Summary
Il protocollo descritto in questo documento utilizza il muscolo di longus di levator auris (LAL) del mouse per registrare spontanea e nervo-evocata potenziali postsinaptici (corrente-clamp) e correnti (tensione-clamp) alla giunzione neuromuscolare. Utilizzo di questa tecnica può fornire spunti chiave nei meccanismi della trasmissione sinaptica in condizioni normali e malattia.
Abstract
Questo protocollo descrive una tecnica di trasmissione sinaptica record dalla giunzione neuromuscolare in condizioni di corrente- e tensione-morsa. Una preparazione ex vivo di levator auris longus (LAL) è usata perché è un muscolo sottile che fornisce una visualizzazione semplice della giunzione neuromuscolare per impalamento microelettrodo presso il terminale del motoneurone. Questo metodo consente la registrazione dei potenziali spontanei miniatura della piastra laterale e correnti (mEPPs e mEPCs), i potenziali evocati del nervo della piastra laterale e correnti (EPPs ed EPCs), come pure le proprietà della membrana dei motoneurone. Risultati ottenuti da questo metodo includono il contenuto quantal (QC), numero di siti di rilascio delle vescicole (n), probabilità di rilascio delle vescicole (prel), facilitazione sinaptica e depressione, nonché la costante di tempo della membrana muscolare (τ m) e la resistenza di ingresso. Applicazione di questa tecnica di modelli murini di malattia umana può evidenziare patologie chiave negli Stati di malattia e aiutare a identificare nuove strategie terapeutiche. Dal completamente tensione-serraggio di una singola sinapsi, questo metodo fornisce una delle analisi più dettagliate della trasmissione sinaptica attualmente disponibili.
Introduction
Studiando la trasmissione sinaptica alla giunzione neuromuscolare fornisce approfondimenti il rapporto dinamico tra i sistemi nervosi e scheletrici muscolari ed è un eccellente modello per l'esame di fisiologia sinaptica. Il levator auris longus (LAL) è un muscolo sottile, permettendo per le giunzioni neuromuscolari possano essere facilmente visualizzati. Rapporti precedenti hanno descritto la convenienza di usando il LAL per esaminare le tossine e droghe sinaptiche e hanno caratterizzato le caratteristiche del tipo di fibra muscolare scheletrica del leone1,2. Numerosi studi hanno utilizzato la LAL per esaminare la fisiologia neuromuscolare3,4,5,6,7,8. Per elettrofisiologia, la capacità di osservare facilmente giunzioni neuromuscolari LAL consente il posizionamento accurato dei microelettrodi presso il terminale del motoneurone e riduce notevolmente i problemi di spazio morsetto in registrazione trasmissione sinaptica. Corrente-morsetto registrazioni delle proprietà di membrana del muscolo, come la costante di tempo della membrana (τm) e la resistenza di ingresso (Ra) sono facilmente ottenute. Inoltre, queste proprietà possono essere misurate da fibre del muscolo stesse utilizzate per registrare la trasmissione neuromuscolare, consentendo un confronto diretto della funzione sinaptica per le proprietà della membrana muscolare. Analisi di questi dati può fornire spunti preziosi per i meccanismi fisici di molte malattie neuromuscolari e Stati di attività alterata.
Un aspetto fondamentale della tecnica qui descritta è l'uso di tensione-morsetto per registrazioni sinaptiche, che non sono soggetti alla non-linearità incontrate nella corrente-morsetto e sono indipendenti le proprietà della membrana muscolare. Vantaggi dell'utilizzo di tensione-morsetto al contrario di corrente-morsetto per esaminare la trasmissione neuromuscolare sono stati stabiliti dai pionieristici sforzi nel 1950s9. Sotto corrente-pinza, EPPs che superano i 10-15 mV in ampiezza non sono un prodotto lineare della ampiezza mEPP9. Ad esempio, se la media mEPP è 1 mV, un PPE di 5 mV può presumere di essere il prodotto di 5 mEPPs (QC di 5); considerando che, un PPE di 40 mV sarà il prodotto di più di 40 mEPPs. Questa non-linearità alle più grandi EPPs si verifica perché la forza motrice per il PPE, che è la differenza tra il potenziale di membrana e il potenziale di equilibrio per il recettore dell'acetilcolina (~ -10 mV), sostanzialmente diminuisce durante grande EPPs. Questo problema è evitato in esperimenti di tensione-clamp perché il potenziale di membrana muscolare non cambia durante gli esperimenti di tensione-morsetto. Uno svantaggio è che esperimenti di tensione-clamp sono tecnicamente più difficili rispetto a quello che di registrazione corrente-morsetto. Con questo in mente, McLachlan e Martin ha sviluppato una semplice correzione matematica che rappresenta il non-linearità in corrente-morsetto registrazioni di EPPs10. Le correzioni funzionano bene11,12,13, ma la cosa importante, si supponga che le proprietà della membrana muscolare non sono stati interrotti.
Le proprietà della membrana muscolare sono particolarmente importante considerare se studiando condizioni o Stati di malattia che interrompono il muscolo. Ad esempio, il muscolo scheletrico da R6/2 modello transgenico della malattia di Huntington è hyperexcitable a causa di una progressiva riduzione nel riposo cloruro e potassio correnti14,15. Di conseguenza, mEPPs ed EPPs sono amplificati nel muscolo scheletrico R6/2. Certamente, i fattori supplementari possono alterare mEPPs ed EPPs. Lavorare con un modello diverso di topi del morbo di Huntington (R6/1) trovato modifiche EPPs che sembravano essere legati a proteine SNARE8. Per valutare i meccanismi che causano la trasmissione neuromuscolare alterata, sarebbe utile eliminare gli effetti di proprietà della membrana muscolare alterata tramite un morsetto di tensione. In uno studio recente, la trasmissione neuromuscolare R6/2 è stata studiata sotto entrambe le condizioni di corrente e tensione morsetto utilizzando la tecnica descritta nel presente documento. La totalità delle piastre laterali motore erano tensione-premuta con meno di 1% errore inserendo due microelettrodi all'interno la costante di lunghezza della placca motrice16. E ' stato quel morsetto di tensione corretti record corrente-morsetto ha reso a contrasto misurazioni della trasmissione neuromuscolare nel muscolo R6/2. Ciò evidenzia che può essere difficile da correggere EPPs per non-linearità, se sono state modificate le proprietà della membrana muscolare e Mostra i benefici di ottenere record di tensione-morsetto che sono indipendente dalle proprietà della membrana muscolare. Il protocollo presentato qui è ideale per l'esame di condizioni o patologie che influiscono sulla trasmissione sinaptica e le proprietà della membrana postsinaptica.
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Protocol
Animale tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la cura degli animali e uso Comitato di Wright State University.
1. Mouse eutanasia
- In una cappa, posizionare il mouse in un vetro ermetico anestetizzando camera.
- Esporre il mouse tramite inalazione di una dose letale di isoflurane (saturazione, o ~ 25%). Lascia il mouse nel vano fino a quando non respira può essere osservato.
- Rimuovere il mouse dalla camera ed eseguire una dislocazione cervicale come metodo secondario dell'eutanasia.
2. rimozione dei capelli dalla superficie dorsale della testa, collo e schiena
- Utilizzare un rasoio elettrico per rimuovere la maggior parte dei capelli sulla superficie dorsale della testa, collo e sul retro del mouse. Inoltre, rimuovere i capelli intorno e sull'orecchio sinistro.
Nota: fare attenzione quando la rasatura la pelle intorno alle orecchie, pelle possa impigliarsi nelle lame del rasoio e potrebbe danneggiare il tessuto muscolare sottostante. - Applicare crema depilatoria con un batuffolo di cotone sulla zona rasata per rimuovere i peli rimanenti. Attendere circa 1 min e risciacquare la crema depilatoria con acqua usando una bottiglia di lavaggio di squeeze, poi spazzare via qualsiasi restante crema o i capelli usando un batuffolo di cotone e picchiettare la pelle secca.
3. Togliere la pelle per esporre il muscolo di Longus di Levator Auris
- Stereo microscopio per dissezione, praticare una piccola incisione (solo profondo abbastanza per penetrare la pelle) sul retro del mouse a livello delle scapole. Tagliare la pelle usando le forbici micro dissezione, seguendo il percorso indicato in Figura 1A-B.
- Utilizzando una pinzetta (ad esempio n. 5), tirare verso l'alto la pelle lungo il taglio in prossimità della scapola. Utilizzando le forbici di primavera, tagliare il tessuto connettivo per separare la pelle dal tessuto muscolare sottostante mentre si avvicina l'orecchio. D'importanza, tagliare il tessuto connettivo con le lame rivolto verso la pelle per evitare il taglio accidentale del tessuto muscolare esposta.
- Periodicamente irrorare il muscolo esposto con una soluzione fisiologica, ad esempio il seguente buffer esterno Na+ è costituito (in mM): 144 NaCl, 4 KCl, 1,2 CaCl2, 0,6 MgCl2, glucosio 5, NaH2PO41, pH 7.4 con NaOH, e ha un'osmolalità di 300 ± 5 mmol/kg. Una volta che il tessuto connettivo è stato tagliato all'orecchio sinistro, tagliata la pelle intorno all'orecchio per rimuovere la pelle completamente dal mouse e scartarla.
Nota: La LAL attribuisce alla base dell'orecchio e può essere facilmente danneggiato durante la rimozione della pelle. È bene lasciare circa 1 mm di pelle intorno alla base dell'orecchio per evitare di tagliare il LAL.
4. rimozione del muscolo di Longus di Levator Auris e tessuto circostante
- Utilizzando le forbici di primavera, iniziare dai muscoli di taglio che sono inferiori a LAL, che collegano alla colonna vertebrale tra le scapole. Avviare alla scapola destra, appena a destra della linea mediana e tagliare verso l'estremità rostrale del mouse, pur rimanendo sul lato destro della linea mediana. Continuare a tagliare fino in fondo fino alla fine del tessuto del muscolo sul cranio.
Nota: Il Leone è il muscolo più superficiale collegato al lato mediale dell'orecchio e la linea mediana, come mostrato nella Figura 2. Per ulteriori immagini, un libro da E.C. Greene17 Mostra immagini eccellenti, disegnati a mano la LAL. - Utilizzare pinze per afferrare il tessuto tagliato immediatamente a destra della linea mediana, poi sollevare delicatamente e iniziare a tagliare il tessuto verso l'orecchio sinistro con le lame delle forbici premute contro il cranio per rimuovere diversi strati di muscolo che sono inferiori alla sinistra LAL. Lasciare tutti i livelli collegati temporaneamente per evitare di tagliarsi accidentalmente il LAL durante la rimozione.
- Taglio con lame parallelo e premuto contro il cranio per evitare di tagliare il nervo che innerva il LAL, che avvolge il condotto uditivo ed entra i muscoli dal lato mediale dell'orecchio. Continuare a tagliare attraverso il condotto uditivo, mantenendo quanto più del nervo collegato come possibile.
Nota: Il nervo che fornisce il LAL si ramifica fuori del nervo facciale e dovrebbe essere mantenuto come sarà utilizzato più avanti nella procedura. - Tagliare il tessuto adiposo che è appena passato il canale uditivo lungo lo stesso percorso indicato in Figura 1B sulla parte ventrolateral dell'orecchio. Inoltre, tagliare lungo la scapola sinistra, come è stato fatto sul lato destro per rimuovere completamente il muscolo dal mouse.
5. isolamento del muscolo di Longus di levator Auris
- Collocare il Leone e il tessuto circostante, in un contenitore. Utilizzare un contenitore in cui il tessuto dissecato può essere appuntato sul fondo, come una capsula di Petri con un fondo di elastomero di silicone. Il bagno e lavare frequentemente il tessuto in una soluzione fisiologica.
- Tagliare la pinna dell'orecchio lungo la base dell'orecchio, lasciando la parte cartilaginosa dell'orecchio attaccato il LAL. Capovolgere il muscolo in modo che il lato inferiore è rivolto verso l'alto (LAL sul fondo del piatto).
- Inserire un pin, come ad esempio un insetto pin, attraverso il condotto uditivo per tenere la preparazione sul posto. Quindi con piccoli perni, perno il tessuto restante sul lato opposto della linea mediana della LAL. Usando il forcipe, tirare delicatamente la pelle sulla parte laterale dell'orecchio per allungare il muscolo e mettete un piccolo perno attraverso la pelle. Ripetere questo passaggio fino a quando il tessuto è ben protetto al piatto, come mostrato nella Figura 3.
Nota: Perni piccolo dissezione possono essere fatto tagliando le punte degli aghi di agopuntura alla lunghezza desiderata. Questi piccoli perni minimizzano il danno al tessuto e possono essere utilizzati con obiettivi del microscopio di immersione in acqua con lunghe distanze di lavoro. - Begin rimuovendo i muscoli (illustrato nella Figura 4), che coprono il LAL (auricularis superior, abduttori auris longus e la interscutularis), e quelli associati alla LAL tramite tessuto connettivo e sono particolarmente stretti vicino il linea mediana, usando le forbici pinze e primavera n ° 5.
- Utilizzando le pinze per tirare verso l'alto lo strato muscolare sovrastante, tagliare il tessuto connettivo con le lame orientate verso lo strato di muscolo tirato e prestare attenzione per evitare il taglio o intaccare il LAL. Tagliare verso la linea mediana e interrompere il taglio di circa tre quarti della strada alla linea mediana. Quindi, taglio parallelo alla linea mediana per rimuovere ogni strato del muscolo. Mantenere la rimozione strati muscolari fino a quando rimane solo la LAL.
- Rimuovere alcuni dei rimanenti del tessuto connettivo che ricopre il LAL, che aiuta nella impalamento degli elettrodi. Utilizzare delicatamente Nr. 5 pinze per tirare il tessuto connettivo lontano il LAL e tagliare via con forbici di primavera. Rimuovere solo il tessuto che può essere fatto facilmente senza rischio di danneggiare il LAL nel processo. Rimuovere qualsiasi grandi nervi che innervano gli strati di muscolo inferiore rimanente sulla superficie inferiore della LAL che impediscono la visualizzazione delle giunzioni neuromuscolari.
6. isolamento del nervo
- Identificare il nervo che innerva il LAL utilizzando uno stimolatore del nervo (per esempio, due fili di platino collegato ad un generatore di impulsi); Ci saranno parecchi nervi in esecuzione dal canale uditivo ai muscoli. Toccare i nervi con lo stimolatore del nervo fornire alcuni corrente (corrente variano circa 5 V). Quando il muscolo si contrae, il nervo corretto è stato individuato.
- Attentamente afferrare il tessuto vicino al nervo e forbici di primavera per separare il nervo dal tessuto che circonda l'orecchio. Per minimizzare i danni, mantenere la maggior parte del nervo incorporato in qualche tessuto circostante, che verrà utilizzato in seguito per garantire il nervo per il piatto di registrazione.
Nota: Il nervo motore che innerva il Leone si trova sul lato mediale del condotto uditivo di apertura. - Se si utilizza un elettrodo stimolante bipolare, rimuovere il tessuto circostante solo attorno a una regione del nervo, distale dal muscolo. Se si utilizza un elettrodo di aspirazione, rimuovere il tessuto circostante all'estremità tagliata del nervo.
Nota: Questo è un buon punto di sosta. Questo è un buon punto di sosta. Se una pausa è necessaria la preparazione LAL dissecata possono essere mantenuta in una soluzione fisiologica o aspersione costante per un paio d'ore per assicurarsi che non si accumulano metaboliti nocivi. Utilizzare un grande volume di soluzione o costante di aspersione per assicurarsi che non si accumulano metaboliti nocivi. - Successivamente, Rimuovi e trasferire il muscolo a una camera di perfusione per esperimenti di elettrofisiologia sotto un microscopio composto in posizione verticale.
Nota: Utilizzare una camera di aspersione con un fondo soffice a cui il tessuto può essere saldamente appuntato (Figura 5A). - Perno del muscolo alle estremità (orecchio e la linea mediana) e lungo il bordo del muscolo. Posizionare il nervo perpendicolare alle fibre del muscolo e aggiungilo alla parte inferiore del piatto attraverso qualche eccesso di tessuto che è stato lasciato intatto all'estremità del nervo. Mantenere il tessuto bagnato in una soluzione fisiologica in ogni momento.
Nota: È anche utile per hanno arrotondato, elevato materiale direttamente sotto le fibre muscolari LAL. Questo ulteriore supporto aiuta a impalamento elettrodo e può essere fatto da una piccola sezione di elastomero di silicone fuso in una provetta conica da 50 mL sdraiato su un lato. La sezione arrotondata dell'elastomero può essere fissata alla parte inferiore della camera di aspersione usando una piccola quantità di silicone fresco. Un diagramma della camera perfusione è mostrato in figura 5B-C. Le fibre muscolari possono aderire molto strettamente alla recente elastomero di silicone cast (che è estremamente idrofobe) e potrebbe essere danneggiate. È utile al cappotto o blocco appena gettato in silicone con proteina, simile al blocco passo in un immunoblot. Per bloccarlo, abbiamo abbiamo incubato recentemente in silicone fuso in una soluzione concentrata di albumina di siero bovino durante la notte.
7. elettrofisiologia installazione dell'apparecchiatura
- Preparare o Disgelare aliquote di un colorante per facilitare la visualizzazione della giunzione neuromuscolare, come la tintura mitocondriale 4-(4-diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium18, che è sensibile alla luce e devono essere conservati lontano dalla luce. Inoltre, scongelare soluzioni elettrodiche. Vortice tutte le aliquote per garantire che tutti i soluti sono in soluzione. Preparare una soluzione fisiologica contenente 1 µM µ-conotossina GIIIB (µ-CTX) e 80 µM BTS (opzionale).
- Fissare la camera di aspersione con il leone per il tavolino del microscopio. Inserire l'elettrodo di riferimento in una tazza riempita con 3M KCl, che è collegata alla camera di registrazione tramite un ponte di agar. Collegare l'elettrodo di riferimento per l'amplificatore secondo le istruzioni del produttore.
- A questo punto, posizionare l'elettrodo di stimolazione del nervo sul nervo. Utilizzare un elettrodo di aspirazione o un piccolo elettrodo bipolare, come essi funzionano bene per la stimolazione del nervo.
- Posizionare l'elettrodo stimolante come lontano il muscolo come possibile per ridurre al minimo il numero di artefatti di stimolazione nelle registrazioni.
Nota: L'elettrodo stimolante dovrebbe essere controllata con un'unità di isolamento di stimolo che può controllare l'ampiezza di tensione come necessario.
- Posizionare l'elettrodo stimolante come lontano il muscolo come possibile per ridurre al minimo il numero di artefatti di stimolazione nelle registrazioni.
- Sollevare lentamente la tensione ruotando la manopola di tensione dell'unità di isolamento di stimolo, fino a quando le contrazioni sono osservate. Il punto in cui la contrazione è stata osservata in primo luogo è la soglia. Una volta individuata la soglia, impostare la tensione sull'unità di isolamento di stimolo a 1.5 * soglia (o come definito dall'esperimento).
Nota: La figura 6 Mostra la preparazione muscolare istituito sotto un microscopio dritto e il piccolo elettrodo bipolare, posizionato sul nervo utilizzando un manipolatore di snodo. È favorevole ad avere la tensione più bassa possibile pur essendo sufficientemente sopra la soglia di stimolazione. Una tensione più bassa di stimolo riduce il numero di artefatti di stimolazione durante le registrazioni. Inoltre, ponendo l'elettrodo stimolante dal muscolo verrà ridurre la dimensione del manufatto stimolazione. A volte l'estremità del nervo sarà danneggiato dalla dissezione, quindi potrebbe essere necessario sperimentare dove lungo il nervo deve essere posizionato lo stimolatore. - Rimuovere la soluzione salina di balneazione e sostituirli con 5 µM 4-Di-2-Asp. Esporre il prep LAL 4-Di-2-ASP per 10 min raggiungere fluorescenza adeguata per la visualizzazione della giunzione neuromuscolare (Figura 7).
- Preparare due soluzioni elettrodiche, 3M KCl e una soluzione interna di K+ composto (in mM) 75 aspartato, 5 MgCl2, 15 CA (Oh)2, 5 disodico di ATP, disodio 5 fosfocreatina, glutatione 5, 20 MOPS, 30 EGTA, pH di 7,2 con KOH.
Nota: Le soluzioni devono essere preparate in anticipo; la soluzione interna di K+ possa essere memorizzata in aliquote a-20 ° C. - Riempimento del vetro tirato capillare per il rilevamento della tensione elettrodo con 3M KCl. utilizzare la soluzione interna di K+ (preparati in passo 7,6) per l'elettrodo di passaggio di corrente; usare un ago non metallico stretto (~ 34 calibro) collegato a una siringa da 1 mL per riempire facilmente i capillari di vetro. Picchiettare delicatamente i capillari per rimuovere le bolle d'aria; garantire che ciascun elettrodo riempito ha una resistenza di 10-15 MΩ.
Nota: Controllare e notare la resistenza di entrambi gli elettrodi utilizzando il software di acquisizione dati. - Dopo 10 min, la soluzione di 4-Di-Asp con la normale Ca2 + soluzione di exchange.
8. identificazione della giunzione neuromuscolare mediante fluorescenza
- Utilizzando un microscopio dritto con standard in campo chiaro e illuminazione a fluorescenza, cercare una banda luminosa delle giunzioni neuromuscolari verde fluorescente perpendicolare alle fibre del muscolo lungo il prep come mostrato nella figura 7A. Utilizzare un obiettivo a immersione in acqua basso ingrandimento (~ 10x) per identificare le giunzioni neuromuscolari
Nota: Il microscopio dovrebbe essere equipaggiato con un cubo FITC (Ex: 480/40, dicroiche: 505LP, Em: 535/50) e un LED, laser, lampada alogena o lampada a mercurio per la fluorescenza. Per ridurre al minimo lo sbiancamento foto, si alternano tra illuminazione campo chiaro e fluorescenza.
Nota: Questa band è solitamente più prossimale alla base dell'orecchio rispetto alla linea mediana. La band è la regione dove le giunzioni neuromuscolari sono più concentrate. - Passare a un obiettivo a immersione in acqua più alto ingrandimento (~ 40 X) e identificare una giunzione neuromuscolare sullo strato superiore del muscolo per esaminare con elettrofisiologia (figura 7B).
- Fissare le pipette riempite i possessori di pipetta il headstages appropriato, le istruzioni del produttore. Utilizzare micromanipolatori per posizionare gli elettrodi sopra la membrana muscolare entro 100 µm della giunzione neuromuscolare identificata (Figura 7). Posizionare gli elettrodi utilizzando la microscopia a campo chiaro principalmente; utilizzare fluorescenza per confermare la posizione degli elettrodi rispetto alla giunzione neuromuscolare.
- In primo luogo, utilizzare un obiettivo di ingrandimento basso (~ 10x) per individuare gli elettrodi e quindi passare a un più alto obiettivo di ingrandimento (~ 40 X) per il posizionamento finale degli elettrodi. Non impalare gli elettrodi intramuscolari a questo punto, prima di sintonizzare gli elettrodi.
9. messa a punto e impalare gli elettrodi
- Una volta che gli elettrodi siano posizionati sopra la fibra desiderata, zero e sintonizzare l'elettrodo di rilevamento tensione di bilanciamento del ponte (o un'analoga metodologia) e neutralizzare la capacità di elettrodo per le istruzioni del produttore. Inoltre, zero l'elettrodo di passaggio di corrente.
- Portare entrambi gli elettrodi sulla superficie della fibra. Regolare lentamente la posizione degli elettrodi sul percorso verso la fibra in modo che gli elettrodi rimangano orientati rispetto alla giunzione neuromuscolare, come descritto nei passaggi 8.3 e 8.4.
- Dopo che entrambi gli elettrodi hanno contattato la superficie della fibra muscolare, impalare l'elettrodo smussato del passaggio di corrente in primo luogo. Utilizzare tecniche quali buzz (brevi impulsi di compensazione di capacità in eccesso), brevi impulsi di corrente o picchiettando delicatamente la tabella per facilitare l'impalamento elettrodo.
- Monitorare il segnale, con un oscilloscopio o un protocollo di oscilloscopio software di acquisizione dati, fino a quando viene identificato un potenziale di membrana negativo, che indica che l'elettrodo è stato impalato.
- Premere l'elettrodo più nitida-rilevamento della tensione sul muscolo al livello dell'elettrodo impalato passaggio di corrente. Una volta che entrambi gli elettrodi sono in linea con uno altro, impalare l'elettrodo di rilevazione tensione utilizzando le stesse tecniche applicate con l'elettrodo di passaggio di corrente.
- Al momento di successo impalamento, utilizzando il controller per l'amplificatore, applicare un negativo costante corrente con l'elettrodo di passaggio corrente per compensare eventuali danni della membrana per impalamento elettrodo di tenuta. Come la cellula inizia a caricarsi lentamente verso -80 mV, aumento nell'azienda corrente come necessario per portare la cella per il potenziale di riposo desiderato (vale a dire, -80 a -85 mV).
Nota: Evitare di registrazione da fibre che richiedono una partecipazione corrente maggiore in valore assoluto di-25 nA nel tipo selvaggio muscolare per ridurre al minimo la possibilità di registrare da fibre malsani. - Una volta che la fibra è stabile per un paio di minuti presso il potenziale di riposo desiderato, procedere alla registrazione di proprietà della membrana muscolare o trasmissione neuromuscolare.
10. registrazione di proprietà della membrana postsinaptica e trasmissione sinaptica
- Iniziare con corrente-morsetto registrazioni applicando un ugual numero di passaggi di corrente positive e negative per misurare le risposte corrispondenti per la tensione della membrana, che verranno utilizzate per determinare del motoneurone Rin e τm. Per garantire proprietà passiva, utilizzare le risposte di piccola tensione che raggiungono uno stato costante e avere una relazione tensione-corrente lineare16,19,20. Evitare la registrazione da fibre con un nervo danneggiato o insalubre, tali fibre hanno una frequenza di mEPP di > 3 Hz.
- Quindi, inserire due elettrodi tensione-morsetto secondo le istruzioni del produttore. Fibre di tensione-morsetto a un potenziale di membrana di -85 mV. Le impostazioni di tensione-morsetto dovrebbero raggiungere rapporti segnale-rumore che consentono il rilevamento dei mEPCs.
Nota: Mantenere un'adeguata tensione controllo può essere un problema. Noi utilizziamo due metodi per minimizzare questi problemi. In primo luogo, le fibre sono impalate entro 100 µm dei motoneurone come descritto in precedenza, che è all'interno la costante di lunghezza di queste fibre21. In secondo luogo, utilizziamo la funzionalità di ripristino DC dell'amplificatore. Questa funzione imposta un guadagno molto alta tensione-morsetto. Il nostro lavoro precedente ha descritto questo metodo in dettaglio e delineato un metodo per valutare la tensione-premuta della piastra laterale16. - Una volta in tensione-morsetto, registrare delle correnti sinaptiche (mEPCs ed eEPCs) utilizzando diversi protocolli di stimolazione del nervo, basato sui requisiti dell'esperimento.
- Record mEPCs spontanea e utilizza un protocollo di stimolazione del nervo di bassa frequenza (≤ 0.5 Hz) che permette di registrare EPCs senza modulazione sinaptica (facilitazione o modulazione) per valutare il contenuto quantal EPCs. Per valutare la facilitazione sinaptica o depressione, è necessario utilizzare un protocollo di stimolazione del nervo ad alta frequenza (10 impulsi a 50 Hz).
- Stimolare il nervo alla frequenza desiderata tramite un'unità di isolamento di stimolo, che può essere attivata tramite un generatore di impulsi che è controllato tramite il software di acquisizione dati.
- Una volta finite le registrazioni di tensione-morsetto, riportare l'amplificatore a un'impostazione di corrente-morsetto, spegnere tutte le correnti e rimuovere gli elettrodi dalla fibra. Controllare che gli elettrodi non ha fatto diventare intasati o deriva in tensione della linea di base durante la registrazione.
Nota: Per quanto riguarda la deriva, la tensione dell'elettrodo dovrebbe essere 0 volt nella soluzione extracellulare, come fossero state impostate prima di impalamento di fibra. Ad esempio, le tensioni registrate sarebbe incerte se la tensione alla deriva durante l'esperimento.
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Representative Results
Figura 8 Mostra un esempio di impulsi di corrente (Figura 8A) e le risposte di tensione (Figura 8B) da una fibra di LAL sotto corrente-pinza da un 12-week-old wild type R6/2 del mouse. La presenza di mEPPs indica che questi record sono state prese dal terminale del motoneurone. I record sono stati ottenuti in soluzione fisiologica normale. Questi record corrente-morsetto possono essere analizzati per determinare la Rin e τm di tale fibra16,19,20.
Una registrazione rappresentativa di un EPC e due mEPCs, ottenuti in condizioni di tensione-morsetto è mostrata in Figura 9A. La breve deviazione corrente precede l'EPC è l'artefatto causato da stimolo del nervo. L'analisi di mEPCs ed EPCs può essere fatto più veloce con software di rilevamento evento. Questo strumento consente al ricercatore di fare un modello che può quindi rilevare automaticamente gli eventi all'interno della registrazione. Gli eventi possono essere sovrapposti ed esportati in qualsiasi software di analisi dati. Figura 9B Mostra la sovrimpressione EPCs e mEPCs (interno) da una rappresentante della fibra.
Figura 1 : Posizione generale della levator auris longus muscolo
Il muscolo LAL si trova sulla superficie dorsale della testa. La linea rossa tratteggiata evidenzia il percorso per il taglio della pelle per rimozione sulla dorsale (A) e superficie laterale (B). La LAL attribuisce alla base dell'orecchio, così circa 1 mm di pelle intorno alla base dell'orecchio deve rimanere intatta per evitare di tagliare il LAL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Esposti levator auris longus muscolo
LAL (giallo e verde) si trova appena sotto la pelle ed è il muscolo più superficiale nella zona evidenziata. Ci sono due porzioni del muscolo, il cranio (giallo) e caudale regioni (verde). La regione cranica emerge dalla linea mediana alle prime quattro vertebre cervicali e corre verso la parte anteriore della base del auricle. Per riferimento, la linea mediana è una banda di tessuto connettivo che corre da scapole (freccia bianca) verso il naso. Il muscolo LAL destro e sinistro collegare al midline sopra il cranio. La parte cranica della LAL è molto più ampia rispetto alla porzione caudale. La porzione caudale si attacca vicino al midline presso la quarta e quinta vertebra cervicale e si collega alla parte posteriore della base del auricle. Durante la dissezione, tenere un paio di millimetri di pelle intorno all'orecchio cartilaginosa per impedire il taglio LAL, che è segnato nella figura da una linea tratteggiata tra parentesi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Dissezione grezza del levator auris longus e muscolo circostante
Una volta rimosso dall'animale, il tessuto è bloccato, dorsale lato giù (LAL sulla parte inferiore), in un piatto di elastomero foderato in silicone con perni bene effettuate come descritto nella sezione 5.3. Una volta fissati al fondo del piatto, gli strati di muscolo sovrastante possono essere rimosso. Un insetto pin attraverso il condotto uditivo è indicato con una freccia tratteggiata bianca. Le frecce gialle mostrano posizionamento del perno ideale per la rimozione dei muscoli indesiderati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Strato del muscolo direttamente inferiore alla levator auris longus
Evidenziato in blu è il rapitore auris longus (AAL), in rosso è il scupularis auricularis (AS) e in giallo è il interscutularis (IS). Il Leone è il principale, alla base del muscolo in questa immagine. Per riferimento, l'orecchio e la pelle circostante è delineato da una linea nera continua. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Camera di aspersione in silicone-elastomero alberati, personalizzato
Mostrato il piatto di aspersione di abitudine 35mm serve a fissare il LAL per registrazioni elettrofisiologiche (A). Elastomero di silicone è stato utilizzato per creare una superficie adatta per struggersi il tessuto. Al centro della camera è una piattaforma arrotondata che è utile quando inchiodarono le fibre. La piattaforma supporta le fibre muscolari da sotto quando il processo di applicazione di una forza verso il basso con elettrodi durante l'impalamento. Questa piattaforma è stata plasmata da permettendo di elastomero di silicone a forma di curva di una provetta conica da 50 mL. Una fetta di questo arrotondato in silicone elastomero può poi essere incollata al fondo della camera con altro elastomero di silicone. Una rappresentazione delineata del piatto così come un lato a vista sono mostrati in B e C , dove la camera di perfusione può essere visto più chiaramente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Elettrofisiologia sperimentare set-up
Un piccolo elettrodo bipolare è tenuto in posizione con un manipolatore di giunto a sfera magnetico per stimolare il nervo della LAL. Il tavolino del microscopio può essere fatto per tenere facilmente una piattaforma magnetica con l'uso di un materiale magnetico adesivo (come può essere trovato presso un mestiere o un negozio di ferramenta per la fabbricazione di magneti da frigorifero). Vengono anche mostrati i headstages e gli elettrodi posizionati sopra un campione LAL. Uno strumento importante è l'immersione in acqua, smussato obiettivo con un cono in ceramica tuffantesi, come mostrato. L'estremità smussata permette più facile posizionamento degli elettrodi e materiale ceramico minimizza il rumore elettrico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 : Identificazione di giunzione neuromuscolare
Tutte le immagini mostrano il LAL macchiato con 5 µM 4-Di-2-Asp (verde) per consentire la visualizzazione delle giunzioni neuromuscolari. (A), A banda luminosa delle giunzioni neuromuscolari può essere viste (frecce gialle) quando si visualizzano il muscolo attraverso un obiettivo 10x. Ramificazioni assoni possono essere visto anche come indicato dalla freccia tratteggiata bianca. (B) piccole pile confocale (5 x 1 µm) di tre giunzioni neuromuscolari (frecce gialle). Fibre muscolari sane hanno striature chiare, nonché più mionuclei che appaiono come macchie scure lungo il sarcolemma della fibra (frecce bianche). Spesso gli assoni che innervano le giunzioni neuromuscolari possono essere osservati pure. (C) A fibra con una giunzione neuromuscolare macchiata che viene impalata con elettrodi di vetro. Gli elettrodi sono stati migliorati con una luce bianca in modo che essi possono essere visti più facilmente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8 : Corrente-morsetto di registrazione di proprietà della membrana
Impulsi di corrente iniettati (A) e la membrana risultante potenziali risposte (B) registrate da una fibra della LAL immerso in soluzione fisiologica salina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9 : Registrazioni di tensione-morsetto del due-elettrodo
Una traccia non elaborati di un EPC e due mEPCs registrato in tensione morsetto a due elettrodi (A). Sovrapposti EPCs e mEPCs (inset) da una singola fibra (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
È descritto qui la preparazione e l'uso del mouse del muscolo LAL per la misura della trasmissione neuromuscolare in condizioni di corrente o tensione morsetto. Ci sono diversi punti importanti da considerare per la dissezione fuori il LAL. Pulizia del tessuto connettivo in eccesso l'AIDS di muscolo in impalamento elettrodo, come gli elettrodi riesci a scroccare il tessuto connettivo quando loro posizionamento per impalamento. Tuttavia, rimuovere solo il tessuto connettivo che può essere tolto facilmente per limitare le possibilità di danneggiare il muscolo. L'isolamento del nervo dovrebbe essere eseguita con attenzione perché è molto delicato. Per evitare danni al sistema nervoso, è utile lasciare alcuni del tessuto circostante all'estremità del nervo attraverso il quale può essere collocato un pin per proteggere il nervo al piatto. Inoltre, fare attenzione a non per schiacciare il nervo quando lo stimolatore del nervo di posizionamento. Infine, è importante l'ordine in cui gli elettrodi sono infilzati nella fibra. L'elettrodo smussato non è facile per impalare e dovrebbe essere impalato in primo luogo. Se l'elettrodo tagliente era impalata in primo luogo, l'elettrodo smussato potrebbe spingere la fibra del muscolo prima che perfora la membrana, causando l'elettrodo tagliente a venire fuori la fibra. Questo renderebbe necessario impalare la fibra una seconda volta con l'elettrodo tagliente che causerebbe danno della membrana inutili. È anche utile che l'amplificatore utilizzato contemporaneamente può misurare la corrente e la tensione dell'elettrodo passaggio corrente affinché una deflessione negativa nel potenziale di membrana può essere osservata, che indica che l'elettrodo è stato impalato.
Una caratteristica di LAL che può essere utile è la possibilità di rimuovere entrambi i muscoli contemporaneamente. Questo può essere grande per l'esecuzione di esperimenti di elettrofisiologia e biologia molecolare dello stesso animale. Questo è possibile seguendo essenzialmente lo stesso protocollo descritto qui con modifiche minori. Segui tutti i passaggi per le rubriche 1-3 facendo tutto descritto sul lato destro, nonché a sinistra. Al passaggio 4, si consiglia di iniziare il taglio sul lato ventrolateral dell'orecchio destro per rimuovere i muscoli. Come descritto in precedenza, tenere sempre le lame premute contro il cranio di tagliare come profondo come possibile lasciando inferiori muscoli legati per il leone. Continuare a tagliare verso l'orecchio di destra oltre la linea mediana, mantenendo la lama come profonda come possibile. A questo punto, il resto della procedura è come descritto in questo protocollo, eseguire solo i passaggi rimanenti su entrambi i muscoli. Una volta che i muscoli sono stati puliti, un leone può essere tagliato via e congelato per più successivamente l'analisi molecolare e l'altro può essere utilizzato per elettrofisiologia. Sarebbe difficile effettuare studi di elettrofisiologia con entrambi i muscoli dello stesso animale. A tale scopo, la linea mediana dovrà essere tagliata per separare i muscoli e così facendo sarà probabile danneggiare alcune fibre muscolari.
La LAL lungo è stato utilizzato per esaminare la trasmissione neuromuscolare perché la sua natura sottile permette la facile identificazione delle piastre laterali motore ed eccellente ex vivo perfusione1,3,4,5 ,6,7,8. Oltre all'utilizzo di 4-di-2-asp, altri gruppi hanno utilizzato bungarotossina rhodamin-coniugato alle concentrazioni basse22. Abbiamo usato il leone per gli esami elettrofisiologici, segnalazione purinergic e difetti nella malattia di Huntington16,20. La LAL è inoltre ideale per studi di imaging di cellule vive. Per esempio, parecchi studi hanno utilizzato la LAL per misurare delle vescicole sinaptiche rilascio e l'assorbimento23,24. Questo può essere fatto utilizzando coloranti, come FM 1-43.
Perché le piastre laterali possono essere facilmente osservate con un colorante fluorescente, gli elettrodi possono essere collocati in prossimità del terminale del motoneurone entro la costante di lunghezza della fibra muscolare. Posizionamento elettrodo presso la piastra laterale e l'uso di un sistema di due elettrodi tensione-morsetto alta conformità consente ai ricercatori di controllare completamente la placca motrice potenziali con meno di 1% di errore16. Questo può essere importante perché le correzioni comunemente usate per la sommabilità non lineare di potenziali sinaptici registrato sotto condizioni di corrente-morsetto10 non tengono conto dei cambiamenti nella membrana postsinaptica causata da condizioni sperimentali e/o stato di malattia. Ad esempio, riposo della piastra laterale ridotto conduttanze amplificheranno potenziali postsinaptici19, anche quelli corretti per la sommabilità non lineare. Al contrario, tensione-premuta correnti postsinaptiche non sono soggetti a errori di sommatoria non lineare e sono indipendente dalle proprietà della membrana postsinaptica. Questa dimostrazione, abbiamo recentemente dimostrato risultati contrastanti dai potenziali della piastra laterale rispetto alle correnti registrate da iper-eccitabile sulla malattia di Huntington muscolo scheletrico16.
Un vantaggio chiave finale di utilizzare il LAL per lo studio della trasmissione neuromuscolare è che le registrazioni sono da una singola sinapsi. Trasmissione neuromuscolare registrata da un singolo, completamente bloccato per la tensione della piastra laterale fornisce alcuni dei dati più dettagliati e precisi sulla trasmissione sinaptica attualmente disponibile, che è l'ideale per la modellazione e dipanare la complessità di sinaptica fisiologia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Si ringraziano il Dr. Mark M. Rich e Daniel Miranda per Commenti editoriali, Ahmad Khedraki per aiutare a stabilire questa tecnica e Wright State University per il sostegno finanziario (fondo di avvio per A.A.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
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