Summary
Le protocole décrit dans cet article utilise le muscle levator auris longus (LAL) souris pour enregistrer spontanée et évoquée par le nerf des potentiels post-synaptiques (courant-clamp) et des courants (voltage clamp) à la jonction neuromusculaire. Utilisation de cette technique peut éclairer les clés dans les mécanismes de la transmission synaptique dans des conditions normales et la maladie.
Abstract
Ce protocole décrit une technique d’enregistrement transmission synaptique de la jonction neuromusculaire dans des conditions de courant-clamp et voltage clamp. Une préparation ex vivo de la levator auris longus (LAL) est utilisée parce que c’est un muscle mince permettant de faciliter la visualisation de la jonction neuromusculaire impalement microélectrode à la plaque de serrage moteur. Cette méthode permet l’enregistrement des potentiels de plaque d’extrémité de miniatures spontanée et courants (mEPPs et avaient), évoquée par le nerf endplate potentiels et courants (EPPs et EPCs), ainsi que les propriétés de la membrane de la plaque de serrage moteur. Résultats obtenus par cette méthode incluent le contenu quantique (QC), nombre de sites de libération vésiculaire (n), les probabilités de la libération des vésicules (prel), facilitation synaptique et la dépression, ainsi que la constante de temps de membrane musculaire (τ m) et la résistance d’entrée. L’application de cette technique de modèles murins de la maladie humaine peut mettre en évidence les principales pathologies dans les états pathologiques et aider à identifier des stratégies de traitement novateur. Par tension-serrage entièrement une seule synapse, cette méthode fournit une des analyses plus détaillées de la transmission synaptique actuellement disponible.
Introduction
Étude de la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire permet de mieux comprendre la relation dynamique entre les systèmes musculaires, nerveux et squelettiques et est un excellent modèle pour étudier la physiologie synaptique. Le releveur auris longus (LAL) est un muscle mince, permettant au niveau des jonctions neuromusculaires à visualiser facilement. Les rapports précédents ont décrit la commodité d’utiliser la LAL pour examiner les toxines et les médicaments synaptiques et ont caractérisé les caractéristiques de type de fibre musculaire squelettique de la LAL1,2. De nombreuses études ont utilisé la LAL pour étudier la physiologie neuromusculaire3,4,5,6,7,8. Pour l’électrophysiologie, la capacité d’observer facilement les jonctions neuromusculaires LAL permet le positionnement précis des microélectrodes à la plaque de serrage moteur et réduit considérablement les problèmes de serrage d’espace dans l’enregistrement de la transmission synaptique. Enregistrements de courant-clamp des propriétés de la membrane musculaire, comme la constante de temps membranaire (τm) et la résistance d’entrée (Rde) sont facilement obtenus. En outre, ces propriétés peuvent être mesurées de fibres musculaires mêmes utilisés pour enregistrer la transmission neuromusculaire, ce qui permet une comparaison directe de la fonction synaptique pour les propriétés de la membrane musculaire. L’analyse de ces données peut fournir des clés mieux comprendre les mécanismes physiques de beaucoup de maladies neuromusculaires et d’États d’activité altérée.
Un aspect clé de la technique décrite ici est l’utilisation de voltage clamp pour enregistrements synaptiques, qui ne sont pas soumis les non-linéarités rencontrées en courant-clamp et sont indépendants des propriétés de la membrane musculaire. Avantages de l’utilisation de voltage clamp par opposition au courant-clamp pour étudier la transmission neuromusculaire ont été établis par le pionnier des efforts dans les années 19509. Sous courant-clamp, produits écologiques qui dépassent de 10 à 15 mV en amplitude ne sont pas un produit linéaire de la MAET amplitude9. Par exemple, si l’aménagement du territoire moyen est de 1 mV, un PPE de 5 mV peut être considérée comme le produit de 5 mEPPs (QC du 5) ; considérant que, un PPE de 40 mV sera le fruit de plus de 40 mEPPs. Cette non-linéarité à plus grandes EPPs se produit parce que la force motrice pour le PPE, qui est la différence entre le potentiel de membrane et le potentiel d’équilibre pour le récepteur de l’acétylcholine (~ -10 mV), diminue sensiblement pendant grands EPPs. Ce problème est évité dans les expériences de voltage clamp parce que le potentiel de membrane de muscle ne change pas au cours d’expériences de voltage clamp. Un inconvénient est que les expériences de voltage clamp sont techniquement plus difficiles à accomplir que l’enregistrement courant-clamp. Dans cette optique, McLachlan et Martin mis au point une simple correction mathématique qui prend en compte les non-linéarités en courant-clamp enregistrements EPPs10. Les corrections fonctionnent bien11,12,13, mais ce qui est important, supposent que les propriétés de la membrane musculaire n’ont pas été perturbées.
Les propriétés de la membrane musculaire sont particulièrement importantes à considérer si l’étude de conditions ou états pathologiques qui perturbent le muscle. Par exemple, le muscle squelettique du modèle transgénique R6/2 de la maladie de Huntington est hyperexcitables due à une réduction progressive dans le repos de chlorure et potassium courants14,15. En conséquence, mEPPs et EPPs sont amplifiés dans le muscle squelettique de la R6/2. Certes, d’autres facteurs peuvent modifier mEPPs et EPPs. Travailler avec un autre modèle de souris de la maladie de Huntington (R6/1) trouvé des modifications des produits écologiques qui semblent être associés à des protéines SNARE8. Afin d’évaluer les mécanismes provoquant l’altération de la transmission neuromusculaire, il serait avantageux d’éliminer les effets des propriétés de la membrane musculaire altéré en utilisant un voltage clamp. Dans une étude récente, la transmission neuromusculaire R6/2 a été étudiée dans les deux conditions de bride de tension et de courant en utilisant la technique décrite dans les présentes. L’intégralité des plateaux moteur étaient voltage clamp avec moins de 1 % d’erreur en plaçant deux microélectrodes dans la constante de la longueur de la plaque de serrage16. Il a été montré que la tension-pince et corrigé les documents courant-clamp ont donné des mesures contrastées de la transmission neuromusculaire dans le muscle R6/2. Ceci met en évidence qu’il peut être difficile à corriger EPPs pour les non-linéarités si les propriétés de la membrane musculaire ont été modifiées et montre les avantages d’obtenir des enregistrements de voltage clamp qui sont indépendants des propriétés de la membrane musculaire. Le protocole présenté ci-après est idéal pour l’examen des conditions ou des états pathologiques qui influent sur la transmission synaptique et les propriétés de la membrane postsynaptique.
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Protocol
Toutes les procédures d’animaux ont été effectuées conformément à l’usage Comité de Wright State University et animalier.
1. souris euthanasie
- Sous une hotte, placez votre souris dans un verre hermétique anesthésier la chambre.
- Exposer la souris par inhalation d’une dose létale d’isoflurane (saturation, soit ~ 25 %). Laissez la souris dans la chambre jusqu'à ce qu’aucune respiration ne peut être observée.
- Retirer la souris de la chambre et effectuer une dislocation cervicale comme méthode secondaire de l’euthanasie.
2. enlever les poils de la Surface dorsale de la tête, cou et dos
- Utilisez un rasoir électrique pour enlever la majorité des cheveux sur la surface dorsale de la tête, le cou et l’arrière de la souris. En outre, enlever les poils autour et sur l’oreille gauche.
NOTE : prenez garde lorsque vous vous rasez la peau autour des oreilles, la peau peut se coincer dans les lames du rasoir et pourrait endommager le tissu musculaire sous-jacente. - Appliquer crème dépilatoire avec un coton-tige sur la zone rasée pour enlever les poils restants. Attendre environ 1 minute et rincer la crème dépilatoire à l’eau à l’aide d’une pissette de lavage, puis brossez les cheveux à l’aide d’un coton-tige ou crème et pat la peau sèche.
3. enlever la peau pour exposer le Muscle Levator Auris Longus
- Sous un microscope à dissection stéréo, faites une petite incision (juste assez profonde pour pénétrer dans la peau) à l’arrière de la souris au niveau des omoplates. Couper la peau à l’aide de ciseaux de dissection micro, suivant le chemin indiqué sur la Figure 1 a-B.
- À l’aide d’une pince fine (par exemple no 5), tirez la peau le long de la Coupe près des omoplates. À l’aide de ciseaux de printemps, couper le tissu conjonctif pour séparer la peau du tissu musculaire sous-jacent tout en s’approchant de l’oreille. Ce qui est important, couper le tissu conjonctif avec les lames, le nez dans la peau afin d’éviter la coupe accidentelle du tissu musculaire exposés.
- Perfuse périodiquement le muscle exposé avec une solution de sérum physiologique, telle que la suivante Na+ externe mémoire tampon se compose de (en mM) : 144 NaCl, 4 KCl, 1,2 CaCl2, 0,6 MgCl2, glucose 5, 1 NaH2PO4, pH 7,4 avec NaOH, et a une osmolalité de 300 ± 5 mmol/kg. Une fois que le tissu conjonctif a été découpé à l’oreille gauche, couper la peau autour de l’oreille pour éliminer la peau complètement de la souris et jetez-le.
Remarque : La LAL se fixe à la base de l’oreille et peut facilement être endommagé lors du retrait de la peau. Il est bon de laisser environ 1 mm de la peau autour de la base de l’oreille pour éviter de couper la LAL.
4. retrait du Muscle Levator Auris long et les tissus environnants
- À l’aide de ciseaux de printemps, commencez par les muscles de coupe qui sont inférieurs à la LAL, qui relient à la colonne vertébrale entre les omoplates. Commencent à l’omoplate droite, juste à droite de la ligne médiane et coupez en direction de l’extrémité rostrale de la souris, tout en restant sur le côté droit de la ligne médiane. Continuer tout au long de coupe à la fin du tissu musculaire sur le crâne.
Remarque : La LAL est le muscle plus superficiel relié à la partie médiane de l’oreille et la ligne médiane, comme illustré à la Figure 2. Pour les images supplémentaires, un livre écrit par E.C. Greene17 montre des images excellents, dessinés à la main de la LAL. - Pince permet de saisir le tissu coupé immédiatement à droite de la ligne médiane, puis soulevez doucement et commencer à couper le tissu vers l’oreille gauche avec les lames des ciseaux pressées contre le crâne pour enlever plusieurs couches de muscles qui sont inférieurs à la LAL gauche. Laisser tous les calques fixés temporairement afin d’éviter de couper accidentellement la LAL au moment du retrait.
- Couper avec les lames parallèles à et pressée contre le crâne pour éviter de couper le nerf qui innerve la LAL, qui entoure le conduit auditif et pénètre dans les muscles du côté médial de l’oreille. Continuer à couper à travers le conduit auditif, gardant autant du nerf attaché que possible.
Remarque : Le nerf qui alimente la LAL branches du nerf facial et doit être maintenu tels qu’il est utilisé ultérieurement dans la procédure. - Couper le tissu adipeux qui se trouve juste après le conduit auditif par le même chemin illustré à la Figure 1 b sur la portion ventrolatérale de l’oreille. Aussi, couper le long de l’omoplate gauche, comme l’a fait sur le côté droit pour éliminer le muscle complètement de la souris.
5. Isolation du Muscle Levator Auris Longus
- Placez la LAL et le tissu environnant, dans un récipient. Utiliser un récipient dans lequel le tissu découpé peut être épinglé vers le bas, comme une boîte de Pétri avec un fond d’élastomère de silicone. Se baigner et laver fréquemment le tissu dans une solution de sérum physiologique.
- Couper le pavillon de l’oreille le long de la base de l’oreille, laissant la partie cartilagineuse de l’oreille attachée à la LAL. Mettez le muscle afin que la partie inférieure vers le haut (LAL sur le fond du plat).
- Placez une épingle, comme une insecte broche, à travers le conduit auditif pour maintenir la préparation en place. Puis à l’aide de petites épingles, épingle le tissu restant sur le côté opposé de la ligne médiane de la LAL. À l’aide de pince, tirer doucement la peau sur la partie latérale de l’oreille pour étirer le muscle et placez une petite épingle à travers la peau. Répétez cette étape jusqu'à ce que le tissu soit bien sécurisé au plat, comme illustré à la Figure 3.
NOTE : Pins petite dissection est possible en coupant l’extrémité des aiguilles d’acupuncture à la longueur souhaitée. Ces petites tiges minimiser les dommages aux tissus et peuvent être utilisés avec les objectifs de microscope-immersion dans l’eau avec longues distances de travail. - BEGIN supprimant les muscles (illustré à la Figure 4), qui couvrent la LAL (auricularis supérieure, ravisseur auris longus et interscutularis), et ceux liés à la LAL par l’intermédiaire du tissu conjonctif et sont particulièrement serrés près du ligne médiane, à l’aide de ciseaux de forceps et printemps no 5.
- À l’aide de la pince à tirer vers le haut sur la couche sus-jacente de muscle, couper le tissu conjonctif avec les lames orientées vers la couche musculaire étant tirée et veiller à ne pas couper ou entaille la LAL. Coupez en direction de la ligne médiane et cesser de réduire d’environ les trois quarts du chemin à la ligne médiane. Ensuite, coupe parallèle à la ligne médiane pour supprimer chaque couche musculaire. Conserver supprimer couches musculaires jusqu'à ce que seulement la LAL demeure.
- Enlever une partie du tissu conjonctif restant qui couvre la LAL, qui aide à empalement des électrodes. Utilisez no 5 pinces pour le tirer sur le tissu conjonctif de la LAL et coupez-le à l’aide de ciseaux de printemps. Seulement retirer le tissu qui peut être fait si facilement sans risque d’endommager la LAL dans le processus. Supprimer n’importe quel gros nerfs qui innervent les couches musculaires inférieurs reste sur la surface inférieure de la LAL qui peut gêner la visualisation de la jonction neuromusculaire.
6. isolation du nerf
- Identifier le nerf qui innerve la LAL à l’aide d’un stimulateur de nerf (par exemple, deux fils de platine reliée à un générateur d’impulsions) ; Il y aura plusieurs nerfs reliant le conduit auditif vers les muscles. Toucher les nerfs avec le stimulateur de nerf fournissant un courant (courant varie autour de 5 V). Lorsque le muscle se contracte, le nerf correct a été identifié.
- Soigneusement saisir le tissu près du nerf et utiliser des ciseaux de printemps pour séparer le nerf des tissus qui entourent l’oreille. Pour minimiser les dégâts, de garder la plupart du nerf incorporé dans certains tissus avoisinants, qui seront utilisés ultérieurement pour garantir le toupet du plat d’enregistrement.
Remarque : Le nerf moteur qui innerve la LAL est situé sur le côté médial de l’ouverture du canal de l’oreille. - Si une électrode de stimulation bipolaire, retirer le tissu environnant que dans une région du nerf, distale du muscle. Si une électrode d’aspiration, retirer les tissus environnants à l’extrémité coupée du nerf.
NOTE : Ceci est un point d’arrêt bon. Il s’agit d’un point d’arrêt bon. Si une pause est nécessaire la prep LAL disséquée peut être maintenue dans une solution physiologique ou une perfusion constante pendant quelques heures pour s’assurer que les métabolites nuisibles ne s’accumulent pas. Un grand volume de perfusion de solution ou constante permet de s’assurer que les métabolites nuisibles ne s’accumulent pas. - Ensuite, détacher et transférer le muscle à une chambre de perfusion pour des expériences d’électrophysiologie sous un microscope composé vertical.
Remarque : Utiliser une chambre de perfusion avec un fond meuble auquel le tissu peut être solidement épinglé (Figure 5 a). - Épinglez le muscle aux extrémités (oreille et la ligne médiane) et le long du bord du muscle. Positionner le nerf perpendiculaire aux fibres musculaires et épinglez-le au fond du plat par le biais de certains excès de tissu qui restait intacte à la fin du nerf. Gardez le tissu que baigné dans une solution de sérum physiologique en permanence.
Remarque : Il est également utile d’avoir arrondi, matériel élevé directement sous les fibres musculaires LAL. Ce soutien supplémentaire aide à impalement électrode et peut être fait d’une petite section d’élastomère de silicone moulé dans un tube conique de 50 mL, couchée sur le côté. La partie arrondie de l’élastomère peut être fixée sur le fond de la chambre de perfusion à l’aide d’une petite quantité de silicone frais. Un schéma de la chambre de perfusion est donné en Figure 5 b-C. Les fibres musculaires peut s’attachent très fortement à nouveau les élastomère de silicone de casting (ce qui sont très hydrophobe) et risquent d’être endommagés. Il est utile de manteau ou bloc nouvellement castée silicone avec protéine, semblable à l’étape de blocage dans un immunoblot. Pour le bloquer, nous avons incubé nouvellement silicone moulé dans une solution concentrée d’albumine de sérum du jour au lendemain.
7. électrophysiologie équipement Setup
- Préparer ou décongeler des aliquotes d’un colorant pour aider à la visualisation de la jonction neuromusculaire, tels que le colorant mitochondrial 4-(4-diethylaminostyryl)-1-méthylpyridinium18, qui est sensible à la lumière et doivent être stockés à l’abri de la lumière. En outre, décongeler des solutions électrode. Vortex toutes aliquotes pour s’assurer que tous les solutés sont en solution. Préparer une solution de sérum physiologique contenant 1 µM µ-conotoxine GIIIB (µ-CTX) et 80 µM BTS (en option).
- Sécuriser la chambre de perfusion avec la LAL à la platine du microscope. Placer l’électrode de référence dans une tasse remplie de 3M KCl, qui est relié à la chambre d’enregistrement via un pont d’agar. Connecter l’électrode de référence à l’amplificateur selon les instructions du fabricant.
- À ce stade, positionner l’électrode de stimulation nerveuse sur le nerf. Utiliser une électrode d’aspiration ou une petite électrode bipolaire, car elles fonctionnent bien pour la stimulation nerveuse.
- Positionner l’électrode stimulante aussi loin le muscle que possible afin de minimiser le nombre d’artefacts de stimulation dans les enregistrements.
Remarque : L’électrode de stimulation doit être contrôlé avec une unité d’isolement de stimulation qui permet de contrôler l’amplitude de la tension si nécessaire.
- Positionner l’électrode stimulante aussi loin le muscle que possible afin de minimiser le nombre d’artefacts de stimulation dans les enregistrements.
- Augmentez progressivement la tension en tournant le bouton de tension sur l’unité d’isolement de stimulation jusqu'à ce que les contractions sont observées. Le point auquel la contraction fut observée est le seuil. Une fois que le seuil a été identifié, régler la tension sur l’unité d’isolement de stimulus à 1,5 * seuil (ou tel que défini par l’expérience).
Remarque : La Figure 6 montre la préparation musculaire, mis en place sous un microscope vertical et la petite électrode bipolaire placé sur le nerf à l’aide d’un manipulateur de la rotule. Il est favorable d’avoir la plus basse tension pour la stimulation possible tout en étant suffisamment au-dessus de seuil. Une faible tension de relance réduit le nombre d’artefacts de stimulation durant les enregistrements. Aussi, placer l’électrode stimulante loin le muscle va diminuer la taille de l’artefact de stimulation. Parfois l’extrémité du nerf sera endommagée de la dissection, il est donc nécessaire d’expérimenter où l’appareil doit être placé le long du nerf. - Supprimez la solution saline de baignade et remplacez-les par 5 µM 4-Di-2-Asp. Exposer la prep LAL de la 4-Di-2-Asp pendant 10 min atteindre la fluorescence adéquate pour la visualisation de la jonction neuromusculaire (Figure 7).
- Préparer deux solutions de l’électrode, 3M KCl et une solution interne K+ comprenant (en mM) 75 aspartate, 5 MgCl2, 15 Ca(OH)2, 5 disodique ATP, disodique de phosphocréatine 5, 5 glutathion, 20 MOPS, 30 EGTA, pH 7,2 avec KOH.
Remarque : Les solutions doivent être préparées à l’avance ; la solution interne K+ peut être stockée en aliquotes à-20 ° C. - Remplir le verre tiré capillaire pour l’électrode de détection de tension avec 3M KCl. utiliser la solution interne de K+ (préparée en point 7.6) pour l’électrode de passage de courant ; utiliser une aiguille non métallique étroite (~ 34 jauge) attachée à une seringue de 1 mL pour remplir facilement les capillaires en verre. Tapotez doucement les capillaires pour enlever les bulles d’air ; veiller à ce que chaque électrode remplie a une résistance de 10-15 MΩ.
Remarque : Vérifiez et notez la résistance des deux électrodes en utilisant le logiciel d’acquisition de données. - Après 10 min, échanger la solution 4-Di-Asp avec la solution normale de Ca2 + .
8. identification de la jonction neuromusculaire à l’aide de Fluorescence
- À l’aide d’un microscope vertical avec standard lumineux-zone et d’illumination par fluorescence, recherchez une bande lumineuse fluorescente vert jonctions neuromusculaires exécutant perpendiculaire aux fibres musculaires le long de la préparation comme indiqué dans la Figure 7 a. Un objectif d’immersion dans l’eau grossissement faible (~ 10 X) permet d’identifier le niveau des jonctions neuromusculaires
Remarque : Le microscope devrait être équipé d’un cube FITC (Ex : 480/40, dichroïque : 505LP, Em : 535/50) et une LED, laser, lampe halogène ou lampe de mercure pour la fluorescence. Pour minimiser le blanchiment photo, alternativement éclairage lumineux-zone et la fluorescence.
Remarque : Cette bande est habituellement plus proximale à la base de l’oreille qu’à la ligne médiane. La bande est la région où les niveau des jonctions neuromusculaires sont plus concentrées. - Basculer vers un objectif d’immersion dans l’eau grossissement plus élevé (~ 40 X) et d’identifier une jonction neuromusculaire sur la couche supérieure du muscle d’examiner avec l’électrophysiologie (Figure 7 b).
- Fixez les pipettes remplis dans les supports de la pipette sur les headstages appropriés, conformément aux instructions du fabricant. Micromanipulateurs permet de placer les électrodes au-dessus de la membrane musculaire au sein de 100 µm de la jonction neuromusculaire identifiée (Figure 7). Placer les électrodes à l’aide principalement au microscope à fond clair ; fluorescence permet de confirmer l’emplacement des électrodes par rapport à la jonction neuromusculaire.
- Tout d’abord, utilisez un objectif de grossissement faible (~ 10 X) pour localiser les électrodes et puis passer à un objectif de grossissement (~ 40 X) plus élevé pour le positionnement final des électrodes. Ne pas empaler les électrodes dans le muscle à ce stade, tout d’abord régler les électrodes.
9. réglage et empaler les électrodes
- Une fois que les électrodes sont positionnées au-dessus de la fibre désirée, zéro et régler l’électrode de détection de tension par équilibrage de pont (ou une approche analogue) et neutraliser la capacité de l’électrode par les instructions du fabricant. En outre, nul l’électrode de passage de courant.
- Mettre les deux électrodes jusqu'à la surface de la fibre. Réglez progressivement la position des électrodes sur le chemin vers la fibre pour que les électrodes restent orientés à l’égard de la jonction neuromusculaire, comme indiqué aux paragraphes 8.3 et 8.4.
- Après que les deux électrodes ont contacté la surface de la fibre musculaire, empaler tout d’abord l’électrode de courant-passage émoussé. Utiliser des techniques telles que le buzz (brèves impulsions de compensation de capacité excédentaire), brèves impulsions de courant ou en tapotant doucement la table pour faciliter impalement électrode.
- Contrôler le signal, utilisant un oscilloscope ou un protocole de l’oscilloscope dans le logiciel d’acquisition de données, jusqu'à ce qu’un potentiel de membrane négatif est identifié, ce qui indique que l’électrode a été empalé.
- Enfoncer l’électrode de détection de tension plus nette sur le muscle au niveau de l’électrode de courant-passage empalé. Une fois que les deux électrodes sont conformes à l’autre, empaler l’électrode de détection de tension en utilisant les mêmes techniques appliquées avec l’électrode de passage de courant.
- Depuis empalement réussie, en utilisant la télécommande de l’amplificateur, s’appliquent une constante négative tenant actuel avec l’électrode de passage actuel afin de compenser pour les dommages de la membrane en raison de l’empalement d’électrode. Comme la cellule commence à charger lentement vers -80 mV, augmentation de l’exploitation actuelle comme nécessaires pour rendre la cellule au repos désiré potentiel (c'est-à-dire-80 à -85 mV).
Remarque : Évitez d’enregistrement à partir de fibres qui nécessitent une exploitation actuelle plus grande en valeur absolue que nA-25 dans le muscle de type sauvage pour minimiser le risque de l’enregistrement à partir de fibres malsaines. - Dès que la fibre est stable pendant quelques minutes au potentiels de repos désiré, procéder à l’enregistrement des propriétés de la membrane musculaire ou de la transmission neuromusculaire.
10. enregistrement des propriétés de la Membrane postsynaptique et Transmission synaptique
- Commencez par courant-clamp enregistrements en appliquant un nombre égal de positifs et négatifs des mesures actuelles pour mesurer les réponses de tension membranaire correspondante, qui seront utilisés pour déterminer l’endplate de moteur Rdans et τm. Pour garantir les propriétés passives, utilisez réponses petite tension qui atteignent un état stationnaire et ont une relation linéaire de tension-courant16,19,20. Éviter l’enregistrement à partir de fibres avec un nerf endommagé ou insalubre, ces fibres ont une fréquence de MAET de > 3 Hz.
- Ensuite, entrez deux électrodes potentiel imposé par les instructions du fabricant. Fibres de voltage clamp à un potentiel de membrane de -85 mV. Paramètres de voltage clamp devraient atteindre des taux de signal-bruit qui permettent la détection d’avaient.
Remarque : Maintenir la commande de tension adéquate peut être un problème. Nous utilisons deux méthodes pour minimiser ces problèmes. Tout d’abord, les fibres sont empalés au sein de 100 µm de la plaque de serrage moteur comme décrit plus haut, qui relève de la constante de la longueur de ces fibres21. Deuxièmement, nous utilisons la fonction de restauration de DC de l’amplificateur. Cette fonction définit un gain très haut voltage clamp. Nos travaux antérieurs a décrit cette méthode en détail et décrit une méthode pour évaluer la plaque d’extrémité voltage clamp16. - Une fois en voltage clamp, enregistrer des courants synaptiques (avaient et eEPCs) à l’aide de différents protocoles de stimulation nerveuse, fondé sur les nécessités de l’expérience.
- Record avaient spontanée et EPCs utilisant un protocole de stimulation de nerf de basse fréquence (≤0. 5 Hz) qui permet d’enregistrement EPCs sans modulation synaptique (facilitation ou modulation) pour évaluer la teneur quantique. Pour évaluer la facilitation synaptique ou la dépression, utiliser un protocole de stimulation de nerf de haute fréquence (10 impulsions à 50 Hz).
- Stimuler le nerf à la fréquence souhaitée via une unité d’isolement de relance, qui peut être déclenchée par un générateur d’impulsions qui est contrôlé en utilisant le logiciel d’acquisition de données.
- Une fois que les enregistrements de voltage clamp sont réalisés, remettre à un réglage de courant-clamp, éteignez tous les courants et retirer les électrodes de la fibre. Vérifier que les électrodes ne pas se bouchent ou nagent dans la tension de référence lors de l’enregistrement.
Remarque : Au sujet de la dérive, la tension de l’électrode doit être 0 volt dans la solution extracellulaire, car ils ont été mis en avant l’empalement de fibre. Par exemple, les tensions enregistrées serait incertaines si la tension a dérivé pendant l’expérience.
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Representative Results
Figure 8 montre un exemple de l’impulsions de courant (Figure 8 a) et les réponses de la tension (Figure 8 b) d’une fibre LAL sous courant-clamp d’un type sauvage de 12 semaines R6/2 souris. La présence de mEPPs indique que ces documents proviennent de la plaque de serrage moteur. Les enregistrements ont été obtenus dans une solution physiologique normale. Ces enregistrements de courant-clamp peuvent être analysés pour déterminer les Ren et τm de cette fibre16,19,20.
Un enregistrement représentatif d’une SPE et deux avaient, obtenus dans des conditions de potentiel imposé, est illustré à la Figure 9 a. La déviation actuelle bref précédant l’EPC est l’artefact provoquée par stimulation nerveuse. L’analyse d’avaient et EPCs peut être effectuée plus rapidement avec le logiciel de détection d’événement. Cet outil permet au chercheur de faire un modèle capable de détecter puis automatiquement les événements au sein de l’enregistrement. Les événements peuvent être superposées et exportées dans n’importe quel logiciel d’analyse de données. Figure 9 b montre les avaient (en médaillon) d’une fibre représentante EPCs superposées.
Figure 1 : Emplacement général de la Levator auris longus muscle
Le muscle LAL est situé sur la face dorsale de la tête. La ligne pointillée rouge met en évidence le chemin d’accès pour couper la peau pour l’enlèvement sur la dorsale (A) et (B) la surface latérale. La LAL se fixe à la base de l’oreille, donc environ 1 mm de la peau autour de la base de l’oreille doit rester intacte pour éviter de couper la LAL. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exposé Levator auris longus muscle
La LAL (jaune et verte) se trouve juste en dessous de la peau et est le muscle le plus superficiel de la zone en surbrillance. Il y a deux portions du muscle, le crâne (jaune) et caudales régions (vertes). La région crânienne se dégage de la ligne médiane à quatre premières vertèbres cervicales et s’écoule vers la partie antérieure de la base de l’oreillette. Pour référence, la ligne médiane est une bande de tissu conjonctif qui relie les omoplates (flèche blanche) vers le nez. Le muscle LAL droit et gauche se connecter à la ligne médiane sur le crâne. La partie crânienne de la LAL est beaucoup plus large que la partie caudale. La partie caudale se fixe près de la ligne médiane aux quatrième et cinquième vertèbres cervicales et se connecte à la partie postérieure de la base de l’oreillette. Au cours de la dissection, garder quelques millimètres de la peau autour de l’oreille cartilagineux pour éviter de couper la LAL, qui est marquée dans la figure par une ligne en pointillés entre crochets. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Dissection brute de la Levator auris longus et les muscles environnants
Une fois retiré de l’animal, le tissu est épinglé, dorsal côté vers le bas (LAL sur bas), dans un plat en silicone élastomère bordée à l’aide de fines tiges faits tel que décrit à la section 5.3. Une fois fixé au fond du plat, les couches musculaires sus-jacente peuvent être enlevés. Une insecte broche à travers le conduit auditif est indiquée par une flèche en pointillé blanche. Les flèches jaunes montrent le placement idéal de pin pour l’enlèvement des muscles non désirés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Couche musculaire directement inférieure à la Levator auris longus
Surligné en bleu est le ravisseur auris longus (AAL), en rouge est le auricularis scupularis (AS) et en jaune est interscutularis (IS). La LAL est le principal, qui sous-tendent les muscles dans cette image. Pour référence, l’oreille et la peau environnante est délimité par une ligne noire continue. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Chambre de perfusion-bordées d’élastomère de silicone, personnalisé
Montré est le plat de perfusion personnalisé 35 mm utilisé pour garantir la LAL pour enregistrements électrophysiologiques (A). Élastomère de silicone a été utilisé pour créer une surface adaptée à l’aspirant le tissu. Dans le centre de la chambre est une plate-forme arrondie qui est utile pour empaler les fibres. La plate-forme prend en charge les fibres musculaires du dessous quand exerçant une force vers le bas avec des électrodes au cours de l’empalement du processus. Cette plate-forme a été façonnée en permettant d’élastomère de silicone à la forme de la courbe d’un tube conique de 50 mL. Une tranche de cette arrondi silicone élastomère peut alors être collée au fond de la chambre d’élastomère de silicone plus. Une représentation décrite le plat ainsi qu’une vue côté apparaissent en B et C , où la chambre de perfusion peut être vu plus clairement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Électrophysiologie expérimenter la mise en place
Une petite électrode bipolaire est maintenue en place avec un manipulateur de rotule magnétique pour stimuler le nerf de la LAL. La platine du microscope est possible d’organiser facilement une plateforme magnétique avec l’utilisation d’un matériau magnétique adhésive (comme se trouvent à une embarcation ou un magasin de matériel pour la fabrication des aimants de réfrigérateur). Également montré sont les headstages et les électrodes placées au-dessus d’un échantillon LAL. Un instrument important est l’immersion dans l’eau, biseauté objectif avec un cône en céramique de trempage, comme illustré. L’extrémité biseautée permet de placement des électrodes plus facile et la céramique minimise le bruit électrique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Identification de la jonction neuromusculaire
Toutes les images montrent la LAL coloré avec 5 µM 4-Di-2-Asp (vert) afin de permettre la visualisation des jonctions neuromusculaires. Bande lumineuse (A) A des jonctions neuromusculaires peut être vus (flèches jaunes) lors de la visualisation du muscle à travers un objectif 10 X. Axones ramifications peuvent également considérer comme indiqué par la flèche blanche en pointillés. (B) petites piles confocale (5 x 1 µm) de trois jonctions neuromusculaires (flèches jaunes). Des fibres musculaires en bonne santé ont des stries claires ainsi que les noyaux multiples qui apparaissent comme des taches foncées le long du sarcolemme de la fibre (flèches blanches). Souvent, les axones des neurones innervant les jonctions neuromusculaires peuvent être observés ainsi. (C) une fibre avec une jonction neuromusculaire teintée qui est empalée avec électrodes de verre. Les électrodes ont été améliorés avec une surbrillance blanche afin qu’ils peuvent être vus plus facilement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Courant-clamp d’enregistrement des propriétés de la membrane
Les impulsions de courant injectées (A) et la membrane qui en résulte des réponses possibles (B) enregistrées à une fibre de la LAL baignant dans une solution saline physiologique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Enregistrements de voltage clamp deux électrodes
Une trace brute d’une SPE et deux avaient enregistré en deux électrodes de voltage clamp (A). Superposées EPCs et avaient (en médaillon) d’une seule fibre (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Décrite ici est la préparation et l’utilisation de la souris muscle Lacroix pour la mesure de la transmission neuromusculaire dans des conditions de courant ou de tension-clamp. Il y a plusieurs points importants à considérer pour la dissection de la LAL. Nettoyage des excès du tissu conjonctif du sida de muscle en impalement électrode, comme les électrodes peut accrocher le tissu conjonctif quand leur positionnement pour empalement. Cependant, seulement enlever du tissu conjonctif qui peut être enlevé facilement pour limiter les chances d’endommager le muscle. L’isolement du nerf doit être effectuée avec soin, car il est très délicat. Pour éviter des lésions nerveuses, il est utile de laisser certains des tissus environnants attaché à l’extrémité du nerf à travers lequel une épingle peut être placée pour fixer le nerf au plat. Aussi, prendre soin de ne pas pour écraser le nerf lors du positionnement du stimulateur de nerf. Enfin, l’ordre dans lequel les électrodes sont empalés dans la fibre est important. L’électrode contondant n’est pas aussi facile pour empaler et devrait être empalé tout d’abord. Si l’électrode pointu ont été empalé tout d’abord, l’électrode contondant pourrait appuyer la fibre musculaire avant il perce la membrane, ce qui pourrait causer l’électrode forte sortir de la fibre. Cela rendrait nécessaire pour empaler la fibre une deuxième fois avec l’électrode pointu qui causerait des dommages inutiles de membrane. Il est aussi utile que l’amplificateur utilisé peut mesurer simultanément le courant et la tension de l’électrode de passage actuel afin qu’une déviation négative dans le potentiel de membrane peut être observée, ce qui indique que l’électrode a été empalé.
Une caractéristique de la LAL qui peut s’avérer bénéfique est la possibilité de supprimer les deux muscles simultanément. Ceci peut être idéal pour réaliser des expériences d’électrophysiologie et de biologie moléculaire chez le même animal. Ceci peut être accompli en suivant essentiellement le même protocole décrit ici avec quelques changements mineurs. Suivez toutes les étapes sous les rubriques 1-3, faire tout ce que décrit sur le côté droit, mais aussi la gauche. À l’étape 4, il est préférable de commencer la coupe ci-contre ventrolatérale de l’oreille droite pour retirer les muscles. Comme décrit précédemment, gardez toujours les lames enfoncés sur le crâne de couper aussi profondément que possible, laissant les muscles inférieurs attachés à la LAL. Continuer à couper vers l’oreille droite au-delà de la ligne médiane, gardant la lame aussi profondément que possible. À ce stade, le reste de la procédure est décrite dans le présent protocole, seulement effectuer les étapes restantes sur les deux muscles. Une fois que les muscles ont été nettoyés, une LAL peut être coupé loin et congelés pour plus tard l’analyse moléculaire et l’autre peut être utilisé pour l’électrophysiologie. Il serait difficile d’effectuer des études électrophysiologiques avec les deux muscles de l’animal même. Pour ce faire, la ligne médiane doit être coupée pour séparer les muscles et cela sera sans doute endommager certaines fibres musculaires.
La LAL a longtemps été utilisé pour étudier la transmission neuromusculaire, parce que sa nature mince permet l’identification facile des plateaux moteur et excellent ex vivo perfusion1,3,4,5 ,6,7,8. Outre l’utilisation de 4-di-2-asp, autres groupes ont utilisé bungarotoxine rhodamine conjugué à de faibles concentrations22. Nous avons utilisé la LAL pour examens électrophysiologiques, purinergiques de signalisation ainsi que les anomalies dans la maladie de Huntington16,20. La LAL est également idéal pour les études d’imagerie de cellules vivantes. Par exemple, plusieurs études ont utilisé la LAL pour mesurer la vésicule synaptique libération et l’absorption de23,24. Cela peut être fait à l’aide de colorants, tels que FM 1-43.
Parce que les plateaux peut être facilement observés avec un colorant fluorescent, les électrodes peuvent être placés à proximité de la plaque de serrage moteur au sein de la constante de la longueur de la fibre musculaire. Placement des électrodes à la plaque de serrage et l’utilisation d’un système de deux électrodes de voltage clamp de conformité élevé permet aux chercheurs de contrôler entièrement la plaque de serrage possible avec moins de 1 % d’erreur16. Cela est important parce que les corrections couramment utilisées pour sommation non linéaire des potentiels synaptiques inscrites en vertu des conditions de courant-clamp10 ne tiennent pas compte des changements dans la membrane postsynaptique causée par des conditions expérimentales et/ou État de la maladie. Par exemple, réduite au repos plaque de serrage conductances amplifiera les potentiels postsynaptiques19, même ceux corrigés pour sommation non linéaire. En revanche, les courants postsynaptiques voltage clamp ne sont pas soumises à des erreurs de somme non linéaire et sont indépendants des propriétés de la membrane postsynaptique. Cette démonstration, nous avons récemment démontré des résultats contrastés de potentiels de plaque d’extrémité par rapport aux courants de la maladie de Huntington hyper excitables muscle squelettique16.
Un avantage clé final d’utiliser la LAL pour étudier la transmission neuromusculaire, c’est que les enregistrements sont d’une seule synapse. Enregistré à partir d’une seule de la transmission neuromusculaire, plaque de serrage entièrement voltage clamp fournit certaines des données plus détaillées et plus précises sur la transmission synaptique actuellement disponible, ce qui est idéale pour la modélisation et de démêler la complexité des synaptique physiologie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Mark M. Rich et Daniel Miranda commentaires éditoriaux, Ahmad Khedraki pour aider à mettre en place cette technique et Wright State University de soutien financier (fonds de démarrage de A.A.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
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