Summary
El protocolo descrito en este artículo utiliza el músculo levator auris longus (LAL) de ratón para grabar espontánea y nervio postsynaptic potenciales evocados (abrazadera de la corriente) y corrientes (abrazadera de tensión) en la Unión neuromuscular. Uso de esta técnica puede proporcionar ideas claves en los mecanismos de transmisión sináptica en condiciones normales y la enfermedad.
Abstract
Este protocolo describe una técnica para grabar transmisión sináptica de la placa neuromuscular bajo condiciones de corriente abrazadera y pinza de voltaje. Una preparación ex vivo del levator auris longus (LAL) se utiliza porque es un músculo delgado que proporciona una visualización fácil de la placa neuromuscular para empalamiento de microelectrodos en la placa motora. Este método permite la grabación de potenciales de placa miniatura espontáneos y corrientes (mEPPs y mEPCs), potenciales evocados del nervio tapa y corrientes (productos ambientalmente preferibles y EPC), así como las propiedades de la membrana de la placa motora. Resultados obtenidos de este método incluyen el contenido cuántico (QC), número de sitios de lanzamiento de vesícula (n), la probabilidad de liberación de la vesícula (prel), facilitación sináptica y depresión, así como la constante de tiempo de la membrana muscular (τ m) y la resistencia de entrada. Aplicación de esta técnica en modelos de ratón de la enfermedad humana puede destacar patologías fundamentales en Estados de enfermedad y ayudar a identificar estrategias de tratamiento novedosas. Por voltaje-sujeción totalmente una sola sinapsis, este método proporciona uno de los más detallados análisis de la transmisión sináptica actualmente disponible.
Introduction
Estudio de transmisión sináptica en la Unión neuromuscular proporciona penetraciones en la relación dinámica entre los sistemas nervioso y esqueléticos musculares y es un excelente modelo de examen de Fisiología sináptica. El levator auris longus (LAL) es un músculo delgado, que permite las uniones neuromusculares a visualizarse fácilmente. Informes anteriores han descrito la conveniencia de utilizar el LAL para examinar las toxinas y drogas sinápticas y han caracterizado a las características del tipo de fibra del músculo esquelético de la LAL1,2. Numerosos estudios han utilizado el LAL examinar fisiología neuromuscular3,4,5,6,7,8. De electrofisiología, la capacidad de observar fácilmente las ensambladuras neuromusculares LAL permite la colocación exacta de microelectrodos en la placa motora y reduce problemas de abrazadera de espacio en la grabación de la transmisión sináptica. Fácilmente se obtienen grabaciones de abrazadera de la corriente de las propiedades de la membrana muscular, como la constante de tiempo de la membrana (τm) y la resistencia de entrada (Ren). Además, estas propiedades pueden medirse desde las fibras musculares mismo utilizadas para grabar la transmisión neuromuscular, lo que permite una comparación directa de la función sináptica a las propiedades de la membrana muscular. Análisis de estos datos puede proporcionar ideas claves en los mecanismos físicos de muchas enfermedades neuromusculares y Estados de actividad alterada.
Un aspecto clave de la técnica descrita aquí es el uso de pinza de voltaje para grabaciones sinápticas, que no están sujetos a la no-linearidad en la abrazadera de la corriente y son independientes de las propiedades de la membrana muscular. Ventajas de usar la abrazadera de tensión frente a la pinza de corriente para examinar la transmisión neuromuscular se establecieron por el pionero de los esfuerzos en la década de 19509. Debajo de la abrazadera de la corriente, EPPs que superan los 10-15 mV en amplitud no son un producto lineal del mEPP amplitud9. Por ejemplo, si el mEPP promedio es de 1 mV, un EPP de 5 mV puede ser asumido para ser el producto de 5 mEPPs (control de calidad de 5); Considerando que un EPP de 40 mV será el producto de más de 40 mEPPs. Esta no linealidad en EPPs más grandes se produce porque la conducción de la fuerza para el PPE, que es la diferencia entre el potencial de membrana y potencial de equilibrio para el receptor de acetilcolina (~ -10 mV), disminuye substancialmente durante grandes EPPs. Este problema se evita en los experimentos de fijación de voltaje porque el potencial de membrana del músculo no cambia durante los experimentos de fijación de voltaje. Un inconveniente es que experimentos de fijación de voltaje son técnicamente más difíciles de completar que la grabación de la abrazadera de la corriente. Con esto en mente, McLachlan y Martin desarrollaron una corrección matemática sencilla que representa no linealidades en grabaciones de la abrazadera de la corriente de productos ambientalmente preferibles10. Las correcciones funcionan bien11,12,13, pero lo importante es asuman que las propiedades de membrana del músculo no han sido perturbadas.
Las propiedades de membrana del músculo son especialmente importantes para considerar si estudiando las condiciones o Estados de enfermedad que alteran el músculo. Por ejemplo, el músculo esquelético del modelo transgénico R6/2 de la enfermedad de Huntington es hyperexcitable debido a una reducción progresiva en el descanso cloruro y potasio corrientes14,15. Como consecuencia, mEPPs y EPPs se amplifican en el músculo esquelético R6/2. Sin duda, otros factores pueden alterar mEPPs y EPPs. Trabajar con un modelo diferente de ratones de la enfermedad de Huntington (R6/1) encontraron cambios en los productos ambientalmente preferibles que parecen estar relacionada con proteínas SNARE8. Evaluar los mecanismos que causan alteración de la transmisión neuromuscular, sería beneficioso para eliminar los efectos de propiedades de la membrana muscular alterado mediante el uso de una abrazadera de tensión. En un estudio reciente, la transmisión neuromuscular R6/2 se estudió en ambas condiciones de abrazadera de la corriente y la tensión utilizando la técnica descrita en este documento. La totalidad de las placas de extremo motor estaban sujeta a tensión a con menos de 1% de error colocando dos microelectrodos en la constante de longitud de la placa de extremo16. Fue demostrado abrazadera de tensión y corregir registros de corriente abrazadera rindió contrastantes las mediciones de la transmisión neuromuscular en el músculo de R6/2. Esto pone de relieve que puede ser difícil corregir productos ambientalmente preferibles de no linealidad si se han alterado las propiedades de la membrana muscular y demuestra los beneficios de obtener registros de pinza de voltaje que son independientes de las propiedades de la membrana muscular. El protocolo aquí presentado es ideal para examinar las condiciones o Estados de enfermedad que afectan la transmisión sináptica y las propiedades de la membrana postsináptica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animales todos los procedimientos fueron realizados según el cuidado Animal y uso Comité de Wright State University.
1. ratón eutanasia
- En una campana de humos, colocar el ratón en un cristal hermético anestesiar cámara.
- Exponga el ratón mediante la inhalación de una dosis letal de isoflurano (saturar o ~ 25%). Deje el ratón en la cámara hasta que no se observan respiración.
- Quite el ratón de la cámara y realizar una dislocación cervical como método secundario de la eutanasia.
2. retiro del pelo de la superficie Dorsal de la cabeza, cuello y espalda
- Use una afeitadora eléctrica para quitar la mayoría del pelo sobre la superficie dorsal de la cabeza, cuello y la parte trasera del ratón. También, eliminar el vello alrededor y en la oreja izquierda.
Nota: tenga cuidado al afeitarse la piel alrededor de los oídos, la piel puede engancharse en las cuchillas de la afeitadora y podría dañar el tejido muscular subyacente. - Aplicar Crema depilatoria con un hisopo de algodón en el área depilado para quitar el resto del cabello. Espere aproximadamente 1 minuto y aclarar la depilación crema con agua utilizando una botella de lavado del apretón, luego cepillar cualquier crema restante o el pelo utilizando un hisopo de algodón y acariciar la piel seca.
3. quitar la piel para exponer el músculo Levator Auris Longus
- Con un estéreo microscopio de disección, haga una pequeña incisión (solo profundidad suficiente para penetrar la piel) en la parte posterior del ratón a la altura de los omóplatos. Cortar la piel con unas tijeras de disección micro, siguiendo el camino que se muestra en la figura 1A-B.
- Con unas pinzas finas (por ejemplo, no. 5), tire de la piel a lo largo del corte cerca de los omóplatos. Usando las tijeras de la primavera, cortar el tejido de conectivo para separar la piel del tejido muscular subyacente mientras se aproxima el oído. Lo importante es cortar el tejido conectivo con las aspas apuntadas en la piel para evitar el corte accidental del tejido muscular expuesto.
- Periódicamente inundar el músculo expuesto con una solución de suero fisiológico, como el buffer externo siguiente de Na+ que se compone de (en mM): NaCl 144, 4 KCl 1.2 CaCl20,6 MgCl2, glucosa 5, 1 NaH2PO4, pH 7.4 con NaOH, y tiene una osmolalidad de 300 ± 5 mmol/kg. Una vez que el tejido conectivo se ha cortado para arriba en el oído izquierdo, cortar la piel alrededor de la oreja para retirar totalmente la piel del ratón y deséchela.
Nota: La LAL se fija a la base de la oreja y puede dañarse fácilmente al quitar la piel. Es bueno dejar alrededor de 1 mm de la piel alrededor de la base de la oreja para evitar cortar el LAL.
4. eliminación del músculo Levator Auris Longus y tejido circundante
- Usando las tijeras de la primavera, empezar por cortar los músculos que son inferiores a la LAL, que conectan a la columna entre los omóplatos. Comienzan en el omóplato derecho, justo a la derecha de la línea media y cortar hacia el extremo rostral del ratón, permaneciendo en el lado derecho de la línea media. Seguir cortando a través de todo el camino hasta el final del tejido muscular en el cráneo.
Nota: La LAL es el músculo más superficial conectado del lado medial de la oreja y la línea media, como se muestra en la figura 2. Para imágenes, un libro de Greene C.E.17 muestra imágenes excelentes, dibujado a mano de la LAL. - Utilice pinzas para agarrar el tejido cortado inmediatamente a la derecha de la línea media, luego levante suavemente y comenzar a cortar el tejido hacia el oído izquierdo con las cuchillas de las tijeras presionadas contra el cráneo para eliminar varias capas de músculo que son inferiores a la LAL izquierda. Dejar todas las capas que se une temporalmente para evitar cortar por accidente el LAL durante la extracción.
- Corte con cuchillas paralelas a y presionado contra el cráneo para evitar cortar el nervio que inerva el LAL, que envuelve el canal auditivo y entra en los músculos en el lado medial de la oreja. Continuar el corte a través del canal del oído, manteniendo tanto el nervio como sea posible.
Nota: El nervio que suministra la LAL ramas del nervio facial y debe conservarse como se utilizará más adelante en el procedimiento. - Cortar el tejido graso que está pasado el conducto auditivo externo por el mismo camino mostrado en la figura 1B en la porción ventrolateral de la oreja. También, cortar a lo largo de la escápula izquierda como se hizo en el lado derecho para quitar completamente el músculo de ratón.
5. aislamiento de músculo Levator Auris Longus
- Coloque la LAL y el tejido circundante, en un recipiente. Utilice un recipiente en el que diseca el tejido puede ser cubrió hasta el fondo, como una placa de Petri con un fondo de elastómero de silicona. Bañarse y lavar con frecuencia el tejido en una solución de suero fisiológico.
- Cortó la oreja del oído a lo largo de la base de la oreja, dejando la parte cartilaginosa de la oreja a la LAL. Tirón del músculo para que la parte inferior quede mirando hacia arriba (LAL en la parte inferior del plato).
- Coloque un pin, como un pin de insectos, a través del canal de oído para fijar la preparación. Entonces usando pequeños pernos, perno el tejido restante en el lado opuesto de la línea media de la LAL. Con unas pinzas, tire suavemente de la piel en la parte lateral de la oreja para estirar el músculo y coloque un alfiler pequeño a través de la piel. Repita este paso hasta que el tejido esté bien asegurado en el plato, como se muestra en la figura 3.
Nota: Alfileres de disección pequeño pueden hacerse cortando las puntas de agujas de acupuntura a la longitud deseada. Estos pernos pequeños minimizan el daño al tejido y se pueden utilizar con objetivos de microscopio de inmersión en agua con largas distancias de trabajo. - Comience quitando los músculos (se muestra en la figura 4), que están cubriendo la LAL (auricularis superior, abductor auris longus y interscutularis), y los enlazan a la LAL mediante tejido conectivo y están especialmente ajustados cerca de la línea media, con unas tijeras pinzas y muelle Nº 5.
- Utilizando las pinzas para tirar para arriba en la capa sobrepuesta de músculo, cortar el tejido fino conectivo con las láminas orientadas hacia la capa muscular se tira y tenga cuidado para evitar cortar o mellar el LAL. Corte hacia la línea media y dejar de corte a cerca de tres cuartos de la forma de la línea media. Luego, corte paralelo a la línea media para eliminar cada capa muscular. Seguir quitando capas musculares hasta que quede solamente el LAL.
- Eliminar algunos de los restantes tejidos que está cubriendo la LAL, que ayuda en el empalamiento de los electrodos. Utilice suavemente Nº 5 pinzas el tejido conectivo de la LAL y cortarlo lejos con unas tijeras de muelle. Sólo remover el tejido que se puede hacer tan fácilmente sin riesgo de dañar la LAL en el proceso. Retire cualquier grandes nervios que inervan las capas de músculo inferior restante en la superficie inferior de la LAL que pueda obstruir la visualización de las uniones neuromusculares.
6. aislamiento del nervio
- Identificar el nervio que inerva el LAL usando un estimulador del nervio (por ejemplo, dos alambres de platino conectado a un generador de pulso); habrá varios nervios que va desde el canal auditivo hasta los músculos. Tocar los nervios con el estimulador de nervio algunos la corriente (corriente variará alrededor de 5 V). Cuando el músculo se contrae, se ha identificado el nervio correcto.
- Agarra el tejido cerca del nervio y ayudarse con unas tijeras de muelle para separar el nervio del tejido que rodea la oreja. Para minimizar los daños, mantener la mayor parte del nervio en algún tejido circundante, que se utilizará más adelante para garantizar el nervio para el plato de grabación.
Nota: El nervio motor que inerva la LAL se encuentra en el lado medial del conducto auditivo de apertura. - Si se utiliza un electrodo de estimulación bipolar, retire el tejido circundante solamente alrededor de una región del nervio distal del músculo. Si se utiliza un electrodo de succión, retire el tejido circundante en el extremo cortado del nervio.
Nota: Este es un buen punto. Este es un buen punto. Si una rotura es necesario la preparación LAL disecada se puede mantener en una solución fisiológica o perfusión constante durante un par de horas para asegurar que no se acumulen metabolitos nocivos. Utilizar un gran volumen de perfusión solución o constante para garantizar que no se acumulen metabolitos perjudiciales. - A continuación, liberar y transferir el músculo a una cámara de perfusión para experimentos de electrofisiología bajo un microscopio compuesto vertical.
Nota: Uso una cámara de perfusión con un fondo suave para que el tejido puede ser firmemente clavado (figura 5A). - Pin el músculo en los extremos (oído y línea media) y el borde del músculo. Posición del nervio perpendicular a las fibras musculares y pin en la parte inferior del plato a través de un exceso de tejido que quedó intacto en el extremo del nervio. Mantener el tejido bañado en una solución de suero fisiológico en todo momento.
Nota: También es útil tenga redondeadas, elevada material directamente debajo de las fibras musculares LAL. Este apoyo adicional ayuda a empalamiento del electrodo y se puede hacer de una pequeña sección de elastómero de silicona en un tubo cónico de 50 mL, mintiendo en su lado. La sección redondeada del elastómero puede fijarse a la parte inferior de la cámara de perfusión utilizando una pequeña cantidad de silicona fresca. Figura 5B-Cse muestra un diagrama de la cámara de perfusión. Las fibras musculares pueden adherirse muy bien a nuevo elastómero de silicona de molde (que es muy hidrofóbico) y pueden resultar dañadas. Es útil para la capa o bloque recién molde de silicona con proteína, similar a la etapa de bloqueo en un immunoblot. Para bloquearlo, hemos incubamos nuevo molde de silicona en una solución concentrada de albúmina de suero bovino durante la noche.
7. instalación de equipo de electrofisiología
- Preparar o descongelar las alícuotas de un tinte para ayudar en la visualización de la placa neuromuscular, como el tinte mitocondrial 4-(4-diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium18, que es sensible a la luz y deben guardarse lejos de la luz. También, descongelar soluciones de electrodo. Vórtice todas alícuotas para garantizar que todos los solutos en solución. Preparar una solución de suero fisiológico que contiene 1 μm μ-Conotoxina GIIIB (μ-CTX) y 80 μm BTS (opcional).
- Asegure la cámara de perfusión con LAL a la platina del microscopio. Coloque el electrodo de referencia en una taza llenada de 3 M de KCl, que está conectado a la cámara de grabación a través de un puente de agar. Conectar el electrodo de referencia del amplificador según las instrucciones del fabricante.
- En este punto, coloque el electrodo de estimulación del nervio del nervio. Utilizar un electrodo de succión o un pequeño electrodo bipolar, ya que trabajan bien para la estimulación del nervio.
- Coloque el electrodo estimulante tan lejos el músculo como sea posible para reducir al mínimo el número de artefactos de estimulación en las grabaciones.
Nota: El electrodo estimulante debe ser controlado con una unidad de aislamiento del estímulo que puede controlar la amplitud de la tensión según sea necesario.
- Coloque el electrodo estimulante tan lejos el músculo como sea posible para reducir al mínimo el número de artefactos de estimulación en las grabaciones.
- Suba lentamente la tensión girando la perilla de tensión en la unidad de aislamiento del estímulo hasta que se observan contracciones. El punto en el que se observó por primera vez la contracción es el umbral. Una vez que se ha identificado el umbral, ajustar la tensión de la unidad de aislamiento del estímulo a 1.5 * umbral (o como se define en el experimento).
Nota: La figura 6 muestra la preparación de músculo bajo un microscopio vertical y el electrodo bipolar pequeño colocado sobre el nervio con un manipulador de la rótula. Es favorable tener la tensión más baja posible sin dejar de ser lo suficientemente por encima del umbral de estimulación. Una tensión de estímulo más baja reduce el número de artefactos de estimulación durante las grabaciones. También, colocar el electrodo estimulante de músculo disminuirá el tamaño del artefacto de estimulación. A veces se dañará el extremo del nervio de la disección, por lo que puede ser necesario experimentar con donde a lo largo del nervio debe ser colocado el estimulador. - Retirar la solución salina del baño y sustituir con 5 μm 4-Di-2-Asp. Exponer la preparación LAL a la 4-Di-2-Asp durante 10 min lograr la adecuada fluorescencia para una visualización de la placa neuromuscular (figura 7).
- Prepare dos soluciones de electrodo, 3 M KCl y una solución interna K+ compuesta por (en mM) 75 aspartato 5 MgCl2, 15 de CA (OH)2, 5 disódico ATP, disodio 5 fosfocreatina, glutatión 5, 20 MOPS, 30 EGTA, pH 7.2 con KOH.
Nota: Las soluciones se deben preparar con antelación; la solución interna de K+ se puede almacenar en alícuotas a-20 ° C. - Llene el vaso tirado capilar para el electrodo detector de tensión con 3 M KCl. utilizar la solución interna de K+ (preparado en paso 7.6) para el electrodo de corriente de paso; Use una aguja no metálica estrecha (~ 34 calibre) conectada a una jeringa de 1 mL para rellenar fácilmente los tubos capilares de vidrio. Golpee suavemente los tubos capilares para eliminar burbujas de aire; Asegúrese de que cada relleno electrodo tiene una resistencia de 10-15 MΩ.
Nota: Compruebe y tenga en cuenta la resistencia de ambos electrodos mediante el software de adquisición de datos. - Después de 10 min, intercambio de la solución 4-Di-Asp con la Ca2 + solución normal.
8. identificación de la placa neuromuscular mediante fluorescencia
- Con un microscopio vertical estándar de campo claro y fluorescencia iluminación, busque una banda brillante de las ensambladuras neuromusculares verdes fluorescentes perpendicular a las fibras musculares a lo largo de la preparación como se muestra en la Figura 7A. Utilice un objetivo de inmersión en agua de ampliación baja (~ 10 X) para identificar a las ensambladuras neuromusculares
Nota: El microscopio debe estar equipado con un cubo FITC (Ex: 480/40, Dichroic: 505LP, Em: 535/50) y un LED, láser, lámpara halógena o lámpara de mercurio por fluorescencia. Para minimizar la foto blanqueo, alternar iluminación de campo claro y fluorescencia.
Nota: Esta banda es generalmente más proximal a la base de la oreja que a la línea media. La banda es la región donde están más concentradas las uniones neuromusculares. - Cambiar a un objetivo de inmersión en agua mayor de ampliación (40 X) e identificar una placa neuromuscular en la capa superior del músculo a examinar con la electrofisiología (figura 7B).
- Asegure las pipetas rellenas en los soportes de la pipeta en el headstages apropiado, según las instrucciones del fabricante. Utilice micromanipuladores para colocar los electrodos encima de la membrana muscular dentro de 100 μm de la ensambladura neuromuscular identificada (figura 7). Coloque los electrodos utilizando principalmente microscopía de campo brillante; utiliza la fluorescencia para confirmar la ubicación de los electrodos con respecto a la Unión neuromuscular.
- En primer lugar, utilice un objetivo de bajo aumento (~ 10 X) para ubicar los electrodos y luego cambiar a un objetivo mayor de aumento (40 X) para el posicionamiento final de los electrodos. No atravesar los electrodos en el músculo en este punto, primero afinar los electrodos.
9. ajuste y empalar a los electrodos
- Una vez que los electrodos se colocan sobre la fibra deseada, cero y ajustar el electrodo detector de tensión, equilibrio de puente (o un enfoque análogo) y neutralizar la capacidad de electrodo por las instrucciones del fabricante. Cero, el electrodo de corriente de paso.
- Llevar ambos electrodos hasta la superficie de la fibra. Ajuste lentamente la posición de los electrodos en el camino hacia la fibra para que los electrodos queden orientados con respecto a la placa neuromuscular, como se describe en los pasos 8.3 y 8.4.
- Después de ambos electrodos se pone en contacto la superficie de la fibra muscular, atravesar primero el electrodo Romo de paso de corriente. Utilizar técnicas como buzz (pulsos breves de compensación de exceso de capacitancia), pulsos breves de corriente o golpeando suavemente la tabla para facilitar el empalamiento de electrodo.
- Monitorizar la señal con un osciloscopio o un protocolo de osciloscopio en el software de adquisición de datos, hasta que se identifica un potencial de membrana negativo, que indica que el electrodo ha sido empalado.
- Presione el electrodo detector de tensión más agudo en el músculo a nivel del electrodo corriente de paso empalado. Una vez que ambos electrodos están en línea con uno con el otro, atravesar el electrodo detector de tensión utilizando las mismas técnicas aplicadas con el electrodo de corriente de paso.
- Al empalamiento exitosa, utilizando el controlador para el amplificador, aplique una negativa constante celebración actual con el electrodo de pasar corriente para compensar cualquier daño de la membrana debido a empalamiento de electrodo. La célula empieza a cobrar lentamente hacia -80 mV, aumento de la explotación actual como necesarias para que la célula a la reclinación deseada potenciales (es decir, -80 a -85 mV).
Nota: Evitar la grabación de las fibras que requieren una participación más grande en valor absoluto que nA-25 en músculo de tipo salvaje para reducir al mínimo la posibilidad de grabación de fibras malsanas corriente. - Una vez que la fibra es estable durante un par de minutos en el potencial de reclinación deseada, proceda al registro de propiedades de la membrana muscular o transmisión neuromuscular.
10. registro de propiedades de la membrana postsináptica y transmisión sináptica
- Iniciar con las grabaciones de la abrazadera de la corriente mediante la aplicación de un número igual de pasos actuales positivos y negativos para medir las respuestas correspondientes de voltaje de la membrana, que se utilizará para determinar motora Ry el τ m. Para garantizar las propiedades pasivas, utilizar respuestas de pequeño voltaje que alcanzan un estado estacionario y tienen una relación lineal de corriente de voltaje16,19,20. Evitar la grabación de fibras con un nervio dañado o insalubre, estas fibras tienen una frecuencia de mEPP de > 3 Hz.
- A continuación, escriba dos electrodos abrazadera de tensión por las instrucciones del fabricante. Las fibras de la abrazadera de tensión a un potencial de membrana de -85 mV. Ajustes de tensión de la abrazadera deben alcanzar cocientes signal-to-noise que permiten la detección de mEPCs.
Nota: Mantener control del voltaje adecuado puede ser un problema. Utilizamos dos métodos para minimizar estos problemas. En primer lugar, las fibras se empalado dentro de 100 μm de la motora como se ha descrito anteriormente, que está dentro de la constante de longitud de estas fibras21. En segundo lugar, utilizamos la función de restore de CC del amplificador. Esta característica establece un aumento de la abrazadera de tensión muy alta. Nuestro trabajo anterior ha descrito este método en detalle y se describe un método para evaluar la placa con abrazadera de tensión de16. - Una vez en la abrazadera del voltaje, registrar las corrientes sinápticas (mEPCs y eEPCs) utilizando varios protocolos de estimulación nerviosa, basado en los requisitos del experimento.
- Registro mEPCs espontánea y EPCs utilizando un protocolo de estimulación de baja frecuencia del nervio (≤0. 5 Hz) que le permite a uno registro EPC sin modulación sináptica (facilitación o modulación) para evaluar contenido cuántico. Evaluar la facilitación sináptica o depresión, utilice un protocolo de estimulación nerviosa de alta frecuencia (pulsos de 10 a 50 Hz).
- Estimulan el nervio en la frecuencia deseada mediante una unidad de aislamiento del estímulo, que puede ser activada utilizando un generador de pulso que se controla mediante el software de adquisición de datos.
- Una vez terminadas las grabaciones de la abrazadera de tensión, devolver el amplificador a un ajuste de la abrazadera de la corriente, apague todas las corrientes y retire los electrodos de la fibra. Compruebe que los electrodos no se obstruyen o deriva en el voltaje de la línea de fondo durante la grabación.
Nota: Con respecto a la deriva, el voltaje del electrodo debe ser 0 voltios en la solución extracelular, como fueron instalados antes de empalamiento de fibra. Por ejemplo, los voltajes registrados sería inciertos si el voltaje se desvió durante el experimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 8 muestra un ejemplo de los pulsos corriente (figura 8A) y las respuestas de tensión (figura 8B) de una fibra LAL debajo de la abrazadera de la corriente de un tipo de salvaje de 12 semanas de edad ratón R6/2. La presencia de mEPPs indica que estos registros fueron tomados de la placa motora. Los registros se obtuvieron en solución salina fisiológica normal. Estos registros de abrazadera de la corriente pueden ser analizados para determinar los Ry el τ m eso fibra16,19,20.
Un registro representativo de un EPC y dos mEPCs, obtenidos bajo condiciones de tensión-abrazadera, se muestra en la Figura 9A. La breve desviación actual anterior a la EPC es el artefacto causado por estimulación del nervio. El análisis de mEPCs y EPCs puede hacerse más rápido con el software de detección de eventos. Esta herramienta permite al investigador hacer una plantilla que luego puede detectar automáticamente los eventos dentro de la grabación. Los eventos pueden ser superpuestos y exportarse a cualquier software de análisis de datos. Figura 9B muestra la EPCs y mEPCs (inserción) de una fibra representante superpuestas.
Figura 1 : Ubicación general de la del levator auris longus músculo
El músculo LAL se encuentra en la superficie dorsal de la cabeza. La línea punteada Roja destaca la ruta de la piel para el retiro en el dorsal (A) y lateral (B) superficie de corte. La LAL se conecta a la base de la oreja, así aproximadamente 1 mm de la piel alrededor de la base de la oreja debe permanecer intacto para evitar cortar el LAL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Expuestos del levator auris longus músculo
LAL (amarillo y verde) se encuentra justo debajo de la piel y es el músculo más superficial de la zona resaltada. Hay dos porciones del músculo, el craneal (amarillo) y caudal (verde). La región craneal emerge de la línea media en las cuatro primeras vértebras cervicales y corre hacia la parte anterior de la base de la aurícula. Para referencia, la línea media es una banda de tejido conectivo que se extiende desde los omóplatos (flecha blanca) hacia la nariz. El músculo LAL izquierdo y derecho Conecte a la línea media sobre el cráneo. La porción craneal de la LAL es mucho más ancha que la porción caudal. La porción caudal se fija cerca de la línea media en las cuarta y quinta cervicales vértebras y se conecta a la parte posterior de la base de la aurícula. Durante la disección, mantener unos milímetros de la piel alrededor de la oreja cartilaginosa para evitar cortar la LAL, que está marcado en la figura por una línea discontinua entre corchetes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Disección cruda de la del levator auris longus y el músculo circundante
Una vez extraída del animal, el tejido es anclado, dorsal hacia abajo (LAL en la parte inferior), en un plato de elastómeros forrado de silicona usando pernos finos hechos como se describe en la sección 5.3. Una vez asegurado en el fondo del plato, se pueden quitar las capas superiores del músculo. Un pin de insectos a través del canal de oído se indica con una flecha blanca punteada. Las flechas amarillas muestran la colocación de perno ideal para la eliminación de los músculos no deseados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Capa de músculo directamente inferior a la del levator auris longus
Resaltado en azul es el abductor auris longus (AAL), en rojo es la scupularis auricularis (AS) y en amarillo es el interscutularis (es). La LAL es el principal subyacente del músculo en esta imagen. Para referencia, el oído y la piel circundante está delineada por una línea negra sólida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Cámara de perfusión revestimiento de elastómero de silicona, de encargo
Se muestra el plato de medida 35 mm perfusión permite garantizar LAL para grabaciones electrofisiológicas (A). Elastómero de silicona se ha utilizado para crear una superficie conveniente para suspirando el tejido. En el centro de la cámara es una plataforma redonda que es útil cuando empalar a las fibras. La plataforma soporta las fibras del músculo de debajo cuando aplicando una fuerza hacia abajo con los electrodos durante el empalamiento de proceso. Esta plataforma fue formada por permitir elastómero de silicón para formar la curva de un tubo cónico de 50 mL. Una rebanada de este redondo silicona elastómero puede luego pegar a la parte inferior de la cámara con elastómero de silicona más. Una representación contorneada del plato así como una vista de lado se muestran en B y C en la cámara de perfusión puede verse más claramente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Electrofisiología experimentar configuración
Un pequeño electrodo bipolar se sostiene en lugar con un manipulador giratorio magnético para estimular el nervio de la LAL. La platina del microscopio es posible mantener fácilmente una plataforma magnética con el uso de un material magnético adhesivo (como puede encontrarse en un arte o ferretería para hacer imanes de nevera). También se muestran los electrodos colocados sobre una muestra LAL y headstages. Instrumento importante es la inmersión en agua, objetivo biselado con un cono cerámico que, como se muestra. El extremo biselado permite la fácil colocación del electrodo y el material cerámico minimiza ruido eléctrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Identificación de la placa neuromuscular
Todas las imágenes muestran la LAL con 5 μm 4-Di-2-Asp (verde) para permitir la visualización de las ensambladuras neuromusculares. Banda brillante (A) A de ensambladuras neuromusculares puede ser vistas (flechas amarillas) al visualizar el músculo a través de un objetivo de X 10. Axones ramificados también pueden verse como se indica por la flecha blanca punteada. (B) pequeño confocales pilas (5 x 1 μm) de tres ensambladuras neuromusculares (flechas amarillas). Fibras musculares sanas tienen estriaciones claras y petequiales múltiples que aparecen como manchas oscuras a lo largo del sarcolema de la fibra (flechas blancas). A menudo se observan también los axones inervan a las uniones neuromusculares. (C) A la fibra con una teñido de la ensambladura neuromuscular que es empalada con electrodos de vidrio. Los electrodos se han mejorado con un toque de blanco para que pueda ver más fácilmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8 : Pinza corriente de registro de propiedades de la membrana
Pulsos corriente inyectadas (A) y la membrana resultante (B) de posibles respuestas grabadas desde una fibra de la LAL bañado en solución salina fisiológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9 : Grabaciones de pinza de voltaje de dos electrodos
Un rastro crudo de un EPC y dos mEPCs grabados en voltaje de dos electrodos-abrazadera (A). Superpuestas EPCs y mEPCs (inserción) de una sola fibra (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Se describe aquí es la preparación y uso del ratón muscular LAL para la medición de la transmisión neuromuscular en condiciones de fijación de corriente o voltaje. Hay varios puntos importantes a considerar para la disección de la LAL. Limpieza excesiva del tejido conectivo de las ayudas de músculo en empalamiento del electrodo, como los electrodos puede conseguir el tejido conectivo al posicionamiento de empalamiento. Sin embargo, sólo quitar el tejido fino conectivo eso se puede quitar fácilmente para limitar las posibilidades de dañar el músculo. El aislamiento del nervio se debe realizar con cuidado porque es muy delicado. Para evitar el daño del nervio, es útil dejar parte de los tejidos circundantes atado al extremo del nervio a través del cual se puede colocar un perno para fijar el nervio al plato. También, tenga cuidado de no para aplastar el nervio cuando se coloca el estimulador del nervio. Por último, es importante el orden en el que los electrodos se empalado en la fibra. El electrodo Romo no es tan fácil para empalar y primero debe ser empalado. Si el electrodo agudo fueron empalado en primer lugar, el electrodo Romo podría empujar a la fibra muscular hacia abajo antes de que atraviese la membrana, causando posiblemente el electrodo fuerte salir de la fibra. Esto haría necesario para atravesar la fibra una segunda vez con el electrodo agudo que pueda causar daño innecesario de la membrana. También es útil que el amplificador se utiliza puede medir simultáneamente la corriente y voltaje del electrodo corriente de paso por lo que se observa una deflexión negativa en el potencial de membrana, lo que indica que el electrodo ha sido empalado.
Una característica de la LAL que puede ser beneficioso es la capacidad de eliminar ambos músculos simultáneamente. Esto puede ser ideal para realizar experimentos de electrofisiología y biología molecular en el mismo animal. Esto puede lograrse siguiendo esencialmente el mismo protocolo descrito aquí con pequeños cambios. Siga todos los pasos en las rúbricas 1-3 todo lo descrito en la parte derecha como la izquierda haciendo. En el paso 4, es mejor empezar a cortar en la parte ventrolateral de la oreja derecha para quitar los músculos. Como se describió anteriormente, mantenga siempre las cuchillas presionadas contra el cráneo para cortar tan profundamente como sea posible dejando los músculos inferiores a la LAL. Continuar corte hacia la oreja derecha más allá de la línea media, manteniendo la hoja tan profundamente como sea posible. En este punto, el resto del procedimiento es como se describe en el presente Protocolo, sólo realice los pasos restantes en ambos músculos. Una vez que los músculos han sido limpiados, se puede cortar un LAL lejos y congelados para posterior análisis molecular y el otro puede ser utilizado para electrofisiología. Sería difícil realizar estudios de electrofisiología con ambos músculos del animal mismo. Para ello, la línea media se debe cortar para separar los músculos y hacer probablemente dañará algunas fibras musculares.
La LAL ha sido utilizada para examinar la transmisión neuromuscular debido a su naturaleza fina permite la fácil identificación de placas motor y excelente ex vivo de la perfusión en1,3,4,5 ,6,7,8. Además del uso de 4-di-2-asp, otros grupos han utilizado Bungarotoxina rhodamin conjugado en concentraciones bajas22. Hemos utilizado la LAL para exámenes electrofisiológicos, señalización purinérgica y defectos en la enfermedad de Huntington16,20. La LAL también es ideal para estudios de imágenes de células vivas. Por ejemplo, varios estudios han utilizado el LAL para medir vesícula sináptica liberación y absorción23,24. Esto puede hacerse usando tintes, tales como FM 1-43.
Porque las placas de extremo se pueden observar fácilmente con un colorante fluorescente, los electrodos pueden colocarse en las proximidades de la placa motora dentro de la constante de longitud de la fibra muscular. Colocación del electrodo en la tapa y el uso de un sistema de pinza de voltaje de dos electrodos de alto cumplimiento permite a los investigadores controlar totalmente la placa de extremo potencial con menos de 1% error16. Esto puede ser importante porque no tienen en cuenta las correcciones utilizadas para no lineal suma de potenciales sinápticos registrados bajo condiciones de corriente abrazadera10 cambios en la membrana postsináptica causada por condiciones experimentales o Estado de la enfermedad. Por ejemplo, menor descanso endplate conductancias amplificará potenciales postsinápticos19, incluso aquellos corregido para la suma no-lineal. Por el contrario, corrientes postsynaptic afianzado con abrazadera de tensión no están sujetos a errores de suma no lineales y son independientes de las propiedades de la membrana postsináptica. Demostrar esto, hemos demostrado recientemente resultados contrastantes de potenciales de placa terminal en comparación con las corrientes registradas de la enfermedad de Huntington hiper excitable músculo esquelético16.
Una ventaja final de usar la LAL para el estudio de transmisión neuromuscular es que las grabaciones son de una sola sinapsis. Transmisión neuromuscular grabada desde una sola, completamente fijada por el voltaje de la placa proporciona algunos de los datos más detallados y precisos en la transmisión sináptica disponible actualmente, que es ideal para modelar y desentrañar la complejidad de synaptic Fisiología.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Dr. Mark M. Rich y Daniel Miranda comentarios editoriales, Ahmad Khedraki para ayudar a establecer esta técnica y la Universidad Estatal de Wright para apoyo financiero (fondos de arranque a A.A.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. The anatomy of the rat. , Hafner Pub. (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. Electric current flow in excitable cells. , Clarendon Press. (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
