Summary
Het protocol beschreven in dit document maakt gebruik van de muis Musculus levator auris longus (LAL) spier graag spontane, zenuw-opgeroepen postsynaptisch potentieel (current-clamp) en stromingen (spanning-klem) op de motorische eindplaat. Gebruik van deze techniek kan belangrijke inzicht verwerven in de mechanismen van synaptische transmissie onder normale en zieke voorwaarden.
Abstract
Dit protocol beschrijft een techniek naar record synaptische transmissie van de motorische eindplaat current-clamp en spanning-clamp voorwaarden. Een ex vivo -voorbereiding van de Musculus levator auris longus (LAL) wordt gebruikt omdat het is een dunne spier die gemakkelijke visualisatie van de motorische eindplaat micro-elektrode Spietsing op de motorische eindplaat voorziet. Deze methode zorgt voor de opname van de spontane miniatuur eindplaat potentials en stromingen (mEPPs en mEPCs), eindplaat zenuw-evoked potentials en stromingen (EPPs en Spoon), evenals de eigenschappen van de membraan van de motorische eindplaat. Deze methode verkregen resultaten omvatten de quantal inhoud (QC), aantal vesikel release sites (n), de waarschijnlijkheid van het vesikel release (prel), synaptic versoepeling en depressie, evenals de tijdconstante van de spier-membraan (τ m) en de inbreng van de weerstand. Toepassing van deze techniek te Muismodellen van ziekten bij de mens kan markeren belangrijkste pathologieën in ziekte staten en helpen bij het identificeren van de roman behandelingsstrategieën. Deze methode biedt door volledig spanning-klemmen een enkele SYNAPS, een van de meest gedetailleerde analyses van de synaptische transmissie momenteel beschikbaar.
Introduction
Bestuderen van synaptische transmissie op de motorische eindplaat biedt inzichten in de dynamische relatie tussen de gespierde nerveus en skelet-systemen en is een uitstekend model voor de behandeling van synaptic fysiologie. De Musculus levator auris longus (LAL) is een dunne spier, waardoor de neuromusculaire kruispunten te gemakkelijk worden gevisualiseerd. Eerdere verslagen hebben omschreven het gemak van het gebruik van de LAL synaptic drugs en toxine te onderzoeken en het skelet spiervezel type Eigenschappenvan de LAL1,2hebben gekenmerkt. Talrijke studies hebben de LAL gebruikt om te onderzoeken van de neuromusculaire fysiologie3,4,5,6,7,8. Voor electrofysiologie, de mogelijkheid om eenvoudig observeren LAL neuromusculaire kruispunten voorziet in de nauwkeurige plaatsing van microelectrodes in de motorische eindplaat en sterk vermindert ruimte klem kwesties in de opname van de synaptische transmissie. Current-clamp opnames van de spier membraan eigenschappen, zoals de membraan tijdconstante (τm) en de input weerstand (Rin) zijn gemakkelijk verkregen. Bovendien kunnen deze eigenschappen worden gemeten vanaf de dezelfde spiervezels gebruikt voor de registratie van de neuromusculaire transmissie, waardoor een directe vergelijking van synaptische functie aan de eigenschappen van de spier-membraan. Analyse van deze gegevens kan belangrijke inzicht verwerven in de fysische mechanismen van veel neuromusculaire ziekten en Staten van gewijzigde activiteit.
Een belangrijk aspect van de hier beschreven techniek is het gebruik van spanning-clamp voor synaptic opnamen, die zijn niet onderworpen aan de niet-lineariteiten ondervonden in current-clamp en zijn onafhankelijk van de eigenschappen van de spier-membraan. Voordelen van het gebruik in tegenstelling tot huidige-klem-spanning-klem te onderzoeken van de neuromusculaire transmissie zijn vastgesteld door de baanbrekende inspanningen in de jaren 1950-9. Onder huidige-clamp zijn EPPs die hoger zijn dan 10-15 mV in amplitude niet een lineaire product van de waterwerkgroep amplitude9. Bijvoorbeeld, als de gemiddelde waterwerkgroep is 1 mV, een EVP van 5 mV kan worden aangenomen dat het product van 5 mEPPs (QC 5); Overwegende dat een EVP van 40 mV zullen het product van meer dan 40 mEPPs. Deze niet-lineariteit op grotere EPPs treedt op omdat de drijvende kracht voor het EPP-programma, dat is het verschil tussen de membraanpotentiaal en evenwicht potentieel voor de acetylcholine receptor (~ -10 mV), aanzienlijk verlaagt tijdens grote EPPs. Dit probleem is in spanning-clamp experimenten vermeden omdat de membraanpotentiaal spier niet tijdens spanning-clamp experimenten verandert. Een nadeel is dat spanning-clamp experimenten technisch moeilijker zijn te voltooien dan current-clamp opname. Met dit in gedachten ontwikkeld McLachlan en Martin een eenvoudige wiskundige correctie die goed is voor niet-lineariteiten in current-clamp opnames van EPPs10. De correcties werken goed11,12,13, maar nog belangrijker is, veronderstellen dat de spier membraan eigenschappen hebben niet verstoord.
De spier membraan eigenschappen zijn met name belangrijk om te overwegen als studeren voorwaarden of ziekte staten die verstoren van de spier. Skeletspieren van de R6/2 transgene model van de ziekte van Huntington is bijvoorbeeld hyperexcitable als gevolg van een geleidelijke vermindering in de rust chloride en kalium stromingen14,15. Dientengevolge, worden mEPPs en EPPs versterkt in de skeletspieren R6/2. Bijkomende factoren kunnen zeker, mEPPs en EPPs wijzigen. Werken met een ander model van de ziekte van Huntington muizen (R6/1) wijzigingen in EPPs dat leek te worden gerelateerd aan SNARE-eiwitten8gevonden. Om te beoordelen de mechanismen waardoor veranderde neuromusculaire transmissie, zou het zinvol zijn om te elimineren van de effecten van de eigenschappen van de membraan van de gewijzigde spier met behulp van een spanning-klem. In een recente studie, werd de R6/2 neuromusculaire transmissie bestudeerd onder beide stroom en spanning-kogelklem voorwaarden hierin met behulp van de techniek beschreven. Het geheel van de motor endplates waren spanning-geklemd met minder dan 1% fout door het plaatsen van twee microelectrodes binnen de constante van de lengte van de eindplaat16. Het bleek dat spanning-clamp en current-clamp records opgeleverd contrasterende metingen van neuromusculaire transmissie in R6/2 spier gecorrigeerd. Dit benadrukt dat het wellicht moeilijk te corrigeren EPPs voor niet-lineariteiten als de spier membraan eigenschappen zijn gewijzigd en toont de voordelen van het verkrijgen van de spanning-clamp records die onafhankelijk van de eigenschappen van de spier-membraan zijn. Het protocol gepresenteerd hierin is ideaal voor de behandeling van de voorwaarden of ziekte staten die invloed hebben op de synaptische transmissie en de eigenschappen van het postsynaptisch membraan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de Animal Care and gebruik Comité van Wright State University.
1. muis euthanasie
- In een zuurkast, plaatst u de muisaanwijzer in een luchtdichte glas anesthetizing kamer.
- Bloot de muis via inademing aan een dodelijke dosis van Isofluraan (verzadigen, of ~ 25%). Laat de muis in de kamer totdat geen ademhaling kan worden waargenomen.
- Verwijder de muis uit de zaal en vervullen van een cervicale dislocatie als een secundaire methode voor euthanasie.
2. verwijdering van het haar van de dorsale oppervlak van hoofd, nek en rug
- Gebruik een elektrisch scheerapparaat te verwijderen van de meerderheid van de haren op het dorsale oppervlak van het hoofd, nek, en achterkant van de muis. Ook het verwijderen van de haren rond en op de linker oor.
Opmerking: Wees voorzichtig bij het scheren van de huid rond de oren, de huid kan verstrikt raken in de bladen van het scheerapparaat en onderliggende spierweefsel kan beschadigen. - Hair removal cream met een wattenstaafje van toepassing op de geschoren gebied te verwijderen van de resterende haren. Wacht ongeveer 1 minuut en de ontharing crème spoelen met water met behulp van een squeeze wassen fles, dan borstel weg elke resterende room of haar met behulp van een wattenstaafje en DEP de huid droog.
3. Verwijder Skin om te bloot van de musculus Levator Auris Longus
- Onder een stereomicroscoop ontleden, maken een kleine snede (gewoon diep genoeg om te penetreren van de huid) op de achterkant van de muis op het niveau van de scapulae Snijd de huid met behulp van micro dissectie schaar, na het pad getoond in figuur 1A-B.
- Met behulp van fijne pincet (zoals nr. 5), trek de huid langs de snede in de buurt van de scapulae. Met behulp van voorjaar schaar, knip het bindweefsel te scheiden van de huid van de onderliggende spierweefsel terwijl het naderen van het oor. Nog belangrijker is, snijd het bindweefsel met de bladen wees in de huid om te voorkomen dat per ongeluk snijden van de blootgestelde spierweefsel.
- Periodiek perfuse de blootgestelde spier met een fysiologische zoutoplossing-oplossing, zoals de volgende nb+ externe buffer die uit (in mM bestaat): 144 NaCl, 4 KCl 1.2 CaCl2, 0.6 MgCl2, 5 glucose, 1 NaH2PO4, pH 7.4 met NaOH, en heeft een osmolaliteit van 300 ± 5 mmol/kg. Zodra het bindweefsel heeft verlaagd tot aan de linker oor, snijd de huid rond het oor volledig verwijderen van de huid van de muis te verwijderen.
Opmerking: De LAL hecht aan de basis van het oor en kan gemakkelijk worden beschadigd tijdens het verwijderen van de huid. Het is goed om te vertrekken rond 1 mm van de huid rond de basis van het oor om te voorkomen dat de LAL snijden.
4. verwijdering van de spieren van de Musculus Levator Auris Longus en omliggende weefsel
- Start met behulp van voorjaar schaar door snijden spieren die zijn inferieur aan de LAL, die op de wervelkolom tussen de scapulae aansluit. Beginnen bij het juiste schouderblad, net aan de rechterkant van de middellijn, en snijd aan de rostraal einde van de muis, terwijl de resterende aan de rechterkant van de middellijn. Blijven snijden helemaal door tot het einde van het spierweefsel op de schedel.
Opmerking: De LAL is de meest oppervlakkige spier aangesloten op de mediale kant van het oor en de middellijn, zoals weergegeven in Figuur 2. Voor extra afbeeldingen toont een boek door E.C. Greene17 uitstekend, handgetekende afbeeldingen van de LAL. - Pincet gebruiken om te grijpen het gesneden weefsel onmiddellijk aan de rechterkant van de middellijn, dan zachtjes heffen en beginnen met de bladen van de schaar drukte tegen de schedel te verwijderen van de verschillende lagen van spier die inferieur aan de linker LAL zijn het weefsel naar het linker oor af te snijden. Laat alle lagen gehecht tijdelijk om te voorkomen dat per ongeluk de LAL snijden tijdens het verwijderen.
- Snijden met messen parallel aan en drukte tegen de schedel om te voorkomen dat het snijden van de zenuw die de LAL, die wraps rond het oor kanaal bevordert, en verschijnt ook de spieren aan de mediale zijde van het oor. Doorsnijden de gehoorgang, houden zoveel van de zenuw verbonden mogelijk blijven.
Opmerking: De zenuw die de LAL levert takken af van de nervus facialis en moet worden bewaard als het later in de procedure zal worden gebruikt. - Snijd het vetweefsel dat is net voorbij de gehoorgang langs hetzelfde pad weergegeven in figuur 1B op het ventrolateral gedeelte van het oor. Ook snijdt langs de linker schouderblad zoals werd gedaan aan de rechterkant de spier om volledig te verwijderen van de muis.
5. Musculus levator Auris Longus spier isolatie
- Plaats de LAL, en het omliggende weefsel, in een container. Gebruik een container waarin de ontleed weefsel kan worden gespeld aan de onderkant, zoals een petrischaal met een silicone-elastomeer bodem. Baden en wassen vaak het weefsel in een fysiologische zoutoplossing oplossing.
- De pinna voor het oor langs de basis van het oor afgesneden, verlaten de kraakbeenachtige gedeelte van het oor gehecht aan de LAL. Flip de spier zodat de inferieure kant (LAL op de bodem van de schotel) boven ligt.
- Plaats een pin, zoals een insect Pins, via het oor kanaal naar de voorbereiding op zijn plaats houden. Dan gebruikt kleinere pinnen, pin het resterende weefsel aan de andere kant van de middellijn van de LAL. Met behulp van Tang, Trek voorzichtig de huid op het laterale gedeelte van het oor het strekken van de spier te plaatsen van een speld door de huid. Herhaal deze stap totdat het weefsel goed beveiligd om de schotel, is zoals afgebeeld in Figuur 3.
Opmerking: Kleine dissectie pinnen kunnen worden gemaakt door het snijden van de tips van acupunctuurnaalden op de gewenste lengte. Deze kleine pinnen minimaliseren van schade aan het weefsel en kunnen worden gebruikt met water-onderdompeling Microscoop doelstellingen met lang werkende afstanden. - Begin het verwijderen van de spieren (afgebeeld in Figuur 4), dat zijn die betrekking hebben op de LAL (auricularis superieure, abductor auris longus, en de interscutularis), en die gebonden aan de LAL via bindweefsel en zijn vooral strak in de buurt van de middellijn, met behulp van No. 5 pincet en voorjaar schaar.
- Met behulp van de verlostang om te trekken op de bovenliggende laag van de spier, gesneden van het bindweefsel met de bladen die zijn gericht op de laag van de spier wordt getrokken en verzorgen om te voorkomen dat snijden of de LAL plukt. Knip richting de middellijn en stoppen met het snijden van ongeveer drie kwart van de weg naar de middellijn. Knip dan, evenwijdig aan de middellijn elke spier laag verwijderen. Houd het verwijderen van spier lagen totdat alleen de LAL blijft.
- Verwijder enkele van de resterende bindweefsel die bedekt de LAL, die bij Spietsing van de elektroden helpt. Voorzichtig gebruik No. 5 pincet te trekken het bindweefsel van de LAL en weg met behulp van voorjaar schaar te knippen. Alleen het verwijderen van weefsel dat zo gemakkelijk kan worden gedaan zonder risico op beschadiging van de LAL in het proces. Verwijder alle grote zenuwen die innervate de musculus inferior lagen nog op de inferieure oppervlak van de LAL die de visualisatie van de neuromusculaire kruispunten kan belemmeren.
6. isolatie van de zenuw
- Identificeren van de zenuw die bevordert de LAL met behulp van een zenuw stimulator (bijvoorbeeld twee platina draden verbonden met een puls generator); Er zullen verschillende zenuwen die van de gehoorgang naar de spieren lopen. De zenuwen raken met de stimulator van de zenuw leveren sommige huidige (huidige hangt rond 5 V). Wanneer de spier contracten, heeft de juiste zenuw geïdentificeerd.
- Zorgvuldig pak het weefsel in de buurt van de zenuw en voorjaar schaar gebruiken om te scheiden van de zenuw van het weefsel rondom het oor. Om te minimaliseren van de schade, houden de meeste van de zenuw ingebed in enkele omliggende weefsel, die later worden gebruikt voor het beveiligen van de zenuw naar de opname schotel.
Opmerking: De motorische zenuw die de LAL bevordert bevindt zich aan de mediale zijde van de gehoorgang openen. - Als met behulp van een bipolaire stimulerende elektrode, verwijdert u het omringende weefsel alleen rond een regio van de zenuw, distale van de spier. Als met behulp van een zuignap elektrode, verwijdert u omringende weefsel gesneden eind van de zenuw.
Opmerking: Dit is een goede stopplaats. Dit is een goede stopplaats. Als een pauze is nodig de prep LAL ontleed kan worden gehandhaafd in een fysiologische oplossing of constante perfusie voor een paar uur om ervoor te zorgen dat schadelijke metabolieten niet doen accumuleren. Een grote hoeveelheid oplossing of constante perfusie gebruiken om ervoor te zorgen dat schadelijke metabolieten niet doen accumuleren. - Vervolgens losmaken en de spier overbrengen in een kamer van de perfusie voor electrofysiologie experimenten onder een rechtop samengestelde microscoop.
Opmerking: Gebruik een perfusie-kamer met een zachte bodem waarnaar het weefsel veilig worden kan vastgemaakt (figuur 5A). - PIN de spier aan de uiteinden (oor en middellijn) en langs de rand van de spier. Plaats de zenuw loodrecht op de spiervezels en het aan de onderkant van de schotel via sommige overtollige weefsel dat bleef intact aan het einde van de zenuw te spelden. Houd het weefsel badend in een fysiologische zoutoplossing oplossing te allen tijde.
Opmerking: Het is ook handig om te hebben afgerond, verhoogde materiaal direct onder de LAL spiervezels. Deze extra steun helpt bij elektrode Spietsing en kan worden gemaakt van een klein deel van silicone-elastomeer gegoten in een conische tube van 50 mL, liggend op zijn kant. De afgeronde gedeelte van de elastomeer kan worden beveiligd aan de bodem van de kamer van de perfusie met behulp van een kleine hoeveelheid vers siliconen. Een diagram van de perfusie-kamer is afgebeeld in figuur 5B-C. De spiervezels kunnen zeer strak houden aan nieuw silicone-elastomeer in cast (die zeer hydrofobe) en beschadigd raken. Het is nuttig om jas of blok nieuw gegoten silicone met eiwit, vergelijkbaar met de blokkerende stap in een immunoblot. Als u wilt blokkeren, hebben we geïncubeerd nieuw gegoten siliconen in een geconcentreerde oplossing van bovien serumalbumine 's nachts.
7. electrofysiologie apparatuur Setup
- Bereiden of ontdooien aliquots van een kleurstof om te helpen bij het visualiseren van de motorische eindplaat, zoals de mitochondriale kleurstof 4-(4-diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium18, die is lichtgevoelig en buiten licht moet worden bewaard. Ook, ontdooi elektrode oplossingen. Vortex alle aliquots om ervoor te zorgen dat alle opgeloste stoffen in oplossing. Bereid een fysiologische zoutoplossing-oplossing met 1 µM µ-Conotoxin GIIIB (µ-CTX) en 80 µM BTS (optioneel).
- Beveilig de perfusie-zaal met de LAL naar de Microscoop fase. Plaats de referentie-elektrode in een beker gevuld met 3 M KCl, die is aangesloten op de kamer van de opname via een agar-brug. De referentie-elektrode verbinden met de versterker per de instructies van de fabrikant.
- Op dit punt, plaatst u de zenuw-stimuleren elektrode op de zenuw. Een zuig-elektrode of een kleine bipolaire elektrode, gebruiken als ze goed voor zenuwstimulatie werken.
- Plaats de stimulerende elektrode zo ver van de spier mogelijk tot een minimum beperken van het aantal stimulatie artefacten in de opnames.
Opmerking: De stimulerende elektrode moet met een stimulans isolatieinrichting waarmee de amplitude van de spanning zo nodig kan worden gecontroleerd.
- Plaats de stimulerende elektrode zo ver van de spier mogelijk tot een minimum beperken van het aantal stimulatie artefacten in de opnames.
- Langzaam de spanning te verhogen door te draaien aan de knop spanning op de isolatieinrichting stimulans tot contracties in acht worden genomen. Het punt waarop de samentrekking voor het eerst is waargenomen is de drempel. Zodra de drempel is geconstateerd, vastgesteldop de spanning op de isolatieinrichting stimulans 1.5 * drempel (of zoals gedefinieerd door het experiment).
Opmerking: Figuur 6 toont de spier prep ingestelde een rechtop Microscoop en de kleine bipolaire elektrode geplaatst op de zenuw met behulp van een kogelgewricht manipulator. Het is gunstig voor de laagste spanning voor stimulatie mogelijk terwijl nog steeds voldoende boven de drempel hebben. Een lagere stimulans spanning vermindert het aantal stimulatie artefacten tijdens opnames. Ook, de stimulerende elektrode uit de buurt van de spier te plaatsen, zal de grootte van de stimulatie artefact afnemen. Soms zal het einde van de zenuw worden beschadigd uit de dissectie, zodat kan het nodig zijn om te experimenteren met waar langs de zenuw de stimulator moet worden geplaatst. - Verwijder de zwemwater-zoutoplossing en vervang met 5 µM 4-Di-2-Asp. Bloot de LAL prep naar de 4-Di-2-Asp voor 10 min om voldoende fluorescentie voor visualisatie van de motorische eindplaat (Figuur 7).
- Twee oplossingen van de elektrode, 3 M KCl en een interne oplossing van K+ , bestaande uit (in mM) 75 aspartaat 5 MgCl2, 15 Ca(OH)2, 5 ATP Dinatrium, Dinatrium 5 phosphocreatine, 5 glutathion, 20 MOPS, 30 EGTA, pH 7,2 met KOH voor te bereiden.
Opmerking: De oplossingen moeten worden voorbereid; de interne K+ -oplossing kan worden opgeslagen in aliquots bij-20 ° C. - Vul de getrokken glazen capillaire voor de spanning detecterende elektrode met 3 M KCl. de interne oplossing van K+ (bereid in stap 7.6) worden gebruikt voor de huidige doorgeven elektrode; Gebruik een smalle naald (~ 34 meter) gekoppeld aan een 1 mL spuit om de haarvaten glas gemakkelijk te vullen. Tik zachtjes op de haarvaten Schakel luchtbellen; Zorg ervoor dat elke gevulde elektrode een weerstand van 10-15 MΩ heeft.
Opmerking: Controleer en noteer de weerstand van beide elektroden met behulp van de software van de overname van de gegevens. - Wisselen na 10 min, de 4-Di-Asp-oplossing met de normale Ca2 + oplossing.
8. identificatie van de motorische eindplaat met behulp van fluorescentie
- Een rechtop Microscoop met helder-standaardveldfilters en fluorescentie verlichting gebruikt, zoekt u een heldere band van fluorescente groene neuromusculaire kruispunten loodrecht op de spiervezels langs de prep zoals weergegeven in figuur 7Auitgevoerd. Gebruiken van een lage vergroting water-onderdompeling doelstelling (~ 10 X) voor het identificeren van de neuromusculaire kruispunten
Opmerking: De Microscoop moet worden uitgerust met een FITC-kubus (Ex: 480/40, Dichroic: 505LP, Em: 535/50), en een LED, laser, halogeenlamp of kwik lamp voor fluorescentie. U wilt minimaliseren foto bleken, afwisselend heldere-veld en fluorescentie verlichting.
Opmerking: Deze band is meestal meer proximale aan de basis van het oor dan aan de middellijn. De band is de regio waar de neuromusculaire kruispunten meest geconcentreerde zijn. - Schakel over naar een hogere vergroting water-onderdompeling doelstelling (~ 40 X) en identificeren van een motorische eindplaat in de bovenste laag van de spier met elektrofysiologie (figuur 7B) te bestuderen.
- Beveilig de gevulde pipetten in de houders van de pipet op de juiste headstages, per de instructies van de fabrikant. Gebruik micromanipulators om de positie van de elektroden boven de spier membraan binnen 100 µm van de geïdentificeerde motorische eindplaat (Figuur 7 c). Positie van de elektroden met behulp van voornamelijk lichte-veld microscopie; Gebruik de fluorescentie te bevestigen van de locatie van de elektroden ten opzichte van de motorische eindplaat.
- Gebruik eerst de doelstelling van een lage vergroting (~ 10 X) om te zoeken van de elektroden en vervolgens overschakelt naar een hogere doelstelling van vergroting (~ 40 X) voor de definitieve plaatsing van de elektroden. Impale de elektroden in de spier op dit punt niet, eerst het afstemmen van de elektroden.
9. tuning en spietsen de elektroden
- Zodra de elektroden zijn gepositioneerd boven de gewenste vezel, nul en afstemmen van de spanning-sensing elektrode door brug in evenwicht brengen (of een soortgelijke benadering) en de capaciteit van de elektrode per de instructies van de fabrikant te neutraliseren. Ook nul de huidige doorgeven-elektrode.
- Brengen beide elektroden aan het oppervlak van de vezel. Langzaam de positie van de elektroden op de weg naar de vezel zodanig aanpassen dat de elektroden gericht ten aanzien van de motorische eindplaat blijven, zoals beschreven in stap 8.3 en 8.4.
- Nadat beide elektroden hebben contact opgenomen met het oppervlak van de spiervezel, impale eerst de botte huidige-passing-elektrode. Technieken zoals buzz (korte pulsen van overtollige capaciteit compensatie), korte huidige pulsen of zachtjes te tikken op de tabel gebruiken om elektrode Spietsing.
- Monitor het signaal, met behulp van een oscilloscoop of oscilloscoop protocol in de data acquisitie software, totdat een negatieve membraanpotentiaal wordt geïdentificeerd, waaruit blijkt dat de elektrode heeft geweest gespietst.
- Druk de scherpere spanning detecterende elektrode op de spier naar het niveau van de impaled huidige-passing-elektrode. Zodra beide elektroden in overeenstemming met elkaar zijn, impale de spanning detecterende elektrode met dezelfde technieken toegepast met de huidige doorgeven-elektrode.
- Bij succesvolle Spietsing, met behulp van de controller voor de versterker, een constante negatieve houden huidige met de huidige passerende elektrode te compenseren schade membraan als gevolg van de elektrode Spietsing van toepassing. Als de cel begint te langzaam laden naar -80 mV, verhoging van het huidige als bedrijf nodig om de cel op de gewenste rustende potentiële (dat wil zeggen, -80 te-85 mV).
Opmerking: Voorkomen dat opname van vezels waarvoor een bedrijf stroom groter is in absolute waarde dan-25 nb in wild type spier aan het minimaliseren van de kans van opname van ongezonde vezels. - Zodra de vezel voor een paar minuten op de gewenste rustende potentiële stabiel is, gaat u verder met het opnemen van eigenschappen van de membraan van de spier of neuromusculaire transmissie.
10. het opnemen van eigenschappen van het postsynaptisch membraan en synaptische transmissie
- Start met de opnames van current-clamp door toepassing van een gelijk aantal positieve en negatieve huidige stappen voor het meten van de overeenkomstige membraan spanning reacties, die worden gebruikt voor het bepalen van de motorische eindplaat Rin en τm. Gebruik kleine spanning reacties die een constante status te bereiken en hebben een lineaire relatie van de spanning-stroom16,19,20om passieve eigenschappen. Vermijd opname van vezels met een beschadigde of ongezonde zenuw, dergelijke vezels hebben een frequentie van de waterwerkgroep van > 3 Hz.
- Vervolgens voert u twee-electrode spanning-clamp per de instructies van de fabrikant. Spanning-clamp vezels op een membraanpotentiaal van-85 mV. Spanning-clamp instellingen moeten bereiken signal-to-noise ratio's waarmee detectie van mEPCs.
Opmerking: Behoud van voldoende spanningsregeling kan worden een probleem. We gebruiken twee methoden om te minimaliseren van deze kwesties. Ten eerste, de vezels zijn gespietst binnen 100 µm van de motorische eindplaat zoals eerder beschreven die is binnen de constante van de lengte van deze vezels21. Ten tweede, we gebruiken de herstelfunctie voor DC van de versterker. Deze functie stelt een zeer hoge spanning-clamp winst. Onze vorige werk heeft deze methode in detail beschreven en schetste een methode voor de beoordeling van de spanning-geklemd eindplaat16. - Eenmaal in spanning-clamp, opnemen synaptic stromingen (mEPCs en eEPCs) met behulp van verschillende zenuwstimulatie protocollen, gebaseerd op de vereisten van het experiment.
- Record spontane mEPCs en Spoon met behulp van een lage-frequentie zenuw stimulatie protocol (≤0.5 Hz) waarmee een record Spoon zonder synaptic modulatie (versoepeling of modulatie) om te beoordelen van quantal inhoud. Om te beoordelen synaptic versoepeling of depressie, gebruik maken van een hoogfrequent zenuw stimulatie protocol (10 pulsen bij 50 Hz).
- Het stimuleren van de zenuw op de gewenste frequentie via een stimulans isolatieinrichting, die kan worden geactiveerd met behulp van een puls generator die wordt gecontroleerd met behulp van de software van de overname van de gegevens.
- Zodra de spanning-clamp-opnames worden gedaan, keren de versterker naar de instelling van een current-clamp, alle stromingen uitschakelen en verwijderen van de elektroden van de vezel. Controle dat de elektroden niet verstopt raken deed of drift in basislijn spanning tijdens de opname.
Opmerking: Met betrekking tot drijfnetten, de spanning elektrode moet 0 Volt in de extracellulaire oplossing, aangezien zij werden geplaatst voordat vezel Spietsing. Bijvoorbeeld, zou de opgenomen spanningen onzeker als de spanning tijdens het experiment dreef.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 8 toont een voorbeeld van de huidige pulsen (figuur 8A) en de spanning Reacties (Figuur 8) uit één LAL vezel onder current-clamp uit een 12-week-oude wild type R6/2-muis. De aanwezigheid van mEPPs geeft aan dat deze records werden genomen uit de motorische eindplaat. De records werden verkregen in normale fysiologische zoutoplossing oplossing. Deze huidige-clamp records kunnen worden geanalyseerd om te bepalen van de Rin en τm van die vezel16,19,20.
Een representatieve opname van een EPC en twee mEPCs, verkregen onder spanning-clamp voorwaarden, wordt weergegeven in figuur 9A. De korte huidige uitwijking voorafgaand aan de EPC is het artefact veroorzaakt door zenuwstimulatie. De analyse van mEPCs en Spoon kan men sneller met gebeurtenis detectie software. Deze tool kan de onderzoeker een sjabloon dat vervolgens automatisch van de gebeurtenissen binnen de opname detecteren kan maken. De gebeurtenissen kunnen worden bovenop en geëxporteerd naar een data-analysesoftware. Figuur 9B geeft de bovenliggende Spoon en mEPCs (inzet) uit een representatieve vezel.
Figuur 1 : Algemene locatie van de Musculus levator auris longus spier
De spier LAL is gelegen op het dorsale oppervlak van het hoofd. De rode stippellijn onderstreept het pad voor het snijden van de huid voor verwijdering op de dorsale (A) en laterale (B) oppervlak. De LAL hecht aan de basis van het oor, dus ongeveer 1 mm van de huid rond de basis van het oor om te voorkomen dat snijden de LAL intact moet blijven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Blootgesteld Musculus levator auris longus spier
De LAL (geel en groen) ligt vlak onder de huid en is de meest oppervlakkige spier in het gemarkeerde gebied. Er zijn twee gedeelten van de spier, de craniale (geel) en caudal (groen) regio's. De cranial regio naar voren komt uit de middellijn bij de eerste vier halswervels en loopt richting het voorste deel van de basis van de oorschelp. Ter referentie is de middellijn een band van bindweefsel, dat van de scapulae (witte pijl) richting de neus loopt. De rechter en linker LAL spier verbinden op de middellijn over de schedel. De cranial gedeelte van de LAL is veel ruimer dan het caudal gedeelte. Het caudal gedeelte hecht in de buurt van de middellijn bij de vierde en vijfde cervicale wervels en verbindt met het achterste gedeelte van de basis van de oorschelp. Tijdens de dissectie, houd een paar millimeter van de huid rond de kraakbeenachtige oor om te voorkomen dat snijden de LAL, die door een tussen haakjes stippellijn in de figuur is gemarkeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Ruwe dissectie van de Musculus levator auris longus en omringende spieren
Zodra verwijderd van het dier, is het weefsel vastgehouden, dorsale zijde naar beneden (LAL op bodem), in een silicone-elastomeer bekleed schotel met fijne pinnen maakte zoals beschreven in punt 5.3. Zodra bevestigd aan de onderkant van de schotel, kunnen de bovenliggende spier lagen worden verwijderd. Een insect pins via de gehoorgang wordt aangegeven met een witte onderbroken pijl. De gele pijlen geven ideale pin plaatsing voor het verwijderen van ongewenste spieren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Spier laag direct inferieur aan de Musculus levator auris longus
Gemarkeerd blauw is het abductor auris longus (AAL), in het rood is de auricularis scupularis (AS) en in geel is de interscutularis (IS). De LAL is de belangrijkste, onderliggende spier in dit beeld. Ter referentie, wordt het oor en de omliggende huid beschreven door een zwarte ononderbroken lijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Silicone-elastomeer-bekleed, aangepaste perfusie kamer
Getoond wordt de aangepaste 35 mm perfusie schotel gebruikt teneinde de LAL voor elektrofysiologische opnamen (A). Silicone-elastomeer is gebruikt bij het maken van een oppervlak geschikt voor heimwee van het weefsel. In het midden van de kamer is een afgeronde platform dat is handig als de vezels spietsen. Het platform ondersteunt de spiervezels van onder wanneer een neerwaartse kracht met elektroden toepassen tijdens de Spietsing verwerken. Dit platform werd gevormd doordat silicone-elastomeer vorm aan de curve van een conische tube van 50 mL. Een segment van dit afgerond silicone-elastomeer kan dan worden gelijmd op de bodem van de kamer met meer silicone-elastomeer. Een overzicht vertegenwoordiging van de schotel, alsmede een zijdelings uitzicht staan in B en C , waar de perfusie Kamer duidelijker kan worden gezien. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Electrofysiologie experimenteren set-up
Een kleine bipolaire elektrode is op zijn plaats gehouden met een magnetische kogelgewricht manipulator ter stimulering van de zenuw van de LAL. Het stadium van de microscoop kan worden gemaakt om te gemakkelijk houden een magnetische platform met het gebruik van een lijm magnetisch materiaal (zoals kan worden gevonden op een ambachtelijke of hardware te slaan voor het maken van koelkastmagneten). Ook komt te staan, zijn de headstages en elektroden gepositioneerd boven een monster LAL. Een belangrijk instrument is het water-onderdompeling, schuine doelstelling met een keramische dompelen kegel, zoals aangegeven. Het schuine einde zorgt voor eenvoudiger elektrode plaatsing en het keramische materiaal minimaliseert elektrische ruis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Motorische eindplaat identificatie
Alle beelden tonen de LAL gekleurd met 5 µM 4-Di-2-Asp (groen) toe voor visualisatie van neuromusculaire kruispunten. (A) A heldere band van neuromusculaire kruispunten kan worden gezien (gele pijlen) bij het bekijken van de spier door middel van een 10 X doelstelling. Vertakkende axonen kunnen ook worden gezien als aangegeven door de witte onderbroken pijl. (B) kleine confocal stapels (5 x 1 µm) van drie neuromusculaire kruispunten (gele pijlen). Gezonde spiervezels hebben duidelijk strepen evenals meerdere myonuclei die worden weergegeven als donkere plekken langs het sarcolemma van de vezel (witte pijlen). De innervating van de neuromusculaire kruispunten axonen kunnen vaak ook worden waargenomen. (C) A vezel met een gekleurd eindplaat die wordt gespietst met glas elektroden. De elektroden zijn verbeterd met een wit hooglicht zodat ze gemakkelijker kunnen worden gezien. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 : Current-clamp opname van membraan eigenschappen
Geïnjecteerd huidige pulsen (A) en de resulterende membraan potentiële antwoorden (B) van een vezel van de LAL opgenomen badend in fysiologische zoutoplossing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9 : Twee-electrode spanning-clamp opnamen
Een rauwe spoor van een EPC en twee mEPCs opgenomen in twee-electrode spanning-clamp (A). Bovenliggende Spoon en mEPCs (inzet) uit een enkele vezel (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreven is de voorbereiding en het gebruik van de muis LAL spier voor de meting van de neuromusculaire transmissie onder stroom - of spanning-clamp voorwaarden. Er zijn verschillende belangrijke punten om te overwegen voor het ontleden van de LAL. Reiniging van overtollige bindweefsel van de spier aids in elektrode Spietsing, als de elektroden kunt addertje onder het gras het bindweefsel wanneer ze voor Spietsing positionering. Echter alleen het verwijderen van bindweefsel die kan worden ontnomen gemakkelijk te beperken van de kans op beschadiging van de spier. Het isolement van de zenuw moet met zorg worden uitgevoerd, omdat het zeer delicate. Voorkom schade aan de zenuwen, is het nuttig om laten een aantal van de omliggende weefsel gehecht aan het einde van de zenuw waarlangs een pin om het lef om de schotel geplaatst kan worden. Ook oppassen dat niet de zenuw verpletteren als de zenuw stimulator positionering. Ten slotte is de volgorde waarin de elektroden zijn gespietst in de vezel belangrijk. De botte elektrode is niet zo eenvoudig om te impale en moet eerst worden gespietst. Als de scherpe elektrode eerst gespietst werden, kan de botte elektrode duw de spiervezel voordat het doorboort het membraan, mogelijk veroorzaakt door de scherpe elektrode te komen van de vezel. Dit zou nopen tot het impale van de vezel een tweede keer met de scherpe elektrode die leiden geen onnodige membraan schade tot zou. Het is ook nuttig dat de versterker wordt gebruikt tegelijk meten kan de stroom en de spanning van de huidige passerende elektrode zodat een negatieve doorbuiging in de membraanpotentiaal kan worden waargenomen, die aangeeft dat de elektrode heeft geweest gespietst.
Een functie van de LAL die nuttig kan zijn is de mogelijkheid om beide spieren tegelijk verwijderen. Dit kan voor de elektrofysiologie en moleculaire biologie-experimenten uitvoeren in hetzelfde dier groot zijn. Dit kan worden bereikt door het volgen van de in wezen hetzelfde protocol beschreven hier met kleine wijzigingen. Volg alle stappen in de rubrieken 1-3 alles beschreven op zowel rechts als links. Stap 4 is het beste om te beginnen snijden aan de ventrolateral kant van het rechter oor te verwijderen van de spieren. Zoals eerder beschreven, houd altijd de messen tegen de schedel te snijden zo diep mogelijk verlaten inferieur spieren gekoppeld aan de LAL gedrukt. Blijven snijden naar de rechter oor voorbij de middellijn, het mes zo diep mogelijk te houden. Op dit punt, de rest van de procedure zoals beschreven in dit protocol is alleen Voer de resterende stappen uit op beide spieren. Zodra de spieren gereinigde, één LAL weg en bevroren voor later moleculaire analyse kan worden gesneden en de andere kan worden gebruikt voor electrofysiologie. Het zou moeilijk electrofysiologie studies met beide spieren van hetzelfde dier te verrichten. Om dit te doen, de middellijn moet worden gesneden om te scheiden van de spieren en doen dus zal waarschijnlijk beschadigen sommige spiervezels.
De LAL heeft lange tijd gebruikt om neuromusculaire transmissie onderzoeken, omdat het dunne karakter voor de identificatie van de motor endplates en uitstekende ex vivo perfusie1,3,4,5 zorgt ,6,7,8. Naast het gebruik van 4-di-2-asp, hebben andere groepen rhodamin-geconjugeerde bungarotoxin gebruikt bij lage concentraties22. Wij hebben de LAL gebruikt voor elektrofysiologische onderzoeken, purinergic signalering en gebreken in de ziekte van Huntington16,20. De LAL is ook ideaal voor live-cel imaging studies. Verschillende studies hebben bijvoorbeeld de LAL gebruikt om te meten van synaptic vesikel release en opname23,24. Dit kan gedaan worden met behulp van kleurstoffen, zoals FM 1-43.
Omdat de endplates gemakkelijk kan worden waargenomen met een fluorescerende vlek, kunnen de elektroden worden geplaatst in de nabijheid van de motorische eindplaat in de constante van de lengte van de spiervezel. Plaatsing van de elektroden op de eindplaat en het gebruik van een hoge naleving twee-electrode spanning-klem systeem kan onderzoekers voor volledige grip op de potentiële met minder dan 1% fout16eindplaat. Dit kan belangrijk zijn omdat de gebruikte correcties voor niet-lineaire sommering van synaptic potentieel opgenomen onder voorwaarden van current-clamp10 geen rekening met veranderingen in het postsynaptisch membraan veroorzaakt door experimentele omstandigheden en/of de toestand van de ziekte. Bijvoorbeeld zal verminderde rust eindplaat conductances versterken postsynaptisch potentieel19, zelfs die gecorrigeerd voor niet-lineaire sommatie. In tegenstelling, spanning-geklemd postsynaptisch stromingen zijn niet onderworpen aan de niet-lineaire sommatie fouten en zijn onafhankelijk van het postsynaptisch membraan-eigenschappen. We hebben onlangs een contrasterende resultaten van eindplaat potentieel in vergelijking met stromingen opgenomen van hyper-prikkelbaar de ziekte van Huntington skeletspieren16aangetoond dit aan te tonen.
Een laatste belangrijk voordeel van het gebruik van de LAL voor het bestuderen van de neuromusculaire transmissie is dat de opnames van een enkele SYNAPS zijn. Neuromusculaire transmissie opgenomen van een honkslag, volledig spanning-geklemd eindplaat biedt een aantal van de meest gedetailleerde en accurate gegevens op synaptische transmissie die momenteel beschikbaar, die ideaal is voor het modelleren en het ontrafelen van de complexiteit van synaptic fysiologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Mark M. Rich en Daniel Miranda voor redactiecommentaren, Ahmad Khedraki voor het helpen vaststellen van deze techniek en Wright State University voor financiële steun (opstarten Fonds A.A.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. The anatomy of the rat. , Hafner Pub. (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. Electric current flow in excitable cells. , Clarendon Press. (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
