Summary
Protokollet beskrivs i detta dokument använder mus levator auris longus (LAL) muskeln att spela in spontana och nerv-framkallat postsynaptiska potentialer (ström-clamp) och strömmar (spänning-clamp) vid den neuromuskulära förbindelsen. Användningen av denna teknik kan ge viktiga insikter i mekanismer av synaptisk transmission under normal- och sjukdom.
Abstract
Det här protokollet beskriver en teknik att registrera synaptisk transmission från den neuromuskulära förbindelsen ström-klämma och spänning-clamp villkor. En ex vivo -förberedelse av levator auris longus (LAL) används eftersom det är en tunn muskel som ger enkel visualisering av den neuromuskulära förbindelsen för mikroelektrod impalement på den motoriska endplate. Denna metod tillåter inspelning av spontana miniatyr endplate potentialer och strömmar (mEPPs och mEPCs), nerv-framkallat endplate potentialer och strömmar (EPPs och EPCs), samt den motoriska endplate membran egenskaper. Resultat från denna metod inkluderar kvantfysikaliska innehållet (QC), antalet vesikler release webbplatser (n), sannolikheten för vesikler release (prel), synaptic underlättande och depression, samt muskel membran tidskonstanten (τ m) och ingångs inresistans. Tillämpningen av denna teknik till musmodeller av mänskliga sjukdomar kan belysa viktiga patologier i sjukdomstillstånd och identifiera nya behandlingsstrategier. Av fullt spänning-fastspänning en enda synaps, ger denna metod en av de mest detaljerade analyserna av synaptisk transmission för närvarande tillgängliga.
Introduction
Studera synaptisk transmission vid den neuromuskulära förbindelsen ger insikter om dynamiska relationen mellan nervsystemet och skelettet muskulös system och är en utmärkt modell för att pröva synaptic fysiologi. Den levator auris longus (LAL) är en tunn muskel, möjliggör de neuromuskulära korsningarna att visualiseras enkelt. Tidigare rapporter har beskrivit använda LAL undersöka synaptic droger och toxiner och har präglat de skeletala muskelfiber typ egenskaperna av LAL1,2. Många studier har använt LAL för att undersöka neuromuskulär fysiologi3,4,5,6,7,8. För elektrofysiologi, möjlighet att enkelt följa LAL neuromuskulära korsningar tillåter för korrekt placering av mikroelektroder på den motoriska endplate samt reducerar kraftigt klämma rymdfrågor i inspelningen synaptisk transmission. Aktuellt-clamp inspelningar av muskel membran egenskaper, såsom membran tidskonstant τ (m) och Ingångsmotstånd (Ri) erhålls lätt. Dessa egenskaper kan dessutom mätas från samma muskelfibrer används för att registrera neuromuskulär transmission, vilket möjliggör en direkt jämförelse av synaptic funktion till muskel membran egenskaper. Analys av dessa data kan ge viktiga insikter i de fysiska mekanismerna för många neuromuskulära sjukdomar och påstår av förändrad verksamhet.
En viktig aspekt av den teknik som beskrivs här är användningen av spänning-klämma för synaptic inspelningar, som inte omfattas av de icke-linjära stött i ström-klämma och är oberoende av muskel membran egenskaper. Fördelarna med att använda spänning-klämma i motsats till nuvarande-clamp för att undersöka neuromuskulär transmission fastställdes genom banbrytande insatser i 1950-talet9. Under nuvarande-klämma är EPPs som överskrider 10-15 mV i amplitud inte en linjär produkt av fredsprocessen amplitud9. Till exempel, om den genomsnittliga fredsprocessen är 1 mV, en EPP 5 mV kan antas vara produkten av 5 mEPPs (QC 5); medan en EPP 40 mV kommer att vara en produkt av mer än 40 mEPPs. Denna icke-linjäritet på större EPPs uppstår eftersom den drivande kraft för EPP, som är skillnaden mellan membranet potential och jämvikt potential för acetylkolin receptorn (~ -10 mV), väsentligen minskar under stora EPPs. Problemet undviks i spänning-clamp experiment eftersom muskel membranpotentialen inte ändras under spänning-clamp experiment. En nackdel är att spänning-clamp experiment är tekniskt svårare att slutföra än nuvarande-clamp inspelning. Med detta i åtanke utvecklat McLachlan och Martin en enkel matematisk korrigering som står för icke-linjära i ström-clamp inspelningar av EPPs10. Korrigeringarna fungerar bra11,12,13, men ännu viktigare, antar att muskel membran egenskaper inte störts.
De muskel membran egenskaperna är särskilt viktigt att överväga om studera villkor eller sjukdomstillstånd som stör muskeln. Skelettmuskulaturen från R6/2 transgena modell av Huntingtons sjukdom är exempelvis hyperexcitable på grund av en gradvis minskning i vilande klorid och kalium strömmar14,15. Följaktligen, förstärks mEPPs och EPPs i R6/2 skelettmuskulaturen. Visst, ytterligare faktorer kan förändra mEPPs och EPPs. Arbeta med en annan modell av HS möss (R6/1) Funna förändringar i EPPs som verkade vara relaterade till SNARA-proteiner8. För att bedöma de mekanismer som orsakar förändrad neuromuskulär transmission, skulle det vara fördelaktigt att eliminera effekterna av förändrade muskel membran egenskaper med hjälp av en spänning-klämma. I en färsk studie studerades den R6/2 neuromuskulär transmissionen villkor både ström - och spänning-klämma med den teknik som beskrivs häri. Helheten av den motoriska gavlar var spänning-fastklämd med mindre än 1% fel genom att placera två mikroelektroder inom konstanten längd av endplate16. Det visades att spänning-klämma och korrigerade ström-clamp records gav kontrasterande mätningar av neuromuskulär transmission i R6/2 muskel. Detta belyser att det kan vara svårt att korrigera EPPs för icke-linjära om muskel membran egenskaper har ändrats och visar fördelarna med att få spänning-clamp-poster som är oberoende av muskel membran egenskaper. Det protokoll som presenteras häri är idealisk för att undersöka villkor eller sjukdomstillstånd som påverkar synaptisk transmission och postsynaptiska membran egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden utfördes enligt djur vård och användning kommittén av Wright State University.
1. mus dödshjälp
- I ett dragskåp, Placera musen i en lufttät glas anesthetizing kammare.
- Exponera musen via inandning till en dödlig dos av isofluran (mättar eller ~ 25%). Låt musen i kammaren tills ingen andning kan observeras.
- Ta bort musen från kammaren och utföra en cervikal dislokation som en sekundär metod för dödshjälp.
2. borttagning av hår från dorsala ytan av huvud, nacke och rygg
- Använda en rakapparat för att ta bort flesta av hår på den dorsala ytan på huvud, nacke, och baksidan av musen. Också, ta bort håret runt och på vänster öra.
Obs: var försiktig när du rakar huden runt öronen, huden kan fastna i bladen av rakapparaten och kan skada underliggande muskelvävnad. - Gälla den rakade området ta bort återstående håret Hårborttagningscreme med en bomullspinne. Vänta ca 1 min och skölj hårborttagningskräm med vatten och en squeeze tvättflaska, då borsta bort eventuella resterande grädde eller hår med hjälp av en bomullspinne och klappa huden torr.
3. ta bort huden för att exponera Levator Auris Longus muskeln
- I stereo dissekera Mikroskop, göra ett litet snitt (bara djup nog att penetrera huden) på baksidan av musen på nivån för scapulae. Skära i huden med mikro dissektion sax, efter sökvägen som visas i figur 1A-B.
- Med fin pincett (t.ex. nr 5), dra upp huden längs snittet nära scapulae. Med våren sax, klippa bindväv att separera huden från underliggande muskelvävnad samtidigt närmar sig örat. Ännu viktigare, skär bindväv med bladen pekade in i huden för att undvika oavsiktlig kapning av exponerade muskelvävnad.
- Med jämna mellanrum BEGJUTA exponerade muskeln med en fysiologisk koksaltlösning lösning, till exempel följande Na+ externa bufferten som består av (i mM): 144 NaCl, 4 KCl, 1,2 CaCl2, 0.6 MgCl2, 5 glukos, 1 NaH2PO4, pH 7,4 med NaOH, och har en osmolalitet på 300 ± 5 mmol/kg. När bindväven har skurits i vänstra örat, skära huden runt örat för att ta bort huden helt från musen och kasta den.
Obs: LAL fäster till basen på örat och kan lätt skadas när du tar bort huden. Det är bra att lämna ca 1 mm av huden runt basen på örat för att undvika skärning i LAL.
4. avlägsnande av Levator Auris Longus muskeln och omgivande vävnad
- Med våren sax, börja med att skära muskler som är underlägsen LAL, som ansluter till ryggrads-kolonnen mellan scapulae. Börja vid det högra skulderbladet, precis till höger om mittlinjen, och skär mot rostralt slutet av musen, medan återstående på höger sida om mittlinjen. Fortsätta skära ända fram till slutet av muskelvävnaden på kraniet.
Obs: LAL är mest ytliga muskeln ansluten till den mediala sidan av örat och mittlinjen, som visas i figur 2. För ytterligare bilder visar en bok av E.C. Greene17 utmärkt, handritade bilder av LAL. - Använd tången att greppa skära vävnaden omedelbart till höger om mittlinjen, sedan försiktigt lyfta och börja skära vävnaden mot vänster öra med blad av saxen pressas mot kraniet ta bort flera lager av muskler som är sämre än den vänstra LAL. Lämna alla lager fäst tillfälligt för att undvika oavsiktligt skär LAL under borttagning.
- Snitt med blad och pressas mot kraniet att undvika skära den nerv som innerverar de LAL, som sveper runt hörselgången, och skriver in musklerna på den mediala sidan av örat. Fortsätta skära genom hörselgången, hålla så mycket av den nerv som bifogas som möjligt.
Obs: Den nerv som levererar LAL grenar av ansiktsnerven och bör bevaras som den kommer att användas senare under proceduren. - Skär den fettvävnad som ligger strax bortom den öra kanalen längs samma väg visas i figur 1B på den ventrolaterala delen av örat. Dessutom skär längs vänstra skulderbladet som var gjort på höger sida ta bort muskeln helt från musen.
5. Levator Auris Longus muskel isolering
- Placera LAL och omgivande vävnad, i en behållare. Använd en behållare där dissekerade vävnaden kan fästas på botten, såsom en petriskål med silikon elastomer botten. Bada och tvätta ofta vävnaden i en fysiologisk koksaltlösning lösning.
- Klippte av pinna av örat längs basen av örat, lämnar den brosk delen av örat bifogas LAL. Vänd muskeln så att den sämre sidan är vänd uppåt (LAL på botten av skålen).
- Placera en PIN-kod, till exempel en insekt pin, genom hörselgången att hålla prep på plats. Sedan använda mindre stift, stift den återstående vävnaden på motsatt sida av mittlinjen av LAL. Med pincett, dra försiktigt huden på den laterala delen av örat att sträcka muskeln ut och placera ett litet stift genom huden. Upprepa detta steg tills vävnaden är väl säkrad i skålen, som visas i figur 3.
Obs: Små dissektion pins kan göras genom att skära tips av akupunktur nålar till önskad längd. Dessa små stift minimera vävnadsskada och kan användas med nedsänkning i vatten Mikroskop mål med långa arbeta avstånd. - Börja ta bort musklerna (visas i figur 4), som täcker LAL (auricularis överlägsen, kidnappare auris longus, och de interscutularis), och de bundna till LAL via bindväv och är särskilt snäva nära den mittlinjen, med nr 5 pincett och våren sax.
- Med tången för att dra upp på överliggande muskellagrar, skära bindväv med bladen orienterade mot muskellagrar dras och var noga med för att undvika skärning eller Hack i LAL. Skär mot mittlinjen och sluta skära cirka tre fjärdedelar av vägen till mittlinjen. Sedan skär parallellt med mittlinjen ta bort varje muskel lager. Hålla bort muskellager tills endast LAL kvar.
- Ta bort några av de återstående bindväv som täcker de LAL, vilket underlättar impalement av elektroderna. Försiktigt använda nr 5 tång dra bindväv från LAL och skära bort det med våren sax. Bara ta bort vävnad som kan göras så enkelt utan risk att skada LAL i processen. Ta bort eventuella stora nerver som innerverar sämre muskeln skikten kvar på sämre ytan av den LAL som kan försvåra visualisering av neuromuskulära korsningar.
6. isolering av nerv
- Identifiera den nerv som innerverar de LAL använder en nervstimulator (exempelvis två platina ledningar ansluten till en pulsgenerator); Det kommer finnas flera nerver löper från hörselgången till musklerna. Tryck på nerver med den nervstimulator leverera några aktuella (nuvarande varierar runt 5 V). När muskeln kontrakt, har rätta nerven identifierats.
- Försiktigt ta vävnad nära nerven och använda våren sax för att separera nerven från vävnaden som omger örat. Minimera skador, hålla de flesta av nerven inbäddad i några omgivande vävnad, som kommer att användas senare att säkra nerven till inspelning skålen.
Obs: Den motoriska nerv som innerverar LAL ligger på den mediala sidan av hörselgången öppning. - Om du använder en bipolär stimulerande elektrod, ta bort den omgivande vävnaden endast runt om en region av nerv, distala från muskeln. Om du använder en sug elektrod, ta bort omgivande vävnad skär slutet av nerven.
Obs: Detta är en bra rastplats. Detta är en bra rastplats. Om en paus är behövs dissekerade LAL prep kan hållas i en fysiologisk lösning eller konstant perfusion för ett par timmar för att säkerställa att skadliga metaboliter inte ackumuleras. Använd en stor volym av lösningen eller konstant perfusion för att säkerställa att skadliga metaboliter inte ackumuleras. - Nästa, ta bort och överföra muskeln till en perfusion kammare för elektrofysiologi experiment under en upprätt förening Mikroskop.
Obs: Använd en perfusion kammare med en mjuk botten som vävnaden kan vara säkert fäst (figur 5A). - Fästa muskeln i ändarna (örat och mittlinjen) och längs kanten av muskeln. Placera nerven vinkelräta mot muskelfibrerna och fästa den på botten av skålen genom några överflödig vävnad som fanns kvar intakt i slutet av nerven. Hålla den vävnad som badar i en fysiologisk koksaltlösning lösning hela tiden.
Obs: Det är också bra att ha rundade, förhöjda material direkt under LAL muskelfibrerna. Detta extra stöd stöd i elektroden impalement och kan göras från en liten del av silikonelastomer gjutna i en 50 mL konisk tub liggande på sidan. Den runda delen av elastomer kan säkras till botten av perfusion kammaren med en liten mängd färskt silikon. Ett diagram av perfusion kammaren visas i figur 5B-C. Muskelfibrerna kan följa mycket tätt nyligen cast silikonelastomerer (vilket är mycket hydrofoba) och kan skadas. Det är bra att pälsen eller blockera kasta nyligen silikon med protein, liknande till blockerande steg i en immunoblot. För att blockera det, har vi inkuberas nyligen cast silikon i en koncentrerad lösning av bovint serum albumin över natten.
7. elektrofysiologi utrustning Setup
- Förbereda eller Tina alikvoter av ett färgämne som hjälp visualisera den neuromuskulära förbindelsen, såsom den mitokondriella dye 4-(4-diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium18, som är ljuskänsligt och ska förvaras åtskilt från ljus. Även Tina elektrodlösningarna. Vortex alla portioner att säkerställa att alla lösta ämnen i lösning. Förbereda en fysiologisk koksaltlösning lösning innehållande 1 µM µ-Conotoxin GIIIB (µ-CTX) och 80 µM BTS (valfritt).
- Säkra perfusion kammaren med LAL till Mikroskop scenen. Placera referenselektroden i en kopp fylld med 3 M KCl, som är ansluten till inspelning kammaren via en agar-bron. Anslut referenselektroden till förstärkaren per tillverkarens anvisningar.
- Vid denna punkt, placera den nerv-stimulerande elektroden på nerven. Använd antingen en sug elektrod eller en liten bipolär elektrod, eftersom de fungerar bra för nervstimulering.
- Placera den stimulerande elektroden så långt från muskeln som möjligt för att minimera antalet stimulering artefakter i inspelningarna.
Obs: Stimulerande elektroden bör kontrolleras med en stimulans isolering enhet som kan styra spänningen amplituden som behövs.
- Placera den stimulerande elektroden så långt från muskeln som möjligt för att minimera antalet stimulering artefakter i inspelningarna.
- Långsamt höja spänningen av vrider spänning på stimulans isolering enheten tills värkarna observeras. Den punkt vid vilken contractionen observerades först är tröskeln. När tröskeln har identifierats, anger spänningen på stimulans isolerade avdelningen att 1,5 * tröskelvärde (eller som definieras av experimentet).
Obs: Figur 6 visar muskel prep inrättas ett upprätt Mikroskop och små bipolär elektrod placerad på den nerv som använder en kulled manipulator. Det är gynnsamt att ha den lägsta spänningen för stimulering möjligt medan det fortfarande är tillräckligt över tröskeln. En lägre stimulans spänning minskar antalet stimulering artefakter under inspelningar. Också, att placera stimulerande elektroden från muskeln minskar storleken på stimulering artefakt. Ibland kommer slutet av nerven skadas från dissektion, så det kan vara nödvändigt att experimentera med var längs nerven stimulatorn ska placeras. - Ta bort den bad saltlösning och ersätta med 5 µM 4-Di-2-Asp. Exponera LAL prep till 4-Di-2-Asp i ca 10 min att uppnå adekvat fluorescens för neuromuskulära förbindelsen visualisering (figur 7).
- Förbered två elektrodlösningarna, 3 M KCl och en K+ intern lösning bestående av (i mM) 75 aspartat, 5 MgCl2, 15 Ca(OH)2, 5 ATP dinatrium, 5 phosphocreatine dinatrium, 5 glutation, 20 moppar, 30 EGTA, pH 7,2 med KOH.
Obs: Lösningarna bör förberedas i förväg. K+ interna lösningen kan förvaras i alikvoter vid-20 ° C. - Fyll drog glaset kapillär för spänningsavkännande elektroden med 3 M KCl. använda K+ interna lösningen (beredd i steg 7,6) för den aktuella förbi elektroden; Använd en smal icke-metalliska nål (~ 34 spårvidd) bifogas en 1 mL spruta att enkelt fylla glas kapillärerna. Knacka försiktigt på kapillärerna för att avlägsna luftbubblor; Kontrollera att varje fylld elektrod har ett motstånd på 10-15 MΩ.
Kontrollera och notera motståndet av båda elektroderna med programvaran data förvärv. - Efter 10 min, utbyta 4-Di-Asp lösningen med den normala Ca2 + lösningen.
8. identifiering av neuromuskulära förbindelsen med fluorescens
- Med ett upprätt Mikroskop med ljusa-standardfältet och fluorescens belysning, leta efter ett ljust band av fluorescerande grön neuromuskulära korsningar kör vinkelrätt mot muskelfibrerna längs prep som visas i figur 7A. Använd en låg förstoring nedsänkning i vatten mål (~ 10 X) för att identifiera neuromuskulära korsningar
Obs: Mikroskopet bör utrustas med en FITC-kub (Ex: 480/40, kalljusreflektor: 505LP, Em: 535/50), och LED, laser, halogenlampa eller en kvicksilverlampa för fluorescens. För att minimera foto blekning, växelvis ljusa fält och fluorescens belysning.
Obs: Detta band är oftast mer proximala till basen på örat än med mittlinjen. Bandet är den region där de neuromuskulära korsningarna är mest koncentrerad. - Växla till en högre förstoring nedsänkning i vatten mål (~ 40 X) och identifiera en neuromuskulära förbindelsen på det översta lagret av muskel att undersöka med elektrofysiologi (figur 7B).
- Säkra de fyllda pipetterna i pipett hållarna på den lämpliga headstages, per tillverkarens anvisningar. Använd micromanipulators för att placera elektroderna ovan muskel membranet inom 100 µm av den identifiera neuromuskulära förbindelsen (figur 7 c). Placera elektroderna använder främst ljusa fält mikroskopi; Använd fluorescens för att bekräfta platsen för elektroderna i förhållande till den neuromuskulära förbindelsen.
- Använd först en låg förstoring (~ 10 X) mål att lokalisera elektroderna och sedan växla till en högre förstoring (~ 40 X) mål för slutliga placering av elektroderna. Inte spetsa elektroderna i muskeln vid denna punkt, först justera elektroderna.
9. tuning och spetsa elektroderna
- När elektroderna placeras ovanför önskad fiber, noll och finjustera spänningsavkännande elektroden av bron balansering (eller en liknande strategi) och neutralisera den elektrod kapacitansen per tillverkarens anvisningar. Dessutom noll ström förbi elektroden.
- Ta med båda elektroderna ner till ytan av fibern. Långsamt justera positionen av elektroderna på väg ner till fibern så att elektroderna kvar orienterad med avseende på den neuromuskulära förbindelsen, som beskrivs i steg 8.3 och 8.4.
- Efter båda elektroderna har kontaktat ytan av muskelfibern, spetsa trubbiga ström förbi elektroden först. Använda tekniker såsom buzz (korta pulser av överskjutande kapacitans ersättning), korta strömpulser eller knacka på tabellen för att underlätta elektrod impalement.
- Övervaka signalen, med ett oscilloskop eller oscilloskop protokoll i programvaran data förvärv, tills en negativ membranpotential identifieras, vilket indikerar att elektroden har varit spetsad.
- Tryck in skarpare spänningsavkännande elektroden på muskeln till nivån för spetsad ström förbi elektroden. När båda elektroderna är i linje med varandra, spetsa spänningsavkännande elektroden med samma tekniker tillämpas med nuvarande förbi elektroden.
- Vid lyckad impalement, använda controller för förstärkaren, tillämpa en konstant negativ hålla nuvarande med nuvarande passerar elektroden att kompensera för skador membranet på grund av elektroden impalement. När cellen börjar långsamt ut mot -80 mV, öka innehavet nuvarande som behövs för att föra cellen till den önskade resting potential (dvs.-80 till -85 mV).
Obs: Undvik inspelning från fibrer som kräver en anläggning nuvarande större i absoluta tal än-25 nA i vildtyp muskel att minimera risken för inspelning från ohälsosamma fibrer. - När fibern är stabil i ett par minuter på den önskade resting potential, vidare till inspelning muskel membran egenskaper eller neuromuskulär transmission.
10. inspelning postsynaptiska membran egenskaper och synaptisk Transmission
- Börja med ström-clamp inspelningar genom att tillämpa ett lika stort antal positiva och negativa aktuella stegen att mäta de motsvarande membran spänning svar, som kommer att användas för att bestämma motor endplate Ri och τm. Passiva egenskaper, använda liten spänning svaren som når steady-state och har en linjär spänning-ström förhållandet16,19,20. Undvika inspelning från fibrer med en skadad eller ohälsosamma nerv, sådan fibrer har en frekvens som fredsprocessen > 3 Hz.
- Nästa, ange två-elektrod spänning-clamp per tillverkarens anvisningar. Spänning-clamp fibrer på en membranet potential -85 mV. Spänning-clamp inställningar bör uppnå signal-brus-förhållandet att möjliggöra upptäckt av mEPCs.
Obs: Att upprätthålla tillräcklig spänningskontroll kan vara ett problem. Vi använder två metoder för att minimera problemen. Först, fibrerna är spetsad inom 100 µm av den motoriska endplate som beskrivs tidigare, vilket är inom längd konstanten av dessa fibrer21. För det andra, vi använder funktionen för DC-återställning av förstärkaren. Denna funktion sätter en mycket hög spänning-clamp vinst. Vårt tidigare arbete har beskrivit denna metod i detalj och beskrivs en metod för att bedöma den spänning-fastklämd endplate16. - En gång i spänning-klämma, spela in synaptic strömmar (mEPCs och eEPCs) använder olika nervstimulering protokoll, baserat på kraven i experimentet.
- Spela in spontana mEPCs och EPCs med en låg frekvens nerv stimulering protokoll (≤0, 5 Hz) vilket gör att posten EPCs utan synaptic modulering (underlättande eller modulering) för att bedöma kvantfysikaliska innehåll. För att bedöma synaptic underlättande eller depression, använda ett högfrekvent nerv stimulering protokoll (10 pulser vid 50 Hz).
- Stimulera nerven på önskad frekvens via en stimulus isolering enhet, som kan utlösas med en pulsgenerator som styrs via programvaran data förvärv.
- När spänning-clamp inspelningarna är klar, återgå förstärkaren till en aktuell-klämma, Stäng av alla strömmar och ta bort elektroderna från fiber. Kontrollera att elektroderna inte bli igensatta eller drift i baslinjen spänning under inspelningen.
Obs: Angående drift, elektrod spänningen bör vara 0 volt i den extracellulära lösningen, som de sattes före fiber impalement. Exempelvis skulle de inspelade spänningarna vara osäkert om spänningen drev under experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 8 visar ett exempel på de nuvarande pulserna (figur 8A) och spänning svaren (figur 8B) från en LAL fiber under nuvarande-klämman från en 12-vecka-gammal wild typ R6/2-mus. Förekomsten av mEPPs indikerar att dessa poster togs från den motoriska endplate. Posterna erhölls i normal fysiologisk koksaltlösning lösning. Dessa aktuella-clamp-poster kan analyseras för att avgöra den Ri och τm att fiber16,19,20.
En representativ inspelning av en EPC och två mEPCs, erhållits under spänning-clamp förhållanden, visas i figur 9A. Den korta nuvarande deformationen föregår EPC är den artefakt som orsakas av nervstimulering. Analys av mEPCs och EPCs kan göras snabbare med händelse upptäckt programvara. Detta verktyg gör det möjligt för forskaren att göra en mall som du kan sedan automatiskt identifiera händelserna inom inspelningen. Händelserna kan vara ovanpå och exporteras till någon data analys programvara. Figur 9B visar överlagrade EPCs och mEPCs (infälld) från en representativ fiber.
Figur 1 : Allmänna läge av den levator auris longus muskel
LAL muskeln ligger på den dorsala ytan av huvudet. Den röda streckade linjen visar sökvägen för att skära huden för borttagning på den dorsala (A) och (B) mantelyta. I LAL fäster till basen på örat, alltså cirka 1 mm av huden runt basen av örat bör förbli intakt att undvika skärning i LAL. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Utsatt levator auris longus muskel
I LAL (gul och grön) ligger precis under huden och är mest ytliga muskeln i det markerade området. Det finns två delar av muskeln, den kraniala (gul) och kaudalt (grön) regioner. Kraniella regionen framgår mittlinjen på första fyra halskotor och kör mot den främre delen av basen av hjärtörat. För referens är mittlinjen ett band av bindväv som går från scapulae (vit pil) mot näsan. Höger och vänster LAL muskeln ansluter vid mittlinjen över kraniet. Den kraniella delen av LAL är mycket bredare än den kaudala delen. Den kaudala delen fäster nära mittlinjen på fjärde och femte cervikala kotorna och ansluter till den bakre delen av basen av hjärtörat. Under dissektion, hålla ett par millimeter av huden runt örats brosk att förhindra kapning av LAL, som är markerade i figuren av en parentes streckad linje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Rå dissekering av den levator auris longus och omgivande muskler
När bort från djuret, är vävnaden fästa, dorsala sida ner (LAL på botten), i en silikon elastomer fodrad skål med fina pins som beskrivs i avsnitt 5.3. När säkrat till botten av skålen, kan överliggande muskeln skikten tas bort. En insekt stift genom hörselgången indikeras med en vit streckad pil. De gula pilarna visar perfekt pin placering för borttagning av oönskade muskler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Muskellagrar direkt sämre än den levator auris longus
Markerade i blått är den kidnappare auris longus (AAL), i rött är den auricularis scupularis (AS) och i gult är den interscutularis (IS). I LAL är viktigaste, underliggande muskel i denna bild. För referens beskrivs örat och omgivande hud av en solid svart linje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Silikon-elastomer-fodrade, anpassade perfusion kammare
Visas är anpassade 35 mm perfusion skålen som används för att säkra LAL för elektrofysiologiska inspelningar (A). Silikonelastomerer har använts för att skapa en yta lämplig för tynar vävnaden. I mitten av kammaren är en rundad plattform som är användbar när impaling fibrerna. Plattformen stöder muskelfibrerna från undersidan när tillämpa en nedåtriktad kraft med elektroder under impalement bearbeta. Denna plattform formades genom att låta silikonelastomerer form till kurvan i en 50 mL konisk tub. En bit av detta rundade silikon elastomer kan sedan limmas längst ned i kammaren med mer silikonelastomerer. En konturerad representation av skålen samt en sidan-mot-vy visas i B och C där perfusion kammaren kan ses tydligare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Elektrofysiologi experimentera set-up
En liten bipolär elektrod hålls på plats med en magnetisk kulled manipulator att stimulera nerven till LAL. Mikroskop scenen kan göras för att enkelt hålla en magnetisk plattform med hjälp av en självhäftande magnetiska material (som kan hittas på ett hantverk eller järnaffär för att göra kylskåpsmagneter). Också visat är headstages och elektroder placerade ovanför en LAL-provet. Ett viktigt instrument är nedsänkning i vatten, avfasade mål med en keramisk doppa kon, som visas. Avfasade slutet tillåter enklare elektrodplacering av och det keramiska materialet minimerar elektriskt brus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Neuromuskulära förbindelsen ID
Alla bilder visar de LAL färgas med 5 µM 4-Di-2-Asp (grön) som möjliggör visualisering av neuromuskulära korsningar. (A) A ljusa band av neuromuskulära korsningar kan ses (gula pilar) när du tittar på muskeln genom ett 10 X-objektiv. Förgrenade axoner kan också ses som indikeras av en vit streckad pil. (B) små confocal stackar (5 x 1 µm) av tre neuromuskulära korsningar (gula pilar). Friska muskelfibrer har tydliga strimmor samt flera myonuclei som visas som mörka fläckar längs sarcolemma av fiber (vita pilar). Axoner innervating de neuromuskulära korsningarna kan ofta observeras också. (C), en fiber med en betsad neuromuskulära förbindelsen som är spetsad med glaselektroderna. Elektroderna har förbättrats med en vit högdager så att de kan ses lättare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Aktuella-clamp inspelning av membran egenskaper
Injicerade strömpulser (A) och den resulterande membran som potentiella svaren (B) inspelade från en fiber till LAL badade i fysiologisk koksaltlösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9 : Två-elektrod spänning-clamp recordings
En rå spår av en EPC och två mEPCs spelade in två-elektrod spänning-clamp (A). Överlagrade EPCs och mEPCs (infälld) från en enda fiber (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrivs här är utarbetandet och användningen av musen LAL muskel för mätning av neuromuskulär transmission ström - eller spänning-clamp villkor. I området i närheten finns det flera viktiga punkter att överväga inför dissekera ut LAL. Rengöring överflödig bindväv från muskler aids i elektroden impalement, som elektroderna kan haffa bindväv när positionering dem för impalement. Dock bara ta bort bindväv som kan tas bort enkelt att begränsa risken för skada muskeln. Isolering av nerven bör utföras med omsorg eftersom det är mycket känslig. För att undvika nervskador, är det bra att lämna en del av omgivande vävnad fäst vid slutet av nerv genom vilken en PIN-kod kan placeras för att skydda nerven till skålen. Sköter även, inte för att krossa nerven när positionering nervstimulator. Slutligen är det viktigt att den ordning som där elektroderna är spetsad i fibern. Trubbiga elektroden är inte så lätt att spetsa och bör vara spetsad först. Om skarpa elektroden var spetsad först, kan trubbiga elektroden driva muskelfibern innan den genomborrar membranet, eventuellt orsakar vassa elektroden att komma ut ur fibern. Detta skulle göra det nödvändigt att spetsa fiber en andra gång med skarpa elektroden som skulle orsaka onödiga membran skada. Det är också bra att förstärkaren används samtidigt kan mäta den ström och spänning av nuvarande passerar elektroden så att en negativ nedböjning i membranet potential kan observeras, vilket indikerar att elektroden har varit spetsad.
En funktion av den LAL som kan vara till nytta är förmågan att ta bort båda muskler samtidigt. Detta kan vara bra för att utföra elektrofysiologi och molekylärbiologiska experiment i samma djur. Detta kan åstadkommas genom att följa i huvudsak samma protokoll som beskrivs här med smärre ändringar. Följ alla steg under rubrikerna 1-3 gör allt beskrivs på såväl höger som vänster. I steg 4 är det bäst att börja skära på höger öra ta bort musklerna ventrolaterala sida. Som tidigare beskrivits, alltid hålla bladen pressas mot skallen att skära så djupt som möjligt lämnar sämre muskler kopplade till LAL. Fortsätta att skära mot höger öra förbi mittlinjen, att hålla klingan så djupt som möjligt. Vid denna punkt, resten av förfaranden som beskrivs i detta protokoll, endast de återstående stegen på båda muskler. När musklerna har rengjorts, en LAL kan skäras bort och frysta för senare molekylär analys och den andra kan användas för elektrofysiologi. Det skulle vara svårt att utföra elektrofysiologi studier med både muskler av samma djur. Till gör så, mittlinjen måste skäras till separata musklerna och göra så kommer sannolikt att skada vissa muskelfibrer.
I LAL har länge använts för att undersöka neuromuskulär transmission eftersom dess tunna natur tillåter för enkel identifiering av motoriska gavlar och utmärkt ex vivo perfusion1,3,4,5 ,6,7,8. Förutom användning av 4-di-2-asp, har andra grupper använt rhodamin-konjugerad bungarotoxin vid låga koncentrationer22. Vi har använt LAL för elektrofysiologiska undersökningar, purinergic signalering och defekter i Huntingtons sjukdom16,20. I LAL är också perfekt för live-cell imaging studier. Flera studier har till exempel används LAL för att mäta synaptiskt vesikelprotein utsläpp och upptag23,24. Detta kan göras med hjälp av färgämnen, såsom FM 1-43.
Eftersom gavlar kan enkelt observeras med en fluorescerande fläck, kan elektroderna placeras i närheten av den motoriska endplate inom längd konstanten av muskelfibern. Elektrodplacering vid endplate och användning av ett system för två-elektrod spänning-klämma av hög efterlevnad kan utredarna att helt styra den potentiella med mindre än 1% fel16endplate. Detta kan vara viktigt eftersom de vanliga korrigeringarna för icke-linjära summering av synaptic potentialer registreras enligt nuvarande-clamp villkor10 inte hänsyn till förändringar i det postsynaptiska membranet som orsakas av experimentella förhållanden eller sjukdomstillstånd. Reducerad vila endplate conductances kommer till exempel att förstärka postsynaptiska potentialer19, även de korrigerade för icke-linjära summering. Däremot spänning-fastklämd postsynaptiska strömmar utsätts inte för icke-linjära summering fel och är oberoende av postsynaptiska membran egenskaper. Demonstrera detta, har vi nyligen visat kontrasterande resultat från endplate potentialer jämfört med strömmar registreras från hyper-retbara Huntingtons sjukdom skelettmuskulaturen16.
En slutlig nyckel fördelen med att använda LAL för att studera neuromuskulär transmission är att inspelningar är från en enda synaps. Neuromuskulär transmission inspelade från en enda, helt spänning-fastklämd endplate innehåller några av de mest detaljerade och korrekta uppgifterna om synaptisk transmission för närvarande tillgängliga, vilket är idealiskt för modellering och nysta upp komplexiteten i synaptic fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Mark M. Rich och Daniel Miranda för redaktionella kommentarer, Ahmad Khedraki för att hjälpa upprätta denna teknik, och Wright State University för finansiellt stöd (start fond till A.A.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. The anatomy of the rat. , Hafner Pub. (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. Electric current flow in excitable cells. , Clarendon Press. (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
