Summary
O protocolo descrito neste artigo usa o músculo levator auris longus (LAL) de rato para gravar espontânea e nervo-evocou potenciais pós-sinápticos (corrente-braçadeira) e correntes (tensão-braçadeira) na junção neuromuscular. Uso desta técnica pode fornecer insights-chave nos mecanismos de transmissão sináptica sob condições normais e doença.
Abstract
Este protocolo descreve uma técnica para gravar transmissão sináptica da junção neuromuscular sob condições de grampo-corrente e tensão-braçadeira. Uma preparação ex vivo do levantador auris longus (LAL) é usada porque é um fino músculo que proporciona fácil visualização da junção neuromuscular por empalamento microeléctrodo do motor placa terminal. Este método permite a gravação dos potenciais de placa terminal em miniatura espontânea e correntes (pptm e mEPCs), os potenciais de placa terminal evocado-nervo e correntes (EPPs e EPCs), bem como as propriedades de membrana da placa terminal motor. Resultados obtidos com este método incluem o conteúdo quantal (QC), número de sítios de liberação de vesículas (n), a probabilidade de liberação de vesículas (prel), facilitação sináptica e depressão, bem como a constante de tempo de membrana do músculo (τ m) e resistência de entrada. Aplicação desta técnica para modelos do rato da doença humana pode destacar as principais patologias nos Estados de doença e ajudar a identificar estratégias de tratamento de novela. Apertando totalmente tensão-uma única sinapse, este método fornece uma das análises mais detalhadas da transmissão sináptica atualmente disponível.
Introduction
Estudando a transmissão sináptica na junção neuromuscular fornece insights sobre a relação dinâmica entre os sistemas musculares, nervosos e esqueléticos e é um excelente modelo para analisar a fisiologia sináptica. O músculo levantador auris longus (LAL) é um músculo fino, permitindo às junções neuromusculares ser facilmente visualizado. Relatórios anteriores descreveram a conveniência de usar o leite para examinar as toxinas e drogas sinápticas e caracterizaram as características do tipo de fibra de músculo esquelético da LAL1,2. Numerosos estudos têm usado o LAL para examinar a fisiologia neuromuscular3,4,5,6,7,8. Para eletrofisiologia, a capacidade de observar facilmente as junções neuromusculares LAL permite a colocação exata de microeletrodos na placa terminal motor e reduz problemas de braçadeira espaço na gravação de transmissão sináptica. Corrente-braçadeira gravações das propriedades da membrana muscular, tais como a constante de tempo de membrana (τm) e resistência de entrada (Rem) são facilmente obtidas. Além disso, essas propriedades podem ser medidas de fibras musculares mesmas usadas para gravar a transmissão neuromuscular, permitindo uma comparação direta da função sináptica para as propriedades da membrana muscular. A análise destes dados pode fornecer insights-chave nos mecanismos físicos de muitas doenças neuromusculares e Estados de atividade alterada.
Um aspecto fundamental da técnica descrita aqui é a utilização de tensão-braçadeira para gravações sinápticas, que não estão sujeitos as não-linearidades encontradas na corrente-braçadeira e são independentes das propriedades da membrana muscular. Vantagens do uso de tensão-braçadeira em oposição à corrente-braçadeira para examinar a transmissão neuromuscular foram estabelecidas pelo pioneiro esforços na década de 19509. Sob corrente-braçadeira, EPPs que excederem 10-15 mV em amplitude não são um produto linear da amplitude pptm.9. Por exemplo, se o pptm média é 1 mV, uma EPP de 5 mV pode-se supor para ser o produto de 5 pptm (QC de 5); Considerando que, uma EPP de 40 mV será o produto de mais de 40 pptm. Essa não-linearidade no maiores EPPs ocorre porque a força motriz para o PPE, que é a diferença entre o potencial de membrana e o potencial de equilíbrio para o receptor de acetilcolina (~ -10 mV), diminui substancialmente durante grandes EPPs. Esse problema é evitado em experimentos de tensão-braçadeira não altera o potencial de membrana muscular durante experimentos de tensão-braçadeira. Uma desvantagem é que os experimentos de tensão-braçadeira são tecnicamente mais difícil do que a gravação de grampo-corrente. Com isto em mente, McLachlan e Martin desenvolveram uma correção de matemática simples que é responsável por não-linearidades em gravações de corrente-braçadeira de EPPs10. As correções funcionam bem11,12,13, mas importante, assumem que as propriedades da membrana muscular não foram interrompidas.
As propriedades da membrana muscular são especialmente importantes para considerar se a estudar as condições ou Estados de doença que perturbam o músculo. Por exemplo, o músculo esquelético do R6/2 modelo transgênico da doença de Huntington é hyperexcitable devido a uma redução progressiva no descanso de cloreto e potássio correntes14,15. Como consequência, pptm e EPPs são amplificados em músculo esquelético R6/2. Certamente, fatores adicionais podem alterar pptm e EPPs. Trabalhar com um modelo diferente de ratos a doença de Huntington (R6/1) encontrou alterações em EPPs que parecem estar relacionados com proteínas SNARE8. Para avaliar os mecanismos causando alterações de transmissão neuromuscular, seria benéfico eliminar os efeitos das propriedades de membrana muscular alterado usando uma tensão-braçadeira. Em um estudo recente, a transmissão neuromuscular R6/2 foi estudada em ambas as condições de corrente e tensão-braçadeira usando a técnica descrita neste documento. A totalidade das placas terminais motor foram tensão-fixada com menos do que 1% de erro, colocando dois microeletrodos dentro constante do comprimento da placa terminal16. Ele foi mostrado aquela tensão-braçadeira e corrigida registros de corrente-braçadeira rendidos medições contrastantes da transmissão neuromuscular no músculo R6/2. Isto ressalta que pode ser difícil corrigir EPPs não-linearidades se alteraram-se as propriedades da membrana muscular e mostra os benefícios de se obter registros de tensão-braçadeira independentes das propriedades da membrana muscular. O protocolo apresentado neste documento é ideal para examinar as condições ou Estados de doenças que afetam a transmissão sináptica e as propriedades da membrana pós-sináptica.
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Protocol
Todos os animais procedimentos foram realizados em conformidade com o Comitê de uso de Wright State University e cuidado Animal.
1. Mouse eutanásia
- Em uma coifa, coloque o mouse em um vidro hermético anestesiar a câmara.
- Expor o mouse através de inalação de uma dose letal de isoflurano (saturando, ou ~ 25%). Deixe o mouse na câmara até respiração não pode ser observada.
- Remover o mouse da câmara e executar um deslocamento cervical como um método secundário de eutanásia.
2. remoção de pelos da superfície Dorsal da cabeça, pescoço e costas
- Use um barbeador elétrico para remover a maioria dos cabelos na superfície dorsal da cabeça, pescoço e à parte traseira do mouse. Além disso, remova o cabelo ao redor e na orelha esquerda.
Nota: Tome cuidado ao raspar a pele ao redor das orelhas, a pele pode ser pego nas lâminas da máquina de barbear e pode danificar o tecido muscular subjacente. - Aplique creme depilatório com um cotonete de algodão na área raspada para remover os pelos restantes. Espere aproximadamente 1 min e enxaguar o creme da remoção do cabelo com água utilizando uma lavagem de garrafa, em seguida, afastar qualquer creme restante ou o cabelo usando um cotonete e pat a pele seca.
3. Retire a pele para expor o músculo longo Levator Auris
- Sob um microscópio estéreo de dissecação, faça uma pequena incisão (profunda apenas o suficiente para penetrar a pele) na parte de trás do rato ao nível das escápulas. Corte a pele com uma tesoura micro dissecação, seguindo o caminho mostrado na figura 1A-B.
- Usando a pinça fina (como n º 5), puxe a pele ao longo do corte perto da escápula. Usando a tesoura de mola, corte o tecido conjuntivo para separar a pele do tecido muscular subjacente, enquanto se aproximava da orelha. Importante, corte o tecido conjuntivo com as lâminas apontadas na pele para evitar o corte acidental de tecido do músculo exposto.
- Periodicamente, perfundir o músculo exposto com uma solução de soro fisiológico, como o buffer de externo seguinte at+ que consiste em (em mM): NaCl 144, 4 KCl, 1.2 CaCl2, 0,6 MgCl2, glicose 5, 1 NaH2PO4, pH 7,4 com NaOH, e tem uma pressão osmótica de 300 ± 5 mmol/kg. Uma vez que o tecido conjuntivo tem sido cortar para a orelha esquerda, cortar a pele em torno da orelha para retirar completamente a pele do rato e descartá-lo.
Nota: O LAL anexa à base do ouvido e pode ser facilmente danificado enquanto retira a pele. É bom deixar cerca de 1 mm da pele ao redor da base da orelha para evitar cortar o leite.
4. remoção do músculo Levantador Auris longo e tecidos circundantes
- Usando uma tesoura de mola, comece por músculos de corte que são inferiores da LAL, que conectam a coluna vertebral, entre as escápulas. Comece com a escápula direita, a direita da linha média e cortar no final rostral do mouse, mantendo-se no lado direito da linha média. Continue cortando até à extremidade do tecido do músculo no crânio.
Nota: O leite é o músculo mais superficial, ligado ao lado medial da orelha e a linha média, como mostrado na Figura 2. Para imagens adicionais, um livro de E.C. Greene17 mostra imagens excelentes, mão-extraídas do leite. - Use pinças para pegar o tecido cortado imediatamente à direita da linha média, então, suavemente, levante e comece a cortar o tecido em direção a orelha esquerda com as lâminas da tesoura pressionada contra o crânio para remover várias camadas de músculos que são inferiores da LAL esquerdo. Deixe todas as camadas anexadas temporariamente para evitar acidentalmente cortar o leite durante a remoção.
- Corte com lâminas paralelo e pressionado contra o crânio para evitar cortar o nervo que inerva o LAL, que envolve o canal auditivo e entra os músculos no lado medial da orelha. Continue o corte através do canal auditivo, mantendo tanto do nervo conectado quanto possível.
Nota: O nervo que fornece o leite ramos do nervo facial e deve ser preservado como ele será utilizado mais tarde no processo. - Corte o tecido adiposo que é só passar o canal auditivo ao longo do mesmo caminho mostrado na figura 1B a porção ventrolateral da orelha. Também, corte ao longo da escápula esquerda, como foi feito no lado direito, para remover completamente o músculo o mouse.
5. isolação do músculo Levantador Auris Longus
- Coloque o leite e o tecido circundante, em um recipiente. Use um recipiente no qual o tecido dissecado pode ser fixado ao fundo, como uma placa de Petri com um fundo de elastômero de silicone. Tomar banho e lavar frequentemente o tecido em uma solução de soro fisiológico.
- Cortar o pavilhão da orelha ao longo da base da orelha, deixando a parte cartilaginosa da orelha anexado para o LAL. Vire o músculo para que o lado inferior é virada para cima (LAL no fundo do prato).
- Coloque um alfinete, como um pino de insetos, através do canal auditivo para segurar o prep no lugar. Em seguida, usando pequenos pinos, pino o tecido restante no lado oposto da linha do LAL. Usando a pinça, puxe gentilmente a pele na parte lateral da orelha para esticar o músculo e colocar um pino pequeno através da pele. Repita este passo até que o tecido é bem preservado ao prato, como mostrado na Figura 3.
Nota: Pinos de dissecação pequena podem ser feitos por um corte as pontas das agulhas de acupuntura para o comprimento desejado. Esses pequenos pinos minimizar danos no tecido e podem ser usados com objectivos de microscópio água-imersão com distâncias de trabalho há muito tempo. - Comece removendo os músculos (mostrado na Figura 4), que estão cobrindo o LAL (auricularis superior, abdutor longo de auris e o interscutularis), e aqueles vinculados para o LAL através do tecido conjuntivo e são especialmente apertados perto do linha média, usando a tesoura pinça e mola de n º 5.
- Usando a pinça para puxar para cima sobre a camada sobrejacente do músculo, cortar o tecido conjuntivo com as lâminas orientadas para a camada de músculo sendo puxada e tome cuidado para evitar o corte ou roubando o leite. Corte em direção à linha média e pare de cortar cerca de três quartos do caminho até a linha média. Em seguida, corte paralelo à linha média para remover cada camada de músculo. Continue removendo camadas de músculo até que reste apenas o leite.
- Remova alguns dos restante tecido conjuntivo que cobre o LAL, que auxilia na empalação dos eletrodos. Delicadamente use fórceps n º 5 para puxar o tecido conjuntivo longe o LAL e cortá-la usando uma tesoura de mola. Apenas remova o tecido que pode ser feito facilmente, sem risco de danificar o LAL no processo. Remova qualquer grandes nervos que inervam as camadas de músculo inferior, permanecendo na superfície inferior da LAL que possa obstruir a visualização das junções neuromusculares.
6. isolamento do nervo
- Identificar o nervo que inerva o LAL usando um estimulador de nervo (por exemplo, dois fios de platina ligado a um gerador de pulso); Haverá vários nervos fugindo do canal auditivo para os músculos. Toque os nervos com o estimulador de nervo fornecendo alguma corrente (corrente varia em torno de 5 V). Quando o músculo contrai, o nervo correto foi identificado.
- Cuidadosamente pegue o tecido perto do nervo e tesoura de mola para separar o nervo do tecido ao redor da orelha. Para minimizar os danos, manter a maioria do nervo incorporado em algum tecido circundante, que será usado posteriormente para fixar o nervo para o prato de gravação.
Nota: O nervo motor que inerva o LAL está localizado no lado medial do canal auditivo de abertura. - Se usando um eletrodo bipolar estimulante, remova o tecido circundante apenas em torno de uma região do nervo, distal do músculo. Se utilizar um eletrodo de sucção, remova o tecido circundante no corte final do nervo.
Nota: Este é um ponto de parada boa. Este é um ponto de parada boa. Se uma pausa é necessária a preparação LAL dissecada pode ser mantida em uma solução fisiológica ou perfusão constante por um par de horas para garantir que não acumulem metabólitos nocivos. Use um grande volume de perfusão constante ou solução para garantir que metabólitos nocivos não se acumulam. - Em seguida, Desafixar e transferir o músculo para uma câmara de perfusão para experimentos de eletrofisiologia sob um microscópio composto na posição vertical.
Nota: Uso de uma câmara de perfusão com um fundo macio para que o tecido pode ser firmemente fixado (Figura 5A). - Pino do músculo nas extremidades (orelha e linha média) e ao longo da borda do músculo. Posicione o nervo perpendicular às fibras musculares e fixá-lo no fundo do prato através de algum excesso de tecido que foi deixado intacto no final do nervo. Mantenha o tecido banhado em uma solução de soro fisiológico em todos os momentos.
Nota: Também é útil ter arredondado, material elevado diretamente sob as fibras de músculo LAL. Este apoio extra auxilia na empalação eletrodo e pode ser feito de um pequeno troço de elastômero de silicone, convertida em um tubo cônico de 50 mL, deitado de lado. A seção arredondada do elastômero pode ser fixada à parte inferior da câmara de perfusão usando uma pequena quantidade de silicone fresco. Um diagrama da câmara de perfusão é mostrado na Figura 5B-C. As fibras musculares pode aderir muito firmemente a recém fundido elastómero de silicone (que é muito hidrofóbico) e pode ser danificadas. É útil para revestir ou bloco recém convertida do silicone com proteína, semelhante à etapa de bloqueio em um immunoblot. Para bloqueá-lo, podemos ter incubado recém silicone fundido em uma solução concentrada de albumina de soro bovino durante a noite.
7. eletrofisiologia equipamentos Setup
- Preparar ou descongelar alíquotas de um corante para ajudar na visualização da junção neuromuscular, como o corante mitocondrial 4-(4-diethylaminostyryl)-1-metilpiridínio18, que é sensível à luz e devem ser armazenados longe da luz. Além disso, descongele soluções de eletrodo. Vórtice todas as alíquotas para assegurar que todos os solutos na solução. Preparar uma solução de soro fisiológico contendo 1 µM µ-conotoxina GIIIB (µ-CTX) e 80 µM BTS (opcional).
- Fixe a câmara de perfusão com o leite para o palco do microscópio. Coloque o eletrodo de referência em uma taça cheia de 3 M de KCl, que está ligado à câmara de gravação através de uma ponte de ágar. Conecte o eletrodo de referência para o amplificador de acordo com as instruções do fabricante.
- Neste ponto, eletrodo de posição o nervo-estimulando o nervo. Use um eletrodo de sucção ou um pequeno eletrodo bipolar, como eles funcionam bem para a estimulação do nervo.
- Posicione o eletrodo estimulando mais longe o músculo quanto possível para minimizar o número de artefatos de estimulação nas gravações.
Nota: O eletrodo estimulante deve ser controlado com uma unidade de isolamento de estímulo que pode controlar a amplitude de tensão conforme necessário.
- Posicione o eletrodo estimulando mais longe o músculo quanto possível para minimizar o número de artefatos de estimulação nas gravações.
- Levante lentamente a tensão através do manípulo de tensão na unidade de isolamento de estímulo até que as contrações são observadas. O ponto no qual a contração foi observado pela primeira vez é o limite. Uma vez que o limiar foi identificado, definir a tensão na unidade de isolamento de estímulo em 1.5 * limiar (ou conforme definido pela experiência).
Nota: A Figura 6 mostra a preparação muscular instituído sob um microscópio ereto e o pequeno eletrodo bipolar posicionado no nervo usando um manipulador articulado. É favorável para ter a menor tensão possível enquanto ainda está sendo suficientemente acima do limiar de estimulação. Uma baixa tensão de estímulo reduz o número de artefatos de estimulação durante as gravações. Também, colocar o eletrodo estimulante longe o músculo irá diminuir o tamanho do artefato estimulação. Às vezes o fim do nervo será danificado desde a dissecação, então pode ser necessário experimentar com onde, ao longo do nervo o estimulador deve ser colocado. - Remova a banho de solução salina e substitua com 5 µM 4-Di-2-Asp. Expor a preparação de leite para o 4-Di-2-Asp para 10 min alcançar a fluorescência adequada para visualização da junção neuromuscular (Figura 7).
- Prepare duas soluções de eletrodo, 3M KCl e uma solução interna K+ composto (em mM) 75 aspartato 5 MgCl2, 15 5o2, 5 dissódico de ATP, dissódico fosfocreatina 5, 5 glutationa, 20 MOPS, 30 EGTA, pH 7.2 com KOH.
Nota: As soluções devem ser preparadas com antecedência; a solução de K+ interna pode ser armazenada em alíquotas a-20 ° C. - Encha o vidro puxado capilar para o eletrodo sensor de tensão com 3 M KCl. Use a solução de interno K+ (preparado no passo 7,6) para o eletrodo de passagem de corrente; Use uma agulha estreita não metálica (~ 34 calibre), ligada a uma seringa de 1 mL para facilmente preencher os capilares de vidro. Bata levemente os capilares para remover as bolhas de ar; Certifique-se de que cada eletrodo cheio tem uma resistência de 10-15 MΩ.
Nota: Verifique e anote a resistência de ambos os eletrodos, usando o software de aquisição de dados. - Depois de 10 min, troca a solução de 4-Di-Asp com a solução normal de Ca2 + .
8. identificação de junção Neuromuscular usando fluorescência
- Usando um microscópio vertical com brilhantes-campo padrão e iluminação de fluorescência, procure por uma banda brilhante de fluorescentes verdes junções neuromusculares, executando perpendicular às fibras musculares ao longo da prep, conforme mostrado na Figura 7A. Use um objectivo de imersão de água de baixa ampliação (~ 10 X) para identificar as junções neuromusculares
Nota: O microscópio deve ser equipado com um cubo FITC (Ex: 480/40, Dichroic: 505LP, Em: 535/50) e um LED, laser, lâmpada de halogênio ou lâmpada de mercúrio para fluorescência. Para minimizar a foto branqueamento, alternam entre iluminação de campo claro e fluorescência.
Nota: Esta banda é geralmente mais proximal à base da orelha do que a mediana. A banda é a região onde as junções neuromusculares estão mais concentradas. - Alterne para um objetivo maior de água-imersão ampliação (~ 40 X) e identificar uma junção neuromuscular na camada superior do músculo para examinar com eletrofisiologia (Figura 7B).
- Fixe as pipetas preenchidas nos suportes das pipeta sobre o headstages adequado, as instruções do fabricante. Use Micromanipuladores para posicionar os eletrodos acima da membrana muscular dentro de 100 µm de junção neuromuscular identificada (Figura 7). Posicionar os eletrodos, usando principalmente a microscopia de campo claro; uso da fluorescência para confirmar a localização dos eletrodos em relação a junção neuromuscular.
- Primeiro, use um objectivo de ampliação baixa (~ 10 X) para localizar os eléctrodos e alterne para um objectivo maior de ampliação (~ 40 X) para posicionamento final dos eletrodos. Não empalar os eléctrodos no músculo neste ponto, primeiro Afine os eléctrodos.
9. ajuste e empalar os eléctrodos
- Quando os eletrodos são posicionados acima da fibra desejada, zero e ajustar o eletrodo sensor de tensão por ponte de equilíbrio (ou uma abordagem análoga) e neutralizando a capacitância de eletrodo, as instruções do fabricante. Além disso, zero o eléctrodo de passagem de corrente.
- Trazer os dois eléctrodos para a superfície da fibra. Lentamente ajuste a posição dos eléctrodos no caminho até a fibra para que os eletrodos permanecem orientados com relação a junção neuromuscular, como descrito nos passos 8.3 e 8.4.
- Depois que os dois eléctrodos contactaram a superfície da fibra muscular, empalar o eléctrodo de passagem de corrente sem corte primeiro. Use técnicas tais como zumbido (breves pulsos de compensação do excesso da capacidade), breves pulsos de corrente ou batendo suavemente a tabela para facilitar o empalamento do eletrodo.
- Monitore o sinal, usando um osciloscópio ou osciloscópio protocolo do software de aquisição de dados, até que seja identificado um potencial de membrana negativo, o que indica que o eletrodo tem sido empalado.
- Deprimi o eletrodo sensor de tensão mais nítido sobre o músculo ao nível do eléctrodo empalado passagem de corrente. Uma vez que os dois eléctrodos coadunam-se uns aos outros, empalar o eletrodo sensor de tensão, usando as mesmas técnicas aplicadas com o eletrodo de passagem de corrente.
- Após a bem sucedido empalamento, usando o controlador para o amplificador, aplica um negativo constante segurando atual com o eletrodo de passagem atual para compensar danos devido ao empalamento de eletrodo de membrana. Como a célula começa a cobrar lentamente em direção a -80 mV, aumento da exploração atual como necessário para trazer a célula para o descanso desejado potencial (ou seja, -80 a -85 mV).
Nota: Evite a gravação de fibras que exigem uma exploração corrente maior em valor absoluto, que at-25 no músculo do tipo selvagem para minimizar a possibilidade de gravação das fibras insalubres. - Uma vez que a fibra é estável durante alguns minutos com o potencial de descanso desejado, proceda à gravação de propriedades de membrana muscular ou transmissão neuromuscular.
10. transmissão sináptica e membrana pós-sináptica Propriedades de gravação
- Comece com gravações de corrente-braçadeira aplicando um número igual de positivos e negativos atuais passos para medir as reações de tensão membrana correspondente, que serão usadas para determinar a placa terminal motor Rem e τm. Para garantir Propriedades passivas, use respostas de pequena voltagem que alcançar um estado estável e tem uma relação linear tensão-corrente16,19,20. Evite a gravação de fibras com um nervo danificado ou insalubre, tais fibras têm uma frequência pptm de > 3 Hz.
- Em seguida, digite dois-eletrodo tensão-braçadeira as instruções do fabricante. Fibras de tensão-braçadeira em um potencial de membrana de -85 mV. Configurações de tensão-braçadeira devem atingir proporções de sinal-ruído que permitam a detecção de mEPCs.
Nota: Manter o controle de tensão adequada pode ser um problema. Nós usamos dois métodos para minimizar esses problemas. Primeiro, as fibras são empaladas dentro de 100 µm da placa terminal motor conforme descrito anteriormente, que encontra-se a constante de comprimento destas fibras21. Segundo, usamos o recurso de restauração de DC do amplificador. Esta característica define um ganho de muito alta tensão-braçadeira. Nosso trabalho anterior tem descrito este método em detalhe e descrito um método para avaliar a tensão-fixada placa terminal16. - Uma vez em tensão-braçadeira, gravar as correntes sinápticas (mEPCs e eEPCs) usando vários protocolos de estimulação do nervo, com base nos requisitos do experimento.
- Registro mEPCs espontânea e EPCs usando um protocolo de estimulação do nervo de baixa frequência (≤ 0.5 Hz) que permite um registro EPCs sem modulação sináptica (facilitação ou modulação) para avaliar o conteúdo quantal. Para avaliar a facilitação sináptica ou depressão, use um protocolo de estimulação do nervo de alta frequência (10 pulsos a 50 Hz).
- Estimule o nervo na frequência desejada através de uma unidade de isolamento de estímulo, que pode ser acionada usando um gerador de pulso que é controlado usando o software de aquisição de dados.
- Uma vez que são feitas as gravações de tensão-braçadeira, voltar o amplificador para um ajuste de corrente-braçadeira, desligue todas as correntes e remova os eletrodos da fibra. Verifique que os eléctrodos não ficar obstruídos ou tração na tensão de linha de base durante a gravação.
Nota: Em relação a tração, a tensão do eletrodo deve ser 0 volts na solução extracelular, como eles foram criados antes de empalamento de fibra. Por exemplo, as tensões gravadas seria incertas se a tensão à deriva durante o experimento.
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Representative Results
A Figura 8 mostra um exemplo dos pulsos de corrente (Figura 8A) e as respostas de tensão (Figura 8B) de uma fibra de leite sob corrente-braçadeira de um selvagem de 12 semanas de idade tipo R6/2 do rato. A presença de pptm indica que esses registros foram retirados do motor placa terminal. Os registros foram obtidos em soro fisiológico normal. Esses registros de corrente-braçadeira podem ser analisados para determinar o Rem e τm de que fibra16,19,20.
Uma gravação representativa de uma EPC e dois mEPCs, obtidos em condições de tensão-braçadeira, é mostrada na Figura 9. A breve deflexão atual precede o EPC é o artefato causado pela estimulação do nervo. Pode ser feita a análise de mEPCs e EPCs mais rápido com o software de detecção de eventos. Esta ferramenta permite que o pesquisador fazer um modelo que depois pode detectar automaticamente os eventos na gravação. Os eventos podem ser sobrepostos e exportados para qualquer software de análise de dados. Figura 9B mostra os EPCs sobreposta e mEPCs (inserção) de uma representante da fibra.
Figura 1 : Localização geral da músculo levantador auris longus músculo
O músculo LAL situa-se na superfície dorsal da cabeça. A linha pontilhada vermelha destaca o caminho para a pele para a remoção na dorsal (A) e lateral (B) superfície do corte. A LAL anexa à base da orelha, assim aproximadamente 1 mm da pele ao redor da base da orelha deve permanecer intacta para evitar cortar o leite. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Expostos músculo levantador auris longus músculo
A LAL (amarelo e verde) está localizado logo abaixo da pele e é o músculo mais superficial na área realçada. Há duas porções do músculo, o craniano (amarelo) e caudais (verdes) regiões. Região craniana emerge da linha média para as quatro primeiras vértebras cervicais e corre em direção a parte anterior da base da aurícula. Para referência, a mediana é uma faixa de tecido conjuntivo que se estende desde a escápula (seta branca), em direção ao nariz. O músculo direito e esquerdo do LAL conectar na linha sobre o crânio. A porção cranial da LAL é muito mais ampla do que a porção caudal. A porção caudal anexa perto da linha média para as quarta e quinta vértebras cervicais e se conecta à parte posterior da base da aurícula. Durante a dissecção, manter alguns milímetros da pele ao redor da orelha cartilaginosa para evitar cortar o leite, que está marcado na figura por uma linha tracejada entre colchetes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Dissecação crua da músculo levantador auris longus e muscular circundante
Uma vez retirado o animal, o tecido é fixado, dorsal lado baixo (LAL na inferior), em um prato de forrado de elastômero de silicone usando pinos bem feitos conforme descrito na seção 5.3. Quando segura no fundo do prato, as camadas sobrejacentes de músculo podem ser removidas. Um inseto pino através do canal auditivo é indicado com uma seta tracejada branca. As setas amarelas mostram o posicionamento do pino ideal para remoção dos músculos indesejados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Camada muscular inferior diretamente para o músculo levantador auris longus
Destacadas em azul é o abdutor longo de auris (AAL), em vermelho é o auricularis scupularis (AS), e em amarelo é o interscutularis (IS). O leite é o principal, subjacentes músculo nesta imagem. Para referência, a orelha e a pele ao redor é descrito por uma linha preta sólida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Câmara de perfusão de elastômero de silicone-alinhadas, personalizado
Mostrado é o prato de perfusão de 35mm personalizado usado para proteger o leite para gravações eletrofisiológicas (A). Elastómero de silicone tem sido usado para criar uma superfície adequada para o tecido a sofrer. No centro da câmara é uma plataforma arredondada que é útil quando empalar as fibras. A plataforma suporta as fibras musculares de baixo quando processo de aplicar uma força descendente com eletrodos durante o empalamento. Esta plataforma foi moldada por permitindo elastómero de silicone para formar a curva de um tubo cónico de 50 mL. Uma fatia deste arredondado lata de elastômero de silicone, em seguida, colada à parte inferior da câmara com elastómero de silicone mais. Uma representação delineada de prato, bem como uma vista lateral são mostrados em B e C , onde a câmara de perfusão pode ser vista mais claramente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Eletrofisiologia experimentar set-up
Um pequeno eletrodo bipolar é mantido no lugar com um manipulador articulado magnético para estimular o nervo do LAL. Fase de microscópio pode ser feito para facilmente uma plataforma magnética com o uso de um material adesivo magnético (como pode ser encontrado em um ofício ou loja de hardware para fazer ímãs de geladeira). Também são mostradas as headstages e eletrodos posicionados acima de uma amostra de leite. Um instrumento importante é a água-imersão, objectivo chanfrado com um cerâmico cone mergulhando, como mostrado. Extremidade chanfrada permite a fácil colocação do eletrodo e o material cerâmico minimiza ruído elétrico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Identificação de junção neuromuscular
Todas as imagens mostram o leite manchado com 5 µM 4-Di-2-Asp (verde) para permitir a visualização das junções neuromusculares. (A), A banda brilhante de junções neuromusculares pode ser vistas (setas amarelas) ao visualizar o músculo através de um objectivo de X 10. Axônios de ramificação também podem ser vistos como indicado pela seta tracejada branca. (B) confocal pilhas pequenas (5 x 1 µm) de três junções neuromusculares (setas amarelas). Fibras de músculo saudáveis ter estrias claras, bem como vários myonuclei que aparecem como manchas escuras ao longo da sarcolema da fibra (setas brancas). Muitas vezes os axônios que inervam as junções neuromusculares podem ser observados também. (C) A fibra com uma junção neuromuscular manchada que está empalada com eletrodos de vidro. Os eletrodos foram aprimorados com destaque branco para que eles podem ser vistos mais facilmente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : Corrente-braçadeira gravação das propriedades da membrana
Pulsos de corrente injetados (A) e a membrana resultante respostas potenciais (B) gravadas a partir de uma fibra da LAL banhados em solução salina fisiológica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9 : Gravações de tensão-braçadeira do dois-eletrodo
Um traço cru de uma EPC e dois mEPCs gravado em dois elétrodos tensão-braçadeira (A). Sobreposta EPCs e mEPCs (inserção) de uma única fibra (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui descrito é a preparação e uso do mouse músculo LAL para a medição da transmissão neuromuscular sob condições de tensão ou corrente --braçadeira. Há vários pontos importantes a considerar para a dissecar o LAL. Limpar o excesso de tecido conjuntivo das aids de músculo em empalamento de eletrodo, como os eletrodos pode snag o tecido conjuntivo quando posicionando-os por empalamento. No entanto, só remover o tecido conjuntivo que pode ser retirado facilmente para limitar as chances de danificar o músculo. O isolamento do nervo deve ser realizado com cuidado, porque é muito delicado. Para evitar danos nos nervos, é útil deixar um pouco do tecido circundante anexado ao fim do nervo, através do qual um pino pode ser colocado para proteger o nervo para o prato. Além disso, tome cuidado para não esmagar o nervo quando se posiciona o estimulador de nervo. Finalmente, a ordem na qual os eletrodos são empalados na fibra é importante. O eletrodo sem corte não é tão fácil para empalar e deveria ser empalado primeiro. Se o eléctrodo afiado foram empalado primeiro, o eletrodo brusco poderia empurrar a fibra muscular para baixo antes que perfure a membrana, possivelmente causando o eletrodo afiado sair a fibra. Isso seria necessário para empalar a fibra uma segunda vez com o eletrodo afiada que causaria danos desnecessários da membrana. Também é útil que o amplificador sendo usado simultaneamente pode medir a corrente e a tensão do eletrodo passagem atual para que um desvio negativo no potencial de membrana pode ser observado, indicando que o eletrodo tem sido empalado.
Uma característica do leite que pode ser benéfico é a capacidade de remover ambos os músculos simultaneamente. Isso pode ser ótimo para a realização de experiências de eletrofisiologia e biologia molecular no mesmo animal. Isso pode ser feito seguindo-se essencialmente o mesmo protocolo descrito aqui, com pequenas alterações. Siga todos os passos para as rubricas 1-3 fazendo tudo descrito no lado direito, bem como à esquerda. No passo 4, é melhor começar o corte no lado ventrolateral da orelha direita para remover os músculos. Conforme descrito anteriormente, sempre mantenha as lâminas pressionadas contra o crânio para cortar o mais profundamente possível, deixando o inferior músculos anexados para o LAL. Continue a cortar no sentido da orelha direita, além da linha média, mantendo a lâmina mais profundamente possível. Neste ponto, o resto do procedimento conforme descrito no presente protocolo, apenas execute as etapas restantes em ambos os músculos. Uma vez que os músculos foram limpos, um leite pode ser cortado fora e congelados para mais tarde a análise molecular e o outro pode ser usado para eletrofisiologia. Seria difícil realizar estudos de eletrofisiologia com ambos os músculos do mesmo animal. Para isso, a linha média deve ser cortada para separar os músculos e fazer, então provavelmente irá danificar algumas fibras musculares.
O leite tem sido muito utilizado para examinar a transmissão neuromuscular, porque sua natureza fina permite a fácil identificação de placas terminais motor e excelente ex vivo perfusão1,3,4,5 ,6,7,8. Além do uso do 4-di-2-asp, outros grupos têm usado a bungarotoxina rhodamin-conjugados em baixas concentrações22. Nós usamos o LAL para exames eletrofisiológicos, purinérgicos sinalização e defeitos na doença de Huntington16,20. O leite também é ideal para estudos de imagiologia viver-pilha. Por exemplo, vários estudos têm usado o LAL para medir a vesícula sináptica liberação e absorção de23,24. Isso pode ser feito usando corantes, tais como FM 1-43.
Porque as placas terminais podem ser facilmente observadas com uma mancha fluorescente, os eletrodos podem ser colocados em estreita proximidade com a placa terminal motor dentro constante do comprimento da fibra muscular. Colocação de eletrodos na placa o terminal e o uso de um sistema de dois-eletrodo tensão-braçadeira alta conformidade permite que os investigadores controlar totalmente a placa terminal potencial com menos de 1% de erro16. Isto pode ser importante porque as correções comumente usadas para não-linear somatório dos potenciais sinápticos gravado sob condições de corrente-braçadeira10 não conta para alterações na membrana pós-sináptica causada por condições experimentais e/ou Estado de doença. Por exemplo, descanso reduzido placa terminal conductances amplificará potenciais pós-sinápticos19, mesmo aqueles corrigido para soma não-linear. Em contraste, as correntes pós-sinápticas tensão-fixada não estão sujeitos a erros de soma não-linear e são independentes das propriedades da membrana pós-sináptica. Demonstrando isto, recentemente mostramos resultados contrastantes de potenciais de placa terminal em comparação com correntes gravadas de hiperexcitável a doença de Huntington músculo esquelético16.
Uma vantagem chave final de usar o leite para estudar a transmissão neuromuscular é que gravações são de uma única sinapse. Transmissão neuromuscular, gravado a partir de um único, totalmente tensão-fixada placa terminal fornece alguns dos dados mais detalhados e precisos na transmissão sináptica disponível atualmente, que é ideal para a modelagem e desvendar a complexidade do sináptica fisiologia.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos Dr. Mark M. Rich e Daniel Miranda Comentários editoriais, Ahmad Khedraki para ajudar a estabelecer essa técnica e Wright State University, para apoio financeiro (fundo de inicialização para A.A.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
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