Ablation av neuronala invånare använder en två-photon Laser och sin bedömning med kalcium Imaging och beteendemässiga inspelning i zebrafiskar larver
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att avlägsna en genetiskt märkt subpopulation av nervceller av en två-photon laser från zebrafisk larver.
Abstract
För att identifiera rollen av en subpopulation av nervceller i beteende, är det viktigt att testa konsekvenserna av blockerar dess aktivitet i levande djur. Laser ablation av nervceller är en effektiv metod för detta ändamål när nervceller är selektivt märkta med fluorescerande sonder. I den aktuella studien beskrivs protokoll för laser ablating en subpopulation av nervceller med två-foton Mikroskop och testning av dess funktionella och beteendemässiga konsekvenser. I denna studie används byte fånga beteende hos zebrafiskar larver som studien modell. Pretecto-hypotalamus kretsen är känt att ligger bakom denna visuellt-driven prey fånga beteendet. Zebrafiskar Pretetto var laser-avlägsnades och neuronal aktivitet i den underlägsna LOB i hypothalamus (Simones; målet pretectal projektionen) undersöktes. Prey fånga beteendet efter pretectal ablation testades också.
Introduction
För att förstå hur beteende uppstår från neuronal aktivitet i hjärnan, är det nödvändigt att identifiera de neurala kretsar som är involverade i framtagningen av detta beteende. På larvstadium, Zebrafiskar ger en idealisk djurmodell för studera hjärnfunktionen associerade med beteendet eftersom deras små, genomskinliga hjärnor gör det möjligt att undersöka neuronal aktivitet på en cellulär resolution inom ett brett område av den hjärnan medan du observerar den beteende1. Avbildning av neuronal aktivitet i specifika nervceller har blivit möjligt genom uppfinningen av genetiskt kodade kalcium (Ca) indikatorer (GECIs) som GCaMP2. GCaMP transgena zebrafisk har visat sig vara användbar för att associera den funktionella neural kretsen med beteende genom att genomföra Ca imaging i beter sig djur3.
Medan Ca imaging kan påvisa korrelationer mellan neuronal aktivitet och beteende, för att Visa kausalitet, undertryckande av neuronal aktivitet och testa dess consequence(s) på beteende är viktiga steg. Det finns olika sätt att uppnå detta: användning av genetisk mutation som förändrar specifika neurala kretsar4, uttryck av nervgifter i specifika nervceller5,6, använda optogenetic verktyg såsom halorhodopsin7, och laser ablation av riktade nervceller8,9. Laser ablation är särskilt lämpad för att eliminera aktivitet i ett relativt litet antal specifika nervceller. Irreversibel eliminering av neuronal aktivitet genom att döda nervceller underlättar att bedöma beteendemässiga konsekvenser.
En intressant beteende som kan observeras vid larvstadium i zebrafisk är bytesdjur fånga (figur 1A). Denna visuellt-guidad, målinriktat beteende ger ett gynnsamt experimentella system för studier av synskärpa10, visuomotor transformation11,12,13, visuell perception och erkännande av objekt14,15,16,17,18, och beslutsfattande19. Hur bytesdjur är erkänd av rovdjur och hur byte upptäckt leder till offer att fånga beteendet har varit en central fråga i neuroethology20. I detta papper, vi fokuserar på rollen av pretecto-hypotalamus kretsen bildas av projektioner av en kärna i Pretetto (nucleus pretectalis superficialis pars magnocellularis, hädanefter helt enkelt noteras som Pretetto) till PASIS. Laser-ablation av Pretetto visades att minska prey fånga verksamhet och avskaffa neuronal aktivitet i den PASIS som associeras med den visuella prey perception21. Här, laser protokoll för att utföra ablation och testa dess effekt med Ca2 + imaging och beteendemässiga inspelning i zebrafiskar larver beskrivs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om två-photon lasern har en utmärkt rumslig upplösning till specifikt ablatera enskilda nervceller, bör stor försiktighet iakttas att undvika oönskad skada på hjärnans vävnad på grund av värmen. Det viktigaste steget i ablation experimentet är att bestämma den optimala mängden laser irradiation. Otillräcklig bestrålning misslyckas att döda nervceller. För mycket bestrålning kommer värme-skada den omgivande vävnaden, vilket kommer att resultera i oönskade effekter. Den optimala rad laser irradi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dessa studier har finansierats genom bidrag från den MEXT, JSPS KAKENHI Grant nummer JP25290009, JP25650120, JP17K07494 och JP17H05984.
Materials
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
- Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
- Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
- Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
- Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
- Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
- Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
- Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
- Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
- Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
- Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit’s Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
- Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
- Ewert, J. -. P. . Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , (1980).
- Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
- Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
- Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , (2007).
- . Fiji Available from: https://fiji.sc (2017)
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
- Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
