Ein Ecdyson Rezeptor-basierte singuläre Genschalter für bewusste Expression des Transgens mit Robustheit, Reversibilität und vernachlässigbar Undichtigkeit
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Modulation des Transgens Ausdruck mit pEUI(+) singular Genschalter durch Tebufenozide Behandlung.
Abstract
Präzise Steuerung des Transgens Ausdruck ist in biologischen und klinischen Studien wünschenswert. Jedoch, da die binäre Funktion der derzeit eingesetzten Genschalter die Übertragung von zwei therapeutische Ausdruck Einheiten gleichzeitig in eine einzelne Zelle erforderlich ist, beschränkt sich die praktische Anwendung des Systems für die Gentherapie. Um die Transgen-Expressionssystem zu vereinfachen, haben wir einen Genschalter als pEUI(+) umfasst einen kompletten Satz von Transgen Ausdruck Module in einem einzigen Vektor generiert. Bestehend aus der GAL4 DNA-bindende Domäne und modifizierte EcR (GvEcR), eine minimale VP16 Aktivierungsdomäne verschmolzen mit einem GAL4 DNA-bindende Domäne sowie eine modifizierte Drosophila Ecdyson Rezeptor (EcR), ist die neu entwickelte einzigartige Genschalter hoch auf die Gabe von chemischen Induktor in einer Zeit-Dosis-abhängigen Weise reagieren. Der pEUI(+)-Vektor ist ein potenziell leistungsfähiges Werkzeug zur Verbesserung der Kontrolle des Transgens Ausdruck in der biologischen Forschung und prä-klinischen Studien. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Modulation eines transiente und stabile Transgen Ausdrucks mit pEUI(+) Vektor durch die Behandlung von Tebufenozide (Teb). Darüber hinaus geben wir wichtige Hinweise für die Verwendung von Teb als eine chemische Induktor.
Introduction
Mehrere verschiedene Genschalter wurden für ihre Fähigkeit, präzise regulieren Transgene Expression in Zellkulturen und Tiermodellen, mit unterschiedlichem Erfolg1,2,3untersucht. Potenzielle gen Schaltanlagen sollten mehrere strenge Kriterien, einschließlich treffen: präzise gerichtete Expression des Transgens, Dosierung und zeitabhängig Reaktionsvermögens zu induzieren, vernachlässigbar Undichtigkeit des Promoters, Reversibilität des Transgens Aktivierung durch Entfernung der Induktor und Induktor Toxizität erträglich zu Zell-Linien und Labor Tiere1,2,3. Mehrere kleine Molekül Induktoren wurden ausgebeutet, einschließlich Tetracyclin4,5, Rapamycin6,7,8, Mifepriston9,10, und Ecdyson11,12,13,14. In der Regel diese Systeme erfordern mindestens zwei Plasmide mit zwei oder drei diskrete Ausdruck Einheiten, ein oder zwei davon zu komponieren ein regulatorisches Element (Induktor Plasmid), das bindet eine kleines Molekül-Induktor transkriptionelle Aktivität zu gewinnen; und ein weiteres Plasmid (Effektor Plasmid), enthält das Transgen unter der Kontrolle einer regulatorischen DNA-Region, die den Zugang von der Induktor-gebundenen regulatorisches Element ermöglicht. Der größte Nachteil des binären Systems ist, dass es die gleichzeitige Einführung der beiden Vektoren (Induktor und Effektor) in die Zielzelle erfordert. In Transienten Transgene Ausdruck Experimente produziert die gleichzeitige Transfektion von zwei Plasmide unweigerlich eine Population von Zellen, die einzeln mit dem Induktor oder der Effektor transfiziert oder Co ungleich transfiziert. Darüber hinaus erfordert das binäre System mindestens zwei Runden von Antibiotika Auswahl, stabilen Zelllinien zu etablieren, das ist zeitaufwändig und mühsam. So verbindet alle Komponenten für die Expression des Transgens erforderlich und Verordnung in einem einzigen Vektor wäre ideal, um den gleichzeitigen Ausdruck alle erforderlichen Elemente in einer einzelnen Zelle zu gewährleisten und ermöglichen für die Regulierung der Expression des Transgens durch die Behandlung mit kleinen Moleküls induzieren.
Um die Mängel der binären Genschalter zu überwinden, entwickelten wir vor kurzem eine singuläre Genschalter mit einem Drosophila Melanogaster EcR-basierte gen induzierbaren System15. Ecdyson vermittelt Genexpression, wenn es um die EcR/Ultraspiracle (USP)-Heterodimer, bindet die Bindung von der EKR auf DNA-regulatorischen Elementen3,11wiederum induziert. Der vertebrate Retinoid X-Rezeptor (RXR), ein Ortholog des Insekts USP, Rekruten EcR um eine aktive transcriptional Aktivator16bilden. So, für die gezielte Expression von Transgen in vertebrate Zellen oder Gewebe, die EcR und RXR Co ausgedrückt gleichzeitig muss vor stimuliert durch Ecdyson oder seine Agonisten. Da die endogene RXR Ebene, Padidam Et Aldie heterodimerisierenden Funktion des Schalters EcR-basierte gen beeinflusst werden kann. ersetzt die EcR DNA-Bindung und Aktivierung Domains mit heterologen GAL4 DNA-Bindung, Herpes-Simplex-Virus-Protein-vmw65 (VP16) Aktivierung Domänen miteinander verschmolzen, die EcR Liganden-bindende Domäne, die dann wurde reagiert nicht auf endogene RXR und bildeten ein Homodimer transkriptionelle Aktivität17zu gewinnen. Die EcR-basierte Genschalter wurde weiter verbessert, durch den Bau ein chimäres Protein bestehend aus minimal VP16 Aktivierungsdomäne, kombiniert mit GvEcR, die ein Homodimer gebildet und in der Zellflüssigkeit in Ermangelung Ecdyson Agonist, Teb16lokalisiert, 18. Durch die Bindung an Teb, verändert die GvEcR seiner subzelluläre Lokalisation aus dem Zytosol in den Zellkern zu erkennen, ein Hybrid-Promotor bestehend aus Zebrafisch E1b minimal Förderer mit einem zehn Tandem kombiniert wiederholt vorgelagerten Aktivierung Sequenzen (Drohnen) zu initiieren die Transkription der Ziel-gen16.
Zur Vereinfachung der bisher gemeldeten EcR-basierte Gens schaltet16,18, wir kombiniert die binäre Funktionen des Systems in einen einzigen Vektor, ausgestattet mit allen erforderlichen Elementen für anregende Transgene Ausdruck und dann bezeichnet die neu generierten Vektor, pEUI(+) (GenBank Zbl-Nummer: KP123436, Abbildung 1A)15. Der Effektor reagieren auf den GvEcR-Treiber (im folgenden Treiber) besteht aus zehn Tandem UAS neben einem E1b minimal Förderer, gefolgt von einer Site mit mehreren Klonen (MCS) wiederholt mit EcoRI, PmlI NheI, BmtI, AfeI und AflII Erkennungssequenzen (Abbildung 1 b). Zusätzlich, um die Auswahl zu erleichtern transfizierten Zellen, einer SV40 Projektträger-gesteuerte Puromycin N-Acetyl-Transferase (PAC) Gen wurde zwischen den Fahrer und Effektor Regionen weiterhin stabilen Zelllinien (Abbildung 1) gelegt.
Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die transiente und stabile Modulation des Transgens Ausdruck mit pEUI(+). Darüber hinaus bieten wir detaillierte Anweisungen für den erfolgreichen Einsatz von Teb als Agonist Ecdyson.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der größte Nachteil der Verwendung eines binären Genschalter Ausdruck ist die Notwendigkeit, zwei separate Plasmide (Fahrer und Effektor) gleichzeitig in die Zielzelle zu liefern. Dies führt zu einer ungleichen Verteilung von Plasmiden und Ergebnis in einer inkonsistenten Antwort des Schalters auf der Induktoren1,2,3. Ein weiterer Nachteil der zwei-Vektor-System ist, dass ein Minimum von zwei Runden von Antibiotika Auswahl e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken für wertvolle Kommentare und gründlichen Lektüre unserer Handschrift S-Y Choi (Chonnam National University). Diese Arbeit wurde durch einen Forschungsfonds der Chungnam National University unterstützt.
Materials
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
References
- Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
- Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
- Suzuki, Y., Suzuki, Y., Xu, K. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. , 285-309 (2011).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
- Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).
- Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
- Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).
- Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).
- Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).
- Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).
- Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).
- Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).
- Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).
- Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).
- Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).
- Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N’-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).
- Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).
- Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).
- McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).
- Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).
- Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
- Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).
- Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).
