Ecdysone המבוסס על קולטן מיוחד במינו ג'ין מתג עבור הביטוי מכוון של Transgene עם חוסן, הפיכות Leakiness זניח
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור אפנון הביטוי transgene באמצעות מתג יחיד ג’ין pEUI(+) על ידי טיפול tebufenozide.
Abstract
שליטה מדויקת של הביטוי transgene רצוי במחקרים ביולוגית וקלינית. אולם, בגלל התכונה בינארי של מתגים ג’ין מועסקים כיום דורשת ההעברה של שתי יחידות טיפוליות ביטוי במקביל לתא בודד, היישום המעשי של המערכת עבור ריפוי גנטי הוא מוגבל. כדי לפשט את המערכת ביטוי transgene, יצרנו מתג ג’ין כמנהל pEUI(+) המקיף ערכה מלאה של מודולי ביטוי transgene וקטור יחידה. הכוללת של התחום מחייב GAL4 DNA, ששונה EcR (GvEcR), תחום הפעלה מינימלית VP16 התמזגו עם תחום מחייב GAL4 DNA, כמו גם קולטן ecdysone דרוזופילה ששונתה (EcR), המתג פיתח גן מיוחד במינו הוא מאוד מגיבים אדמיניסטרטיבי משרן כימי באופן זמן ותלוי במינון. וקטור pEUI(+) הוא כלי רב עוצמה פוטנציאל לשיפור השליטה של הביטוי transgene המחקר הביולוגי והן מחקרים קליניים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור אפנון של ביטוי transgene ארעית ויציבה באמצעות וקטור pEUI(+) על ידי הטיפול של tebufenozide (טב). בנוסף, אנו חולקים חשוב הנחיות השימוש של טב משרן כימי.
Introduction
מספר הגן שונה מתגי נחקרו על יכולתם לווסת דווקא transgene ביטוי תרבית תאים, מודלים, בדרגות שונות של הצלחה-1,–2,–3 מערכות מתג גנים פוטנציאליים צריך לעמוד בקריטריונים מחמירים שונים, כולל: ביטוי כיווני מדויק של transgene, המינון ותלוי זמן ההיענות inducers, leakiness זניח של האמרגן, הפיכות של transgene הפעלה באמצעות הסרת משרן משרן רמות רעילות נסבלת שורות תאים ו2,1,חיות מעבדה3. מספר מולקולה קטנה inducers נוצלה, כולל טטרציקלין4,5, rapamycin6,7,8,9,mifepristone10, ecdysone11,12,13,14. באופן כללי, מערכות אלו דורשים לפחות שני פלסמידים המכיל שתיים או שלוש יחידות ביטוי דיסקרטית, אחד או שניים מהם לחבר רכיב תקינה (משרן פלסמיד) המאגד של משרן מולקולה קטנה כדי לזכות פעילות גנים ברמת השעתוק; פלסמיד אחר (אפקטור פלסמיד) המכיל את transgene תחת השליטה של אזור DNA תקינה המאפשרת את הגישה של רכיב מאוגד משרן רגולטוריות. החיסרון העיקרי של מערכת בינארית היא שזה דורש המבוא בו-זמני של שני וקטורים (משרן ו אפקטור) לתוך תא היעד. בניסויים ביטוי transgene ארעי, תרביות תאים בו זמנית של פלסמידים 2 מייצרת באופן בלתי נמנע אוכלוסיה של תאים ביחידים transfected עם משרן או את אפקטור, או שיתוף transfected ושליחותם. בנוסף, השיטה הבינארית מחייב לפחות שני סיבובים של הבחירה אנטיביוטי כדי ליצור שורות תאים יציב, וזו ההגדרה המפורטת. לפיכך, המשלב את כל הרכיבים הדרושים עבור הביטוי transgene, תקנה לתוך וקטור יחידה יהיה אידיאלי להבטיח את הביטוי בו-זמני של כל הרכיבים הנדרשים בתא יחיד ולאפשר ויסות ביטוי transgene דרך הטיפול עם inducers מולקולה קטנה.
כדי להתגבר על החסרונות של ג’ין בינארי מתגים, לאחרונה פיתחנו מתג יחיד ג’ין, באמצעות דרוזופילה melanogaster ג’ין מבוסס-EcR מערכת inducible15. Ecdysone שמתווכת ביטוי גנים כאשר הוא נקשר אל heterodimer EcR/ultraspiracle (USP), אשר בתורו גורם עקידת EcR ה-DNA גורמים רגולטוריים3,11. הקולטן חוליות retinoid X (RXR), ortholog של חרקים USP, מגייס EcR ליצירת מטוס activator תעתיק פעיל16. לפיכך, עבור הביטוי יישוב של transgene חוליות תאים או רקמות, EcR RXR חייב להיות שותף ביטוי בו זמנית לפני להיות מגורה על ידי ecdysone או אגוניסטים שלו. מאז התכונה heterodimeric של הבורר גנים מבוססת-EcR שיכול להיות מושפע אנדוגני RXR רמה, Padidam et al. מוחלף על התחומים EcR DNA מחייב והפעלה heterologous GAL4 DNA מחייב, vmw65 חלבון וירוס הרפס סימפלקס (VP16) הפעלת תחומים דבוקה התחום מחייב ליגנד EcR, אשר לאחר מכן הפך להגיב RXR אנדוגני, נוצר homodimer של כדי לזכות פעילות גנים ברמת השעתוק17. הבורר גנים מבוססת-EcR היה עוד יותר משופר על ידי בניית חלבון chimeric מורכב תחום הפעלה VP16 מינימלי, בשילוב עם GvEcR, אשר נוצרו homodimer מקומית ציטוזול בהיעדרו של ecdysone אגוניסט, טב16, 18. באמצעות קשירה טב, GvEcR שונה לוקליזציה subcellular שלה ציטוזול את הגרעין לזהות מקדם היברידית מורכבת דג זברה E1b יזם מינימלי בשילוב זוגיים עשר חזר על הפעלת במעלה רצפים (UASs) ליזום שעתוק של ה-ג’ין היעד16.
כדי לפשט את הגן מבוססת-EcR שדווחה בעבר מפסיקים16,18, שילבנו בין התכונות בינארי של המערכת לתוך וקטור יחידה מצויד עם כל הרכיבים הנדרשים עבור מגרה transgene ביטוי ולאחר מכן המיועד הווקטור החדש שנוצר, pEUI(+) (מספר גישה GenBank: KP123436, איור 1A)15. אפקטור להגיב על הנהג GvEcR (להלן-התקן) מורכב טנדם עשר UAS חוזר ליד יזם מינימלי E1b ואחריו אתר שיבוט מרובים (MCS) עם רצפי זיהוי EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ו- AflII (איור 1B). בנוסף, כדי להקל על הבחירה של transfected תאים, puromycin מונחה יזם Nשל SV40-אצטיל-טרנספראז (PAC) ג’ין הושם בין האזורים אפקטור ונהג כדי לשמור על שורות תאים יציב (איור 1).
אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור אפנון ארעית ויציבה של הביטוי transgene תוך שימוש pEUI(+). בנוסף, אנו מספקים הוראות מפורטות לשימוש מוצלח של טב כמו אגוניסט ecdysone.
Protocol
Representative Results
Discussion
החיסרון העיקרי של שימוש בבורר ביטוי גנים בינארי הוא הצורך להעביר בו זמנית בשני פלסמידים נפרד (מנהל ההתקן ואת אפקטור) לתוך תא היעד. זה יכול להוביל שוויונית של פלסמידים ולהוביל והתגובה לא עקבי של המתג inducers1,2,3. חסרון נוסף של מערכת דו-וקטור הו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים S-Y צ’וי (האוניברסיטה הלאומית Chonnam) על קריאה יסודית של כתב היד והערות יקרי ערך. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של האוניברסיטה הלאומית Chungnam.
Materials
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
References
- Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
- Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
- Suzuki, Y., Suzuki, Y., Xu, K. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. , 285-309 (2011).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
- Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).
- Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
- Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).
- Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).
- Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).
- Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).
- Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).
- Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).
- Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).
- Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).
- Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).
- Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N’-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).
- Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).
- Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).
- McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).
- Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).
- Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
- Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).
- Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).
