En isoinokosterone reseptor-baserte entall Gene bryter for bevisst uttrykk for Transgene robusthet, Reversibilitet og ubetydelig Leakiness
Summary
Her presenterer vi en protokoll for modulering av transgene uttrykk bryteren pEUI(+) entall genet av tebufenozide behandling.
Abstract
Presis kontroll av transgene uttrykk er ønskelig i biologiske og kliniske studier. Men fordi funksjonen binær for tiden ansatt gen-svitsjer krever overføring av to terapeutiske uttrykk enheter samtidig i en enkelt celle, er praktisk anvendelse av systemet for genterapi begrenset. For å forenkle transgene uttrykk systemet, generert vi en genet bryter som pEUI(+) omfatter et komplett sett av transgene uttrykk moduler i en enkelt vektor. Bestående av GAL4 DNA-bindende domenet og endret EcR (GvEcR), et minimalt VP16 aktivisering domene smeltet sammen med en GAL4 DNA-bindende domene, samt en modifisert Drosophila isoinokosterone reseptor (EcR), bryteren nyutviklet entall genet er svært lydhør overfor administrasjonen av en kjemisk induser på en gang – og dosering-avhengige måte. PEUI(+) vektor er en potensielt mektig verktøy for bedre kontroll av transgene uttrykk i både biologiske og pre-kliniske studier. Her presenterer vi en detaljert protokoll for modulering av en forbigående og stabil transgene uttrykk med pEUI(+) vektor ved behandling av tebufenozide (Teb). I tillegg dele vi viktige retningslinjer for bruk av Teb som en kjemisk induser.
Introduction
Flere forskjellige genet brytere utforsket for sin evne til å regulere nettopp transgene uttrykk i cellekultur og dyr modeller, med varierende grad av suksess1,2,3. Potensielle genet bryteren systemer skal møte flere strenge kriterier, inkludert: presis retningsbestemt uttrykk av transgene, dosering – og tidsavhengige respons å indusere, ubetydelig leakiness til promoter, Reversibilitet av transgene aktivisering gjennom induser fjerning og induser toksisitet nivåer tålelig linjer og laboratoriet dyr1,2,3. Flere små molekyl indusere har vært utnyttet, inkludert tetracycline4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10, og isoinokosterone11,12,13,14. Generelt, disse systemene krever minst to plasmider som inneholder to eller tre separate uttrykk enheter, en eller to av som komponere et regulatorisk element (induser plasmider) som binder et lite molekyl induser å få transcriptional aktivitet. og en annen plasmider (effektor plasmider) som inneholder transgene under kontroll av en regulerende DNA region som gir tilgang til induser-bundet regulatoriske elementet. Det hovedavdeling ulempen av binære systemet er at det krever samtidig innføring av to vektorer (induser og effektor) i målcellen. I forbigående transgene uttrykk eksperimenter gir den samtidige transfection av to plasmider uunngåelig en populasjon av celler som enkeltvis transfekterte induser eller effektor eller co transfekterte ulikt. I tillegg krever det binære systemet minst to runder av antibiotikumet utvalg å etablere stabil cellelinjer, som er tidkrevende og arbeidskrevende. Dermed kombinere alle komponentene som kreves for transgene uttrykk og regulering i en enkelt vektor ville være ideelt å garantere samtidig uttrykk for alle de nødvendige elementene i en enkelt celle og tillate regulering av transgene uttrykk gjennom behandling med små molekyl indusere.
For å overvinne manglene ved binære genet brytere, utviklet vi nylig en entall genet bryter, bruker en Drosophila melanogaster EcR-baserte genet induserbart systemet15. Isoinokosterone formidler genuttrykk når det binder seg til EcR/ultraspiracle (USP) heterodimer, som igjen medfører binding av EcR DNA regulatoriske elementer3,11. Virveldyr retinoid X reseptoren (RXR), en ortholog av insekt USP, rekrutter EcR for å danne en aktiv transcriptional aktivator16. Dermed for målrettet uttrykk for en transgene i virveldyr celler og vev må EcR og RXR co uttrykt samtidig før blitt stimulert av isoinokosterone eller dens agonister. Siden funksjonen heterodimeric i bryteren EcR-baserte genet kan være påvirket av endogene RXR nivå, Padidam et al. erstattet EcR DNA-bindende og aktivisering domener med heterologous GAL4 DNA-binding, herpes simplex virus protein vmw65 (VP16) aktivisering domener smeltet EcR ligand-bindende domenet, som deretter svarer til endogene RXR og dannet en homodimer få transcriptional aktivitet17. Bryteren EcR-baserte genet ble ytterligere forbedret ved å opprette et chimeric protein består av minimal VP16 aktivisering domene kombinert med GvEcR, som dannet en homodimer og lokalisert i stoffer i fravær av isoinokosterone Agonistiske, Teb16, 18. Ved binding til Teb, GvEcR endret beliggenheten subcellular fra stoffer til kjernen å gjenkjenne en hybrid promoter består av sebrafisk E1b minimal promoter kombinert med en ti tandem gjentatt oppstrøms aktivisering sekvenser (UASs) for å starte den transkripsjon av målet gen16.
For å forenkle tidligere rapportert EcR-baserte genet bytter16,18, kombineres binære funksjonene i systemet i en enkelt vektor utstyrt med alle de nødvendige elementene for stimulerende transgene uttrykket, og deretter utpekt den nyopprettede vektoren, pEUI(+) (GenBank tiltredelse nummer: KP123436, figur 1A)15. Effektor svarer på GvEcR-driver (heretter driver) består av ti tandem UAS gjentar ved en E1b minimal promoter etterfulgt av en flere kloning område (MCS) med EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI og AflII anerkjennelse sekvenser (figur 1B). I tillegg til lette valg av transfekterte celler, en SV40 promoter-drevet puromycin N-acetylen-transferase (PAC) genet ble plassert mellom regionene driveren og effektor å opprettholde stabil cellelinjer (figur 1).
Vi beskriver en detaljert protokoll for forbigående og stabil modulering av transgene uttrykk med pEUI(+). Dessuten, har vi detaljerte instrukser for vellykket bruk av Teb som en isoinokosterone Agonistiske.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viktigste ulempen med å bruke en binær gene expression bryter er behovet for å samtidig levere to separate plasmider (sjåfør og effektor) inn i målcellen. Dette kan føre til en ulik fordeling av plasmider og resultere i en inkonsekvent respons på bryteren til indusere1,2,3. En annen mangel av to-vector er at minst to runder av antibiotikumet utvalg er nødvendig å identifisere lovende linjer. Derfor har en gen-induserba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker S-Y Choi (Chonnam National University) for verdifulle kommentarer og grundig lesning av våre manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en research fund av Chungnam National University.
Materials
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
References
- Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
- Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
- Suzuki, Y., Suzuki, Y., Xu, K. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. , 285-309 (2011).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
- Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).
- Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
- Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).
- Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).
- Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).
- Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).
- Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).
- Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).
- Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).
- Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).
- Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).
- Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N’-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).
- Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).
- Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).
- McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).
- Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).
- Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
- Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).
- Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).
