Summary
يستخدم البروتوكول، المذكورة في هذه الورقة عضلة عضلة رافعة أوريس (ال) الماوس لتسجيل عفوية وإمكانيات بوستسينابتيك أثارت العصبية (المشبك الحالية) والتيارات (الجهد-المشبك) عند تقاطع العصبية والعضلية. استخدام هذه التقنية يمكن أن توفر أفكاراً رئيسية في آليات انتقال متشابك في ظل الظروف العادية، والمرض.
Abstract
وصف هذا البروتوكول تقنية لتسجيل انتقال متشابك من الوصلات العصبية العضلية في ظل الظروف الحالية-المشبك والجهد-المشبك. يتم استخدام إعداد السابقين فيفو عضلة رافعة أوريس (ال) لأنها عضلة رقيقة ينص التصور سهلة للوصلات العصبية العضلية إيمباليمينت ميكروليكترودي في اندبلت موتور. يسمح هذا الأسلوب لتسجيل مصغرة تلقائية اندبلت إمكانات والتيارات (ميبس وميبكس)، وإمكانات اندبلت أثارت الأعصاب والتيارات (المنتجات المفضلة بيئياً وابكس)، فضلا عن خصائص الغشاء اندبلت موتور. النتائج التي تم الحصول عليها من هذا الأسلوب تضمين محتوى كانتال (QC)، عدد من مواقع إطلاق سراح حويصلة (n)، واحتمال الإفراج عن حويصلة (فrel)، وتيسير متشابك والاكتئاب، فضلا عن العضلات الغشاء وقت ثابت (τ م)، وإدخال المقاومة. يمكن تطبيق هذه التقنية على نماذج الماوس من الأمراض البشرية تسليط الضوء على الأمراض الرئيسية في الحالات المرضية والمساعدة في تحديد استراتيجيات علاجية جديدة. بكامل الجهد-لقط المشبك واحد، يوفر هذا الأسلوب أحد التحليلات الأكثر تفصيلاً لانتقال متشابك المتاحة حاليا.
Introduction
دراسة انتقال متشابك في الوصلات العصبية العضلية يوفر نظرة ثاقبة العلاقة الديناميكية بين النظامين العضلي العصبي والهيكل العظمى وهو نموذج ممتاز لدراسة فسيولوجيا متشابك. عضلة رافعة أوريس (ال) عضلة رقيقة، مما يسمح للوصلات العصبية العضلية تصور بسهولة. ووصفت تقارير سابقة الراحة من استخدام ال دراسة متشابك المخدرات والسموم واتسمت خصائص نوع الألياف العضلية الهيكلية لل1،2. واستخدمت العديد من الدراسات ال دراسة فسيولوجيا الأعصاب3،4،5،6،،من78. للكهربية، القدرة على سهولة مراقبة الوصلات العصبية العضلية لل يسمح للموضع الدقيق من ميكرويليكتروديس في اندبلت موتور، ويقلل كثيرا من قضايا الفضاء المشبك في تسجيل انتقال متشابك. سهولة الحصول على تسجيلات المشبك الحالية من خصائص غشاء العضلات، مثل الغشاء وقت ثابت (τm) وإدخال المقاومة (آرفي). وعلاوة على ذلك، يمكن قياس هذه الخصائص من ألياف العضلات نفسها المستخدمة لتسجيل الإرسال العصبية العضلية، مما يسمح لمقارنة مباشرة لدالة متشابك لخصائص غشاء العضلات. تحليل هذه البيانات يمكن أن توفر أفكاراً رئيسية في الآليات الجسدية للعديد من الأمراض العصبية العضلية والدول تغيير النشاط.
أحد جوانب رئيسية للأسلوب الموصوفة هنا هو استخدام المشبك الجهد لتسجيلات متشابك، التي لا تخضع لغير linearities مصادفة في المشبك الحالية وهي مستقلة عن خصائص غشاء العضلات. مزايا استخدام المشبك الجهد مقابل المشبك الحالي لدراسة انتقال الأعصاب أنشئت بدور رائد في الجهود المبذولة في الخمسينات9. تحت المشبك الحالية، المنتجات المفضلة بيئياً التي تتجاوز 10-15 mV في السعة ليست نتاج خطية ل مشروعات السعة9. على سبيل المثال، إذا كانت مشروعات متوسط 1 أم، EPP 5 أم يمكن أن يفترض أن يكون نتاج 5 ميبس (مراقبة الجودة 5)؛ بينما، EPP 40 أم سيكون نتاج ميبس أكثر من 40. هذا غير الخطي في أكبر المنتجات المفضلة بيئياً يحدث بسبب قيادة القوة EPP، الذي هو الفرق بين إمكانات غشاء وإمكانات التوازن لمستقبلات أستيل (~-10 mV)، يقلل إلى حد كبير خلال بيئياً كبيرا. يتم تجنب هذه المسألة في تجارب المشبك الجهد لإمكانات غشاء العضلات لا يتغير أثناء تجارب المشبك الجهد. عيب أن تجارب المشبك الجهد أكثر صعوبة من الناحية التقنية الانتهاء من التسجيل الحالي-المشبك. مع هذا في الاعتبار، وضعت مكلوكلين ومارتن تصحيحًا رياضية مباشرة حسابات لغير linearities في تسجيلات المشبك الحالية من المنتجات المفضلة بيئياً10. التصويبات التي تعمل بشكل جيد11،،من1213، ولكن الأهم من ذلك، تفترض أن تعطلت لم خصائص غشاء العضلات.
خصائص غشاء العضلات ذات أهمية خاصة للنظر في حالة دراسة الأوضاع أو الحالات المرضية التي تعطل العضلات. على سبيل المثال، الهيكل العظمى والعضلات من طراز R6/2 المعدلة وراثيا لمرض هنتنغتون هايبريكسسيتابل بسبب تخفيض تدريجي في استراحة الكلوريد والبوتاسيوم التيارات14،15. نتيجة لذلك، تزداد ميبس والمنتجات المفضلة بيئياً في العضل R6/2. ومن المؤكد أن عوامل إضافية يمكن أن يغير ميبس والمنتجات المفضلة بيئياً. العمل مع نموذج مختلف من مرض هنتنغتون الفئران (R6/1) يتم العثور على تغييرات في المنتجات المفضلة بيئياً التي تبدو مرتبطة بالبروتينات الفخ8. لتقييم الآليات التي تسبب تغيير الإرسال العصبية العضلية، من المفيد للقضاء على آثار غشاء العضلات تغيير خصائص باستخدام المشبك التيار الكهربائي. في دراسة أجريت مؤخرا، تم درس الإرسال العصبية العضلية R6/2 في ظل الظروف الحالية والجهد المشبك كلا استخدام الأسلوب الموصوفة هنا. وكانت بأكملها اندبلاتيس موتور الجهد-فرضت مع أقل من 1% خطأ بوضع ميكروليكتروديس اثنين داخل ثابت طول اندبلت16. تبين أن الجهد-المشبك وتصحيح السجلات الحالية-المشبك أسفرت عن قياسات المتناقضة للإرسال العصبية العضلية في العضلات R6/2. هذا يسلط الضوء على أنه قد يكون من الصعب لتصحيح المنتجات المفضلة بيئياً لغير لينيريتيس إذا كان قد تم تغيير خصائص غشاء العضلات ويبين فوائد الحصول على سجلات الجهد-المشبك مستقلة عن خصائص غشاء العضلات. البروتوكول المعروضة هنا مثالية لدراسة الأوضاع أو الحالات المرضية التي تؤثر على انتقال متشابك وخصائص الغشاء بوستسينابتيك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للعناية بالحيوان ولجنة الاستخدام من جامعة ولاية رأيت.
1-الماوس القتل الرحيم
- في غطاء دخان، ضع الماوس الزجاج محكم أنيسثيتيزينج الدائرة.
- الكشف عن الماوس عن طريق استنشاق لجرعة قاتلة من إيسوفلوراني (تشبع، أو ~ 25%). اترك الماوس في الدائرة حتى يمكن ملاحظة لا التنفس.
- إزالة الماوس من الدائرة وأداء اضطراب عنق الرحم كوسيلة ثانوية للقتل الرحيم.
2-إزالة الشعر من سطح الظهرية من الرأس والرقبة والظهر
- استخدام ماكينة حلاقة كهربائية لإزالة معظم الشعر على السطح الظهري للرأس والرقبة، والخلفي للماوس. أيضا، إزالة الشعر حولها وفي الإذن اليسرى.
ملاحظة: العناية عند حلق الجلد حول الأذنين، والجلد يمكن أن ننشغل بشفرات الحلاقة، ويمكن أن تلف أنسجة العضلات الأساسية. - تطبيق كريم لإزالة الشعر مع مسحه القطن إلى منطقة حلق لإزالة الشعر المتبقية. الانتظار حوالي 1 دقيقة وشطف كريم إزالة الشعر مع الماء باستخدام زجاجة غسيل ضغط، ثم فرشاة بعيداً أي كريم أو الشعر باستخدام مسحه القطن المتبقية وبات الجلد الجاف.
3-إزالة الجلد لفضح في عضلة عضلة رافعة أوريس طويلة
- تحت مجهر تشريح ستيريو، جعل شق صغير (العميقة فقط ما يكفي لاختراق الجلد) على الجزء الخلفي الماوس على مستوى سكابولاي. قطع الجلد باستخدام مقص التشريح الجزئي، عقب المسار المبين في الشكل 1 ألف-باء.
- استخدام الملقط غرامة (مثل رقم 5)، سحب ما يصل الجلد على طول القطع القرب سكابولاي. باستخدام مقص الربيع، قطع النسيج الضام لفصل الجلد عن الأنسجة العضلية الأساسية بينما تقترب من الإذن. الأهم من ذلك، قطع النسيج الضام مع ريش أشار إلى الجلد لتجنب قطع عرضي لانسجة العضلات المكشوفة.
- نتخلل دورياً في العضلات المكشوفة بحل المحلول ملحي الفسيولوجي، مثل التالية نا+ الخارجية المخزن المؤقت الذي يتكون من (في مم): 144 كلوريد الصوديوم، 4 بوكل، 1.2 كاكل2، 0.6 مجكل2، الجلوكوز 5، 1 نة2بو4، درجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم، وقد أوسمولاليتي 300 ± 5 mmol/كغ. بمجرد قد تم تقطيع النسيج الضام إلى الإذن اليسرى، وقطع الجلد حول الإذن لإزالة الجلد تماما من الماوس وتجاهل ذلك.
ملاحظة: ال تعلق على قاعدة الإذن ويمكن أن تتلف بسهولة أثناء إزالة الجلد. أنه لأمر جيد أن يغادر حوالي 1 ملم جلد حول قاعدة الإذن لتجنب قطع ال.
4-إزالة عضلة عضلة رافعة أوريس طويلة والأنسجة المحيطة
- ابدأ باستخدام مقص الربيع بقطع العضلات التي أدنى من ال، التي تتصل بالعمود الفقري بين سكابولاي. ابدأ في الكتف الأيمن، فقط الحق في خط الوسط، وقطع نهاية روسترال من الماوس، بينما تبقى على الجانب الأيمن من خط الوسط. مواصلة قطع كل طريق إلى نهاية الأنسجة العضلية على الجمجمة.
ملاحظة: ال هو العضلات الأكثر سطحية متصلة بالجانب الآنسي للإذن وخط الوسط، كما هو مبين في الشكل 2. لصور إضافية، يظهر كتاب من قبل المفوضية الأوروبية غرين17 صور ممتازة، ومرسومه باليد ال. - استخدام الملقط لانتزاع قطع الأنسجة مباشرة إلى يمين خط الوسط، ثم بلطف رفع والبدء في قطع الأنسجة نحو الإذن اليسرى مع ريش مقص ضغط ضد الجمجمة لإزالة عدة طبقات من العضلات التي أدنى من ال الأيسر. ترك كل من الطبقات التي تعلق مؤقتاً تجنب قطع ال بطريق الخطأ أثناء الإزالة.
- قطع مع ريش متوازية والضغط ضد الجمجمة تجنب قطع الأعصاب التي إينيرفاتيس ال، الذي يلتف حول قناة الإذن، ويدخل العضلات على الجانب الآنسي من الإذن. مواصلة قطع عبر قناة الإذن، الاحتفاظ بقدر من الجرأة يعلق ممكن.
ملاحظة: العصب الذي يزود ال فروع الخروج من العصب الوجهي وينبغي الحفاظ عليها كما أنها ستستخدم لاحقاً في هذا الإجراء. - قطع الأنسجة الدهنية التي فقط في الماضي بقناة الإذن على نفس المسار المبين في الشكل 1 باء في الجزء فينترولاتيرال من الإذن. أيضا، قطع على طول لوح الكتف الأيسر كما حدث في الجانب الأيمن لإزالة العضلات تماما من الماوس.
5-عزل العضلات عضلة رافعة أوريس طويلة
- مكان لل، والأنسجة المحيطة بها، في حاوية. استخدام حاوية الذي يمكن أن يعلق تشريح الأنسجة إلى الأسفل، مثل طبق بيتري مع سيليكون الاستومر قاع. الاستحمام، وكثيراً ما يغسل النسيج في محلول ملحي فيزيولوجية.
- قطع بينا في الإذن على طول قاعدة الإذن، وترك الجزء عنقية الإذن يعلق على ال. الوجه العضلات حيث أنه هو مواجهة الجانب السفلي (ال على الجزء السفلي من الطبق).
- ضع رقم pin، مثل رقم التعريف شخصي الحشرات، من خلال قناة الإذن لعقد prep في المكان. ثم استخدام دبابيس صغيرة، الأنسجة المتبقية على الجانب الآخر من خط الوسط لل pin. استخدام الملقط، اجذب الجلد في الجزء الجانبي من الإذن ليمد العضلات ووضع دبوس صغير من خلال الجلد. كرر هذه الخطوة حتى الأنسجة المضمون جيدا للطبق، كما هو مبين في الشكل 3.
ملاحظة: يمكن إجراء دبابيس صغيرة تشريح قطع النصائح من العلاج بوخز الإبر إلى الطول المطلوب. هذه دبابيس صغيرة تقليل الضرر للأنسجة، ويمكن استخدامها مع الماء الغمر مجهر أهداف مع العامل في مسافات طويلة. - بدء إزالة العضلات (هو موضح في الشكل 4)، التي تغطي ال (أوريكولاريس متفوقة والمبعدة أوريس طويلة، و إينتيرسكوتولاريس)، وتلك منضمة إلى ال عبر النسيج الضام وضيقة خاصة قرب خط الوسط، باستخدام مقص ملقط والربيع رقم 5.
- استخدام الملقط لسحب ما يصل على طبقة العضلات السطحية، قطع النسيج الضام مع ريش الموجهة نحو طبقة العضلات التي سحبت، والحرص على تجنب القطع أو نيكينج ال. قطع نحو خط الوسط ووقف قطع ثلاثة أرباع الطريق إلى خط الوسط. بعد ذلك، قص موازية لخط الوسط لإزالة كل طبقة العضلات. تبقى إزالة طبقات العضلات حتى تبقى فقط ال.
- قم بإزالة بعض من النسيج الضام المتبقية تغطي ال، مما يساعد في إيمباليمينت من أقطاب كهربائية. بلطف استخدام الملقط رقم 5 لسحب النسيج الضام بعيداً عن ال وقص بعيداً باستخدام مقص الربيع. فقط قم بإزالة الأنسجة التي يمكن القيام به بسهولة دون التعرض لخطر إلحاق الضرر ال في العملية. قم بإزالة أي الأعصاب الكبيرة التي يعصب العضلات أدنى الطبقات المتبقية على السطح السفلي لل التي قد تؤدي إلى عرقلة تصور الوصلات العصبية العضلية.
6-عزل العصب
- التعرف على العصب إينيرفاتيس ال مشجعا عصب باستخدام (على سبيل المثال، اثنين من الأسلاك البلاتينية متصل بمولد نبض)؛ سيكون هناك عدة أعصاب يعمل من قناة الإذن للعضلات. اتصال الأعصاب مع مشجعا العصب توريد بعض الحالية (ستختلف الحالي حوالي 5 الخامس). عندما العضلات بموجب عقود، تم التعرف على العصب الصحيح.
- انتزاع الأنسجة قرب العصب واستخدام مقص الربيع لفصل العصب من الأنسجة المحيطة بالإذن بعناية. للحد من الأضرار، وإبقاء معظم العصب المضمنة في بعض الأنسجة المحيطة بها، والتي ستستخدم فيما بعد لتأمين العصب للطبق تسجيل.
ملاحظة: يقع الأعصاب الحركية التي إينيرفاتيس ال على الجانب الآنسي لفتح قناة الإذن. - في حالة استخدام قطبين قطب تحفيز، إزالة الأنسجة المحيطة فقط حول منطقة العصب، البعيدة من العضلات. في حالة استخدام شفط كهربائي، إزالة الأنسجة المحيطة بنهاية قطع العصب.
ملاحظة: هذه نقطة توقف جيدة. هذه نقطة توقف جيدة. إذا كان فاصل هو حاجة الإعدادية ال تشريح يمكن الاحتفاظ في التروية المستمرة لبضع ساعات لضمان أن لا تتراكم الايضات الضارة أو حل الفسيولوجية. استخدام حجم كبير من نضح الحل أو ثابت لضمان أن لا تتراكم الايضات الضارة. - بعد ذلك، حذف ونقل العضلات إلى دائرة نضح للتجارب الكهربية تحت مجهر مجمع تستقيم.
ملاحظة: استخدام دائرة التروية مع قاع ناعمة التي الأنسجة يمكن بأمان مثبتة (الشكل 5A). - دبوس العضلات في النهايات (الإذن وخط الوسط) وعلى طول حافة العضلات. ضع العصب عمودي لألياف العضلات ودبوس إلى الجزء السفلي من الطبق من خلال بعض الأنسجة الزائدة التي تركت سليمة في نهاية العصب. الحفاظ على النسيج حمم في محلول ملحي الفسيولوجي في جميع الأوقات.
ملاحظة: أنه مفيد أيضا يكون مقربا، المواد مرتفعة مباشرة تحت ألياف العضلات لل. الإيدز في إيمباليمينت الكهربائي هذا دعم إضافي ويمكن أن تكون مصنوعة من قسم صغير من سيليكون الاستومر المدلى بها في أنبوب 50 مل مخروطية ملقاة على جانبها. يمكن تأمين المقطع مقربة من الاستومر إلى الجزء السفلي من الدائرة التروية باستخدام كمية صغيرة من السيليكون الطازجة. ويبين الشكل 5B-جرسم تخطيطي للدائرة التروية. ألياف العضلات يمكن التمسك بشكل محكم جداً حديثا يلقي سيليكون الاستومر (ومسعور جداً) وقد أصبح تالفاً. أنها مفيدة لطبقة أو كتلة حديثا يلقي سيليكون مع البروتين، مماثلة لخطوة حظر في إيمونوبلوت. لمنع ذلك، ونحن قد المحتضنة حديثا سيليكون المدلى بها في حل مركزة من ألبومين المصل البقري بين عشية وضحاها.
7. إعداد المعدات الكهربية
- إعداد أو ذوبان الجليد مختبرين لصبغة للمساعدة في تصور تقاطع العصبية والعضلية، مثل صبغ المتقدرية 4-(4-diethylaminostyryl)-1-ميثيلبيريدينيوم18، التي هي حساسة للضوء، ويجب تخزينها بعيداً عن الضوء. كما أن ذوبان الجليد الحلول القطب. دوامة كل مختبرين التأكد من أن جميع الذوائب في الحل. تحضير المحلول ملحي الفسيولوجي محلول يحتوي على 1 ميكرومتر μ-كونوتوكسين جييب (μ-CTX) و 80 ميكرومتر البنك التونسي للتضامن (اختياري).
- تأمين قاعة التروية مع ال إلى مرحلة المجهر. ضع مسرى إشارة إلى كأس مليئة 3 م بوكل، التي يتم توصيلها إلى دائرة التسجيل عن طريق استخدام جسر أجار. قم بتوصيل مسرى إشارة مكبر للصوت لإرشادات الشركة المصنعة.
- عند هذه النقطة، ضع تحفيز الأعصاب الكهربائي في العصب. استخدام قطب شفط أو قطب قطبين صغيرة، كما أنها تعمل أيضا لتحفيز الأعصاب.
- ضع مسرى تحفيز كما بعيداً عن العضلات قدر الإمكان التقليل من العدد من القطع الأثرية التحفيز في التسجيلات.
ملاحظة: ينبغي التحكم الكهربائي محفزة مع وحدة عزل تحفيز التي يمكن التحكم في مطال الجهد حسب الضرورة.
- ضع مسرى تحفيز كما بعيداً عن العضلات قدر الإمكان التقليل من العدد من القطع الأثرية التحفيز في التسجيلات.
- ببطء رفع الجهد عن طريق تحويل مقبض الجهد على وحدة عزل التحفيز حتى يتم ملاحظة تقلصات. هذه النقطة التي لوحظ أول الانكماش هي العتبة. مرة واحدة وقد تم تحديد العتبة، تعيين الجهد في وحدة العزل حافز 1.5 * عتبة (أو كما تعرف بالتجربة).
ملاحظة: يبين الشكل 6 الإعدادية العضلات إعداد تحت مجهر تستقيم ومسرى القطبين الصغيرة المتمركزة في العصب مناور كرة مشتركة استخدام. وملائم ليكون الجهد أقل للتحفيز الممكنة في حين لا يزال يجري بما فيه الكفاية عتبة. جهد حافز أقل يقلل من العدد من القطع الأثرية التحفيز خلال التسجيلات. أيضا، وضع مسرى حفز بعيداً عن العضلات سينخفض حجم قطعة أثرية التحفيز. في بعض الأحيان سوف يكون معطوباً نهاية العصب من التشريح، ولذلك قد يكون من الضروري لهذه التجربة بحيث يجب وضع مشجعا على طول العصب. - إزالة المحلول الملحي الاستحمام واستبدال مع 5 ميكرومتر 4-دي-2-آسيا والمحيط الهادئ. كشف الإعدادية ال على 4-دي-2-آسيا والمحيط الهادئ لمدة 10 دقيقة لتحقيق الأسفار كافية للتصور الوصلات العصبية العضلية (الشكل 7).
- إعداد حلين القطب، 3 م بوكل وحل داخلي ك+ تتكون من (في مم) 75 اسبارتاتي، 5 MgCl2، 15 Ca(OH)2، 5 ثنائي ATP، ثنائي فوسفوكريتيني 5, 5 الجلوتاثيون، والمماسح 20، 30 عطا، الرقم الهيدروجيني 7.2 مع كوه.
ملاحظة: ينبغي إعداد الحلول في وقت مبكر؛ ويمكن تخزين حل داخلي ك+ في مختبرين في-20 درجة مئوية. - استخدام تعبئة الزجاج سحبت شعري للاستشعار عن بعد الجهد الكهربائي مع 3 م بوكل. حل داخلي ك+ (أعد الخطوة 7.6) لتمرير التيار الكهربائي؛ استخدام إبرة غير معدنية ضيقة (قياس ~ 34) مرفقة بحقنه 1 مل لملء الشعيرات الدموية الزجاج بسهولة. اضغط برفق الشعيرات الدموية لإزالة فقاعات الهواء؛ ضمان أن كل قطب شغلها تتمتع بمقاومة MΩ 10-15.
ملاحظة: تدقيق وملاحظة مقاومة أقطاب على حد سواء باستخدام البرمجيات اقتناء البيانات. - وبعد 10 دقائق، تبادل الحل 4-دي-آسيا والمحيط الهادئ مع Ca2 + الحل الطبيعي.
8-تحديد الوصلات العصبية العضلية استخدام الأسفار
- استخدام مجهر تستقيم مع مشرق الحقل القياسية والإضاءة الفلورية، ابحث عن عصابة مشرق من الوصلات العصبية العضلية الأخضر الفلورسنت تشغيل عمودي لألياف العضلات على طول الإعدادية كما هو موضح في الشكل 7 ألف. استخدم هدفا غمر مياه تضخم منخفضة (~ 10 X) لتحديد الوصلات العصبية العضلية
ملاحظة: يجب أن تكون مجهزة المجهر مع مكعب فيتك (Ex: 480/40، ديتشرويك: 505LP، م: 535/50)، والصمام، والليزر، ومصباح هالوجين، أو مصباح الزئبق للأسفار. لتصغير الصور تبيض، بالتناوب بين إضاءة ساطعة الميدانية والأسفار.
ملاحظة: هذه الفرقة عادة أكثر الدانية لقاعدة للإذن من على خط الوسط. الفرقة هو المنطقة حيث تتركز معظم الوصلات العصبية العضلية. - التبديل إلى هدف الماء غمر تكبير أعلى (~ 40 س) وتحديد تقاطع الأعصاب في الطبقة العليا من العضلات للنظر مع الكهربية (الشكل 7).
- تأمين الماصات شغلها إلى أصحاب ماصة في هيدستاجيس المناسبة، الواحدة لإرشادات الشركة المصنعة. استخدم ميكرومانيبولاتورس لوضع أقطاب كهربائية فوق غشاء العضلات داخل 100 ميكرون من الوصلات العصبية العضلية المحددة (الشكل 7). قم بوضع أقطاب كهربائية تستخدم أساسا مجهرية مشرق الميدانية؛ استخدم الأسفار لتأكيد موقع الأقطاب بالنسبة للوصلات العصبية العضلية.
- أولاً، استخدم هدفا تضخم منخفضة (~ 10 X) لموقع أقطاب كهربائية ومن ثم التبديل إلى هدف تكبير (~ 40 س) أعلى لتحديد المواقع النهائية لأقطاب كهربائية. لا أسعد الأقطاب في العضلات عند هذه النقطة، أولاً ضبط الأقطاب.
9-ضبط والتخوزق أقطاب كهربائية
- حالما يتم وضع أقطاب كهربائية أعلاه الألياف المطلوب، صفر وضبط مسرى الاستشعار عن الجهد بموازنة جسر (أو اتباع نهج مماثل) وتحييد السعة القطب الواحد إلى إرشادات الشركة المصنعة. أيضا، دون مرور التيار الكهربائي.
- إحضار كل أقطاب وصولاً إلى سطح الألياف. ضبط موضع الأقطاب في الطريق وصولاً إلى الألياف ببطء حتى يظل أقطاب كهربائية موجهة فيما يتعلق بالوصلات العصبية العضلية، كما هو موضح في الخطوات 8.3 و 8.4.
- بعد أن اتصلت كل أقطاب سطح الألياف العضلية، أسعد القطب الحالي-وفاة كليلة أولاً. استخدام تقنيات مثل الطنين (نبضات قصيرة لتعويض السعة الزائدة) أو نبضات الحالية قصيرة بلطف التنصت على الجدول لتسهيل إيمباليمينت الكهربائي.
- رصد الإشارة، استخدام الذبذبات أو بروتوكول الذبذبات في البرنامج الحصول على البيانات، حتى يتم التعرف على غشاء سلبية محتملة، مما يشير إلى أنه قد تم مخوزق الكهربائي.
- كساد مسرى الاستشعار من الجهد أكثر وضوحاً على العضلات لمستوى تمرير التيار الكهربائي إيمباليد. مرة واحدة كل أقطاب تتماشى مع بعضها البعض، أسعد مسرى الجهد الاستشعار عن بعد باستخدام نفس الأساليب المطبقة مع مرور التيار الكهربائي.
- عند نجاح إيمباليمينت، باستخدام وحدة تحكم لمكبر للصوت، تطبيق سلبية مستمرة عقد الحالية مع مسرى رحيل الحالية للتعويض عن أي ضرر الغشاء بسبب إيمباليمينت الكهربائي. كما يبدأ الخلية لتوجيه الاتهام ببطء نحو-80 أم، زيادة عقد الحالية كاللازمة لجعل الخلية ليستريح المرغوبة المحتملة (أي-80 إلى-85 mV).
ملاحظة: تجنب تسجيل من الألياف الغذائية التي تحتاج إجراء الحالي أكبر في القيمة المطلقة من نا-25 في العضلات نوع البرية تقليل فرصة التسجيل من ألياف غير صحية. - مرة واحدة الألياف مستقرة لبضع دقائق في يستريح المرغوبة المحتملة، المضي قدما لتسجيل خصائص غشاء العضلات أو الإرسال العصبية العضلية.
10-تسجيل خصائص الغشاء بوستسينابتيك وانتقال متشابك
- البدء مع تسجيلات المشبك الحالية عن طريق تطبيق عدد متساو من الخطوات الحالية الإيجابية والسلبية لقياس استجابات الجهد غشاء المقابلة، التي ستستخدم لتحديد اندبلت موتور Rفي و τم. للتأكد من خصائص سلبية، استخدام استجابات الجهد الصغيرة التي تصل إلى حالة مستقرة ولها19،،من16الحالي الجهد علاقة خطية20. تجنب تسجيل من الألياف مع العصبية التالفة أو غير صحية، وهذه الألياف قد تردد مشروعات > 3 هرتز.
- المقبل، أدخل المشبك الجهد اثنين-القطب الواحد إرشادات الشركة المصنعة. ألياف الجهد-المشبك في إمكانات غشاء من-85 أم. إعدادات المشبك الجهد ينبغي تحقيق نسب إشارة إلى الضوضاء التي تسمح للكشف عن ميبكس.
ملاحظة: يمكن الحفاظ على التحكم الجهد الكافي مسألة. نحن نستخدم طريقتين للتقليل من هذه القضايا. أولاً، الألياف هي مخوزق داخل 100 ميكرون من اندبلت موتور كما هو موضح سابقا، وهو إطار ثابت طول هذه الألياف21. ثانيا، علينا استخدام ميزة استعادة العاصمة من مكبر للصوت. يحدد هذه الميزة مكسب المشبك جهد عالية جداً. ووصف هذا الأسلوب بالتفصيل عملنا السابق وأوجز طريقة لتقييم الجهد فرضت اندبلت16. - مرة واحدة في الجهد المشبك، تسجيل التيارات متشابك (ميبكس ويبكس) باستخدام البروتوكولات تحفيز العصب المختلفة، استناداً إلى متطلبات التجربة.
- سجل ميبكس عفوية وابكس استخدام بروتوكول تحفيز الأعصاب منخفضة التردد (≤0.5 هرتز) الذي يتيح للمرء إلى سجل ابكس دون تحوير متشابك (التيسير أو التحوير) لتقييم محتوى كانتال. تقييم تيسير متشابك أو الاكتئاب، استخدام بروتوكول تحفيز الأعصاب عالية التردد (10 نبضات بتردد 50 هرتز).
- تحفيز العصب في التردد المطلوب عن طريق وحدة عزل تحفيز، ويمكن تشغيلها باستخدام مولد نبض يتم التحكم فيها باستخدام البرمجيات اقتناء البيانات.
- وبمجرد الانتهاء من تسجيلات المشبك الجهد، العودة مكبر للصوت إلى إعداد الحالي-المشبك وإيقاف جميع التيارات وإزالة الأقطاب من الألياف. الاختيار عدم انسداد أقطاب كهربائية أو الانجراف في الجهد الأساس أثناء التسجيل.
ملاحظة: فيما يتعلق بالانجراف، الجهد الكهربائي ينبغي فولت 0 في الحل خارج الخلية، كما أنها حددت قبل إيمباليمينت الألياف. على سبيل المثال، سيكون من غير مؤكد إذا جنحت الجهد خلال التجربة الفولتية مسجل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 8 يبين مثال البقول الحالية (الشكل 8 أ) والردود الجهد (8B الشكل) من الألياف لل واحد تحت المشبك الحالية من نوع البرية عمرها 12 أسبوع R6/2 الماوس. وجود ميبس يشير إلى أن هذه السجلات أخذت من اندبلت موتور. وتم الحصول على السجلات في حل المحلول الملحي الفسيولوجي الطبيعي. يمكن تحليل هذه السجلات الحالية-المشبك لتحديد البحث والتطويرفي و τم من أن الألياف16،،من1920.
تسجيل تمثيلية الاتفاقية الأوروبية وهما ميبكس، التي تم الحصول عليها تحت ظروف الجهد-المشبك، ويرد في الشكل 9 ألف. هو انحراف الحالية قصيرة تسبق اتفاقية البراءات الأوروبية هذا الأثر الناجم عن تحفيز الأعصاب. يمكن إجراء تحليل ميبكس وابكس أسرع مع برنامج الكشف عن الحدث. تتيح هذه الأداة أن الباحث جعل قالب التي يمكن الكشف عن الأحداث التي وقعت داخل التسجيل ثم تلقائياً. يمكن فرضه الأحداث وتصديرها إلى أي برنامج تحليل البيانات. يظهر الشكل 9B فرضه ابكس وميبكس (اقحم) من ألياف بصرية ممثل.
الشكل 1 : الموقع العام عضلة رافعة أوريس العضلات
عضلة ال يقع على السطح الظهرية من الرأس. خط منقط أحمر يبرز مسار قطع الجلد لإزالة الظهرية (A) والأفقي (ب) السطحية. تعلق ال لقاعدة للإذن، وبالتالي ينبغي أن يظل حوالي 1 ملم جلد حول قاعدة الإذن سليمة تجنب قطع ال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : يتعرض عضلة رافعة أوريس العضلات
لل (الأصفر والأخضر) يقع فقط تحت الجلد والعضلات الأكثر سطحية في منطقة مميزة. وهناك أجزاء اثنين من العضلات، الجمجمة (الأصفر) والمناطق (الأخضر) والذيلية. يخرج من خط الوسط في أول أربع فقرات عنق الرحم منطقة الجمجمة ويمتد نحو الجزء الأمامي من قاعدة صوان. للإشارة، هو خط الوسط عصابة من النسيج الضام الذي يمتد من سكابولاي (السهم الأبيض) نحو الآنف. الاتصال عضلة ال اليمنى واليسرى في خط الوسط عبر الجمجمة. جزء الجمجمة ال أوسع بكثير من الجزء والذيلية. الجزء والذيلية تعلق قرب خط الوسط في الفقرات الرابعة والخامسة من عنق الرحم ويتصل بالجزء الخلفي من قاعدة صوان. أثناء التشريح، تبقى بضعة مليمترات من الجلد حول الإذن عنقية لمنع قطع ال، التي تتميز في الشكل بخط متقطع بين قوسين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تشريح النفط الخام عضلة رافعة أوريس والعضلات المحيطة بها
بمجرد إزالة من الحيوان، هو الأنسجة المثبتة، الظهرية الجانب الأسفل (لل في الأسفل)، في سيليكون الاستومر اصطف طبق استخدام دبابيس غرامة كما هو موضح في القسم 5.3. بمجرد تأمين لأسفل الطبق، يمكن إزالة طبقات العضلات السطحية. ويشار دبوس الحشرات عبر قناة الإذن مع سهم متقطع بيضاء. وتظهر الأسهم الصفراء وضع دبوس مثالية لإزالة العضلات غير المرغوب فيها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : عضلة طبقة أدنى من مباشرة عضلة رافعة أوريس
أبرزت في الأزرق الخاطف أوريس طويلة (العال) باللون الأحمر هو سكوبولاريس أوريكولاريس (عليه السلام) واللون الأصفر هو إينتيرسكوتولاريس (ق. أ). هو ال الرئيسية، الكامنة وراء العضلات في هذه الصورة. للإشارة، يرد الإذن والجلد المحيطة بخط أسود خالص. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : دائرة نضح سيليكون الاستومر-مبطنة، والعرف
سيظهر الطبق نضح مخصصة 35 ملم تستخدم لتأمين ال للتسجيلات الكهربية (A). وقد استخدمت سيليكون الاستومر إنشاء سطح مناسبة متلهف الأنسجة. في مركز الدائرة هو منصة مدورة مفيد عندما يكون التخوزق الألياف. المنهاج يدعم ألياف العضلات من أسفل عند تطبيق قوة الهبوط مع أقطاب أثناء إيمباليمينت عملية. شكلت هذه المنصة بالسماح سيليكون الاستومر إلى نموذج للمنحنى من أنبوب مخروطي 50 مل. شريحة من هذا تقريب سيليكون الاستومر يمكن ثم يتم لصقها على الجزء السفلي من الدائرة مع أكثر سيليكون الاستومر. يبين تمثيل أوجز الطبق، فضلا عن طريقة عرض على الجانب B C حيث يمكن رؤية الدائرة التروية بأكثر وضوح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : الكهربية تجربة التشكيل
يقام قطب قطبين صغيرة في مكان مع مناور مشتركة الكرة مغناطيسية لتحفيز العصب من ال. يمكن جعل مرحلة مجهر بسهولة عقد منبر مغناطيسي باستخدام مادة لاصقة مغناطيسية (كما يمكن العثور على الحرف أو متجر لأجهزة الكمبيوتر لصنع مغناطيس الثلاجة). كما هو موضح هي هيدستاجيس واقطاب المتمركزة أعلاه نموذج لل. أداة هامة الماء الغمر، الهدف مشطوف مع مخروط غمس سيراميك، كما هو موضح. نهاية مشطوف يسمح للموضع الكهربائي أسهل ومواد السيراميك يقلل من الضوضاء الكهربائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : تحديد الوصلات العصبية العضلية
إظهار كافة الصور ال ملطخة 5 ميكرومتر 4-دي-2-آسيا والمحيط الهادئ (الأخضر) للسماح لتصور وصلات العصبية العضلية. (A) A الفرقة مشرق من الوصلات العصبية العضلية يمكن أن ينظر إليها (الأسهم الصفراء) عند عرض العضلات من خلال هدف X 10. يمكن أيضا رؤية محاور عصبية التفريع كما هو مبين بالسهم الأبيض متقطع. (ب) الصغيرة [كنفوكل] مكدسات (5 × 1 ميكرومتر) من الوصلات العصبية العضلية الثلاثة (الأسهم الصفراء). ألياف العضلات صحية يكون التصدعات واضحة، فضلا عن العديد من ميونوكلي التي تظهر كبقع داكنة على طول ساركوليما الألياف (الأسهم البيضاء). وكثيراً ما يمكن ملاحظتها محاور عصبية إينيرفاتينج الوصلات العصبية العضلية كذلك. (ج) الألياف مع مفترق العضلية الملون هو مخوزق مع الأقطاب الكهربائية الزجاجية. قد تعززت الأقطاب مع تسليط الضوء أبيض حيث أنه يمكن أن ينظر إليها بسهولة أكبر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8 : الجارية-المشبك تسجيل خصائص الغشاء
حقن البقول الحالية (A) والغشاء الناتجة عن الاستجابات المحتملة (ب) مسجل من الألياف واحد من ال حمم في المحلول الملحي الفسيولوجي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 9 : تسجيلات المشبك الجهد الكهربائي اثنين
تتبع خام الاتفاقية الأوروبية وهما ميبكس المسجلة في يومين-القطب الجهد-المشبك (A). فرضه ابكس وميبكس (اقحم) من ألياف بصرية واحدة (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ووصف هنا هو إعداد واستخدام الماوس لل العضلات لقياس الإرسال العصبية العضلية في ظل الظروف الحالية أو الجهد المشبك. وهناك عدة نقاط هامة النظر لتشريح خارجاً ال. يمكن تنظيف النسيج الضام الزائدة من الإيدز العضلات في إيمباليمينت الكهربائي، كما الأقطاب عائقة النسيج الضام عند وضعها إيمباليمينت. ومع ذلك، فقط إزالة الأنسجة الضامة التي يمكن اتخاذها بعيداً بسهولة إلى الحد من فرص إلحاق الضرر العضلات. يجب أن يتم عزل العصب مع الرعاية لأنها حساسة جداً. لتجنب إتلاف العصب، أنها مفيدة لترك بعض الأنسجة المحيطة تعلق على نهاية الأعصاب التي من خلالها يمكن وضع رقم pin لتأمين العصب للطبق. أيضا، الحرص على عدم سحق العصب عند تحديد المواضع مشجعا العصب. وأخيراً، المهم بالترتيب الذي يتم مخوزق أقطاب كهربائية في الألياف. ليس من السهل أن أسعد مسرى كليلة وينبغي أن يكون مخوزق أولاً. مسرى صراحة إذا كانت مخوزق مسرى حاد أولاً، يمكن أن يدفع الألياف العضلية قبل أن يثقب الغشاء، مما قد يتسبب في مسرى حادة للخروج من الألياف. وهذا سوف يجعل من الضروري على أسعد الألياف مرة ثانية مع مسرى الحاد الذي قد يتسبب في أضرار لا داعي لها غشاء. من المفيد أيضا أن تستخدم مكبر للصوت يمكن قياس في نفس الوقت الحالية والجهد الكهربائي يمر حاليا حيث أنه يمكن ملاحظة انحراف سلبي في غشاء المحتملة، مما يشير إلى أنه قد تم مخوزق الكهربائي.
ميزة واحدة من ال يمكن أن يكون مفيداً هو القدرة على إزالة كل العضلات في نفس الوقت. وهذا يمكن أن تكون كبيرة لأداء تجارب الكهربية والبيولوجيا الجزيئية في الحيوان نفسه. يمكن أن يتحقق هذا عن طريق اتباع أساسا نفس البروتوكول الموصوفة هنا مع تغييرات طفيفة. اتبع كافة الخطوات تحت البنود 1-3 القيام بكل ما وصف في الجانب الأيمن، وكذلك اليسار. في الخطوة 4، فمن الأفضل أن تبدأ القطع في الجانب فينترولاتيرال من الإذن اليمنى لإزالة العضلات. كما هو موضح سابقا، تبقى دائماً ريش ضغط ضد الجمجمة قطع عميق قدر الإمكان ترك عضلات أدنى تعلق على ال. تواصل قطع نحو الإذن اليمنى في الماضي خط الوسط، إبقاء شفرة العميق قدر الإمكان. عند هذه النقطة، بقية الإجراء كما هو موضح في هذا البروتوكول، إلا تنفيذ الخطوات المتبقية على كلا العضلات. بمجرد قد تم تنظيف العضلات، يمكن قطع واحد لل بعيداً والمجمدة للتحليل الجزيئي لاحقاً وأخرى يمكن استخدامها للكهربية. فإنه سيكون من الصعب القيام بدراسات الكهربية مع كلا عضلات الحيوان نفسه. للقيام بذلك، يجب قطع خط الوسط لفصل العضلات والقيام المرجح أن ذلك سيضر بعض ألياف العضلات.
ال منذ فترة طويلة تستخدم لدراسة انتقال العضلية نظراً لطبيعته رقيقة تسمح بسهولة تحديد اندبلاتيس موتور وممتازة السابقين فيفو نضح1،،من34،5 6، ،،من78. بالإضافة إلى استخدام 4-دي-2-آسيا والمحيط الهادئ، ومجموعات أخرى استخدمت مترافق رهودامين بونجاروتوكسين في تركيزات منخفضة22. وقد استخدمنا ال للامتحانات الكهربية وبورينيرجيك مما يشير إلى وجود عيوب في مرض هنتنغتون16،20. ال أيضا مثالية لدراسات التصوير خلية يعيش. على سبيل المثال، استخدمت عدة دراسات ال لقياس حويصلة متشابك الإفراج وامتصاص،من2324. يمكن أن يتم ذلك باستخدام الأصباغ، مثل وزير الخارجية 1-43.
لأنه يمكن ملاحظة اندبلاتيس بسهولة مع وصمة عار فلورسنت، يمكن أن توضع أقطاب كهربائية بالقرب من اندبلت السيارات داخل ثابت طول الألياف العضلية. موضع القطب في اندبلت واستخدام نظام امتثال عالية الجهد الكهربائي اثنين-المشبك تمكن المحققون التحكم الكامل اندبلت المحتملة مع أقل من 1% الخطأ16. هذا يمكن أن يكون هاما لأن التصويبات التي تستخدم عادة للجمع غير الخطية من إمكانات متشابك المسجلة تحت الظروف الحالية-المشبك10 لا تراعي التغيرات في الغشاء بوستسينابتيك الناجمة عن الظروف التجريبية و/أو حالة المرض. على سبيل المثال، انخفاض كوندوكتانسيس اندبلت يستريح سوف تضخيم إمكانيات بوستسينابتيك19، حتى تلك التي تصحح للجمع غير الخطية. على النقيض من ذلك، فرضت الجهد التيارات بوستسينابتيك لا تخضع لأخطاء التجميع غير الخطية، وهي مستقلة عن خصائص الغشاء بوستسينابتيك. مما يدل على هذا، وقد أظهرنا مؤخرا النتائج المتناقضة من إمكانات اندبلت مقارنة بالتيارات المسجلة من فرط منفعل مرض هنتنغتون الهيكل العظمى والعضلات16.
ميزة مفتاح نهائي من استخدام ال دراسة انتقال الأعصاب أن التسجيلات من المشبك مفردة. انتقال العصبية العضلية وسجل من واحدة، اندبلت تماما الجهد فرضت يوفر بعض البيانات الأكثر تفصيلاً ودقة على انتقال متشابك المتاحة حاليا، ومثالي للنمذجة وكشف مدى تعقيد متشابك علم وظائف الأعضاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور مارك م. الأغنياء ودانيال ميراندا لتعليقات تحريرية، أحمد خيدراكي للمساعدة في إنشاء هذا الأسلوب، وجامعة ولاية رأيت للدعم المالي (بدء تشغيل الصندوق إلى A.A.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. The anatomy of the rat. , Hafner Pub. (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. Electric current flow in excitable cells. , Clarendon Press. (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
