di-2-Asp (yeşil nöromüsküler kavşak görselleştirme için izin vermek için) ile lekeli LAL göster. Nöromüsküler kavşak (A) A parlak bant-ebilmek var olmak seen (sarı ok) kas 10 X objektif aracılığıyla görüntülerken. Dallanma aksonlar da beyaz Kesikli okla gösterilen görülebilir. (B) küçük confocal yığını (5 x 1 µm) üç nöromüsküler kavşak (sarı ok). Sağlıklı kas lifleri sarcolemma fiber (beyaz ok) boyunca karanlık noktalar olarak görünür birden çok myonuclei yanı sıra açık yiv izleri var. Sık sık nöromüsküler kavşak innerve aksonlar de görülebilmektedir. (C) A fiber cam elektrotlar ile Impaled lekeli bir nöromüsküler kavşak ile. Böylece daha kolay görülebilir elektrotlar beyaz bir vurgu ile geliştirilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8 : Geçerli kelepçe membran özelliklerini kayıt
Enjekte geçerli bakliyat(a)ve olası yanıt (B) LAL bir fiber kaydedilen sonuç membran fizyolojik tuzlu çözümde banyo yaptım. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9 : İki elektrot gerilimi-kelepçe kayıtları
EPC ve iki mEPCs ham bir iz iki elektrot gerilimi-kelepçe(a)kaydedildi. Üst üste EPCs ve mEPCs (gömme) tek Fiber (B). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan hazırlık ve akım veya gerilim kelepçe koşullar altında nöromuskuler iletim ölçümü için fareyi LAL kas kullanımı olduğunu. LAL dissekan için göz önünde bulundurulacak birkaç önemli nokta vardır. Aşırı bağ dokusu kas AIDS olarak elektrot elektrot kazığa oturtma'dan temizlik bağ dokusu onları kazığa oturtma için yerleştirirken pürüzle. Ancak, sadece elinden alınan bağ dokusu kaldırmak kolayca kas zarar verme olasılığını sınırlandırmak için. Çünkü çok hassas sinir yalıtım özenle yapılmalıdır. Sinir hasarı önlemek için bazı hangi aracılığıyla sinir yemek için güvenli hale getirmek için bir PIN yerleştirilebilir sinir sonu iliştirilmiş çevreleyen doku bırakmak yararlıdır. Ayrıca, sinir sinir Stimülatörü yerleştirirken ezmek değil için dikkat. Son olarak, hangi lif elektrotlar Impaled sırası önemlidir. Künt elektrot kazığa oturtmak için olabildiğince kolay değil ve ilk Impaled. Eğer keskin elektrot ilk Impaled, muhtemelen neden fiber dışarı gel için keskin elektrot membran deler önce künt elektrot kas fiber aşağı doğru itin. Bu lif gereksiz Membran zarar keskin elektrot ile ikinci kez kazığa oturtmak için gerekli olur. Elektrot Impaled gösteren zarda potansiyel olumsuz bir saptırma görülebilir böylece kullanılan amplifikatör aynı anda akım ve gerilim geçerli geçen elektrot ölçebilir bu yararlıdır.
Yararlı olabilir LAL özelliklerinden biri aynı anda her iki kas kaldırmak için yeteneğidir. Bu aynı hayvan Elektrofizyoloji, moleküler biyoloji deneyleri gerçekleştirmek için büyük olabilir. Bu temelde aynı iletişim kuralını burada küçük değişikliklerle anlatılan izleyerek gerçekleştirilebilir. 1-3 sağ tarafında yanı sıra sol açıklanan her şeyi başlıklar altında tüm adımları izleyin. 4 adımda kesme kasları kaldırmak için sağ kulak ventrolateral kenarındaki başlamak en iyisidir. Daha önce anlatıldığı gibi her zaman derin LAL için bağlı alt kasların bırakarak mümkün olduğunca kesmek için kafatası karşı baskı bıçakları tutun. Mümkün olduğu kadar derin bıçak tutarak orta hat, geçmiş sağ kulak doğru kesmeye devam. Bu noktada, yordamın kalan kısmını bu protokol için açıklandığı gibi yalnızca her iki kas üzerine geri kalan adımları gerçekleştirin. Bir zamanlar kasları temizlenir, bir LAL uzak ve daha sonra moleküler analiz için dondurulmuş kesebilir ve diğer-ebilmek var olmak kullanılmış için Elektrofizyoloji. Aynı hayvan her iki kaslı Elektrofizyoloji çalışmalar yapmak zor olurdu. Bunu yapmak için orta hat kasları ayırmak için kesilmiş olmalı ve zarar bazı kas lifleri çok büyük olasılıkla.
LAL uzun ince doğası motor endplates ve mükemmel ex vivo perfüzyon1,3,4,5 kolay tanımlanması için verdiğinden nöromuskuler iletim incelemek için kullanılmıştır ,6,7,8. 4-di-2-asp kullanılmasına ek olarak, diğer gruplar düşük konsantrasyonlarda22, rhodamin Birleşik bungarotoxin kullandık. Biz-si olmak kullanılmış LAL Elektrofizyolojik tetkikler, sinyal purinergic ve Huntington hastalığı16,20kusur için. LAL canlı hücre görüntüleme çalışmaları için idealdir. Örneğin, birçok araştırma-si olmak kullanılmış LAL sinaptik vezikül yayın ve alımı23,24ölçmek için. Bu yapılabilir boya, FM 1-43 gibi kullanarak.
Endplates kolayca ile floresan bir leke görülebilir çünkü elektrotlar yakın motor endplate kas lif uzunluğu sabit içinde yerleştirilebilir. Elektrot yerleştirme endplate ve yüksek uyum iki elektrot gerilimi-kelepçe sistemi tam olarak % 1 hata16daha az ile potansiyel endplate denetlemek müfettişler sağlar. Doğrusal olmayan akım tipi kelepçe koşulları10 altında kaydedilen sinaptik potansiyelleri toplamı için yaygın olarak kullanılan düzeltmeleri deneysel koşulları neden postsinaptik membran değişiklikleri için hesap yapmak çünkü bu önemli olabilir ve/veya hastalık durumu. Örneğin, azaltılmış dinlenme endplate conductances postsinaptik potansiyeller19, hatta doğrusal toplamı için düzeltilmiş yükseltmek. Buna ek olarak, gerilim klempe postsinaptik akımları doğrusal toplamı hataları tabi değil ve postsinaptik membran özelliklerini bağımsızdır. Bu gösteri, biz son zamanlarda endplate potansiyelleri telaşlı hiper Huntington hastalığı kas iskelet16' dan kaydedilen akımları göre zıt sonuçlar göstermiştir.
LAL nöromuskuler iletim eğitimi için kullanmanın bir final anahtar avantajı kayıtları tek bir synapse olmasıdır. Nöromuskuler iletim, tek bir kaydedilen tam voltaj klempe endplate bazı en ayrıntılı ve doğru veri modelleme ve sinaptik karmaşıklığı çözülüyor için ideal olan sinaptik iletimi şu anda mevcut sağlar Fizyoloji.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Dr Mark M. zengin ve Daniel Miranda Editöryel Yorum için Ahmad Khedraki mali destek (A.A.V. için başlangıç Fonu) için bu tekniği ve Wright Devlet Üniversitesi kurmak yardım ettiğin için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. The anatomy of the rat. , Hafner Pub. (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. Electric current flow in excitable cells. , Clarendon Press. (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
