Ablasjon av Neuronal innbyggere med en to-fotonet Laser og sin vurdering ved hjelp av kalsium Imaging og atferdsmessige opptak i sebrafisk larver
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å ablate en genetisk merket subpopulasjon av neurons av en to-fotonet laser fra sebrafisk larver.
Abstract
For å identifisere rollen som en subpopulasjon av nerveceller i oppførsel, er det viktig å teste konsekvensene av blokkere sin aktivitet i levende dyr. Laser ablasjon neurons er en effektiv metode for dette formålet når neurons er selektivt merket med fluorescerende sonder. Studien, er protokoller for laser ablating en subpopulasjon av neurons bruker to-fotonet mikroskop og testing av funksjonelle og atferdsmessige konsekvensene beskrevet. I denne studien brukes byttedyr fange atferd i sebrafisk larver som studien modell. Pretecto-hypothalamus krets kjent ligger denne visuelt-drevet byttedyr fanger atferd. Sebrafisk Pretetto var laser-ablated, og nevrale aktivitet i dårligere flik av hypothalamus (ILH, målet for pretectal projeksjon) ble undersøkt. Byttedyr fange virkemåte etter pretectal ablasjon ble også testet.
Introduction
For å forstå hvordan problemet oppstår fra nevrale aktivitet i hjernen, er det nødvendig å identifisere nevrale kretser som er involvert i generasjon adferden. På larvestadiet, sebrafisk gir en ideell dyremodell for studere hjernefunksjon knyttet virkemåten fordi liten, gjennomsiktig hjernen gjør det mulig å undersøke neuronal aktivitet mobilnettet oppløsning i bredt område av den hjernen mens observere atferd1. Bildebehandling neuronal aktivitet i bestemte neurons har blitt mulig gjennom oppfinnelsen av genetisk kodet kalsium (Ca) indikatorer (GECIs) som GCaMP2. GCaMP transgene sebrafisk har vist seg for å være nyttig for å knytte funksjonelle nevrale krets med atferd ved å gjennomføre Ca imaging i oppføre dyr3.
Mens Ca bildebehandling kan vise sammenhenger mellom neuronal aktivitet og atferd, for å vise kausalitet, undertrykkelse av neuronal aktivitet og teste sin consequence(s) oppførsel er viktige skritt. Det finnes ulike måter å oppnå dette: bruk av genetisk mutasjon som endrer bestemte nevrale kretser4, uttrykk for nervegifter i bestemte neurons5,6, bruk av optogenetic verktøy som halorhodopsin7, og laser ablasjon målrettet neurons8,9. Laser ablasjon er spesielt egnet for å fjerne aktiviteten i et relativt lite antall bestemte neurons. Uhelbredelig eliminering av neuronal aktivitet ved å drepe neurons forenkler vurdere atferdsmessige konsekvenser.
En interessant atferd som kan observeres på larvestadiet i sebrafisk er byttedyr fange (figur 1A). Dette visuelt-guidede, målrettet gir en gunstig eksperimentelle system for studier av synsskarphet10, visuomotor transformasjon11,12,13, visuell persepsjon og anerkjennelse av objekter,14,,15,,16,,17,,18, og beslutningsprosesser19. Hvordan bytte er anerkjent av rovdyr og hvordan byttedyr oppdagelsen fører til byttedyr fanger oppførsel har vært et sentralt spørsmål i neuroethology20. I dette papiret, vi fokusere på rollen pretecto-hypothalamus krets dannet av projeksjoner av en kjerne i Pretetto (kjernen pretectalis superficialis pars magnocellularis, heretter, bare kjent som Pretetto) å ILH. Laser-ablasjon av Pretetto ble vist å redusere byttedyr fange aktivitet og avskaffe neuronal aktivitet i ILH som er forbundet med den visuelle byttedyr oppfatning21. Her, laser protokoller for å utføre ablasjon og teste dens effekt ved hjelp av Ca2 + imaging og atferdsmessige opptak i sebrafisk Larvene er beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
En utmerket romlig oppløsning for å ablate spesielt individuelle neurons har to-fotonet laser bør stor forsiktighet utvises å unngå uønskede skade på hjernevev på grunn av varme. Viktigste i ablasjon eksperimentet er å finne den optimale mengden av laser irradiation. Utilstrekkelig bestråling ikke drepe neurons. For mye bestråling vil varme-skade de omkringliggende vev, som vil resultere i uønskede effekter. Det optimale området av laser irradiation (områder av ROIs, antall gjentakelser og skanning fart) sy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Disse studiene ble finansiert av tilskudd mottatt fra MEXT, JSP KAKENHI Grant tall JP25290009, JP25650120, JP17K07494 og JP17H05984.
Materials
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
- Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
- Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
- Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
- Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
- Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
- Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
- Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
- Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
- Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
- Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit’s Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
- Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
- Ewert, J. -. P. . Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , (1980).
- Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
- Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
- Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , (2007).
- . Fiji Available from: https://fiji.sc (2017)
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
- Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
