Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade
Summary
Burada, bir protokol tarafından tebufenozide tedavi pEUI(+) tekil gen anahtarını kullanarak transgene ifade modülasyon için mevcut.
Abstract
Hassas kontrol transgene ifade biyolojik ve klinik çalışmalarda tercih edilir. Ancak, şu anda istihdam gen anahtarları ikili özelliği iki tedavi edici ifade ünite transferi aynı anda tek bir hücreye gerektirdiğinden, gen tedavisi için sisteminin pratik uygulama sınırlıdır. Transgene ifade sistemi basitleştirmek için tek bir vektör transgene ifade modüllerde eksiksiz bir dizi kapsayan pEUI(+) olarak belirlenmiş bir gen anahtarı oluşturulur. GAL4 DNA’ya bağlanıcı etki alanını oluşan ve değiştirilmiş EcR (GvEcR), en az bir VP16 harekete geçirmek etki GAL4 DNA’ya bağlanıcı etki alanı, hem de değiştirilmiş Drosophila ecdysone reseptör (EcR), ile erimiş yeni geliştirilen tekil gen anahtarı son derece olduğunu kimyasal bir uyarıcı bir saat ve doz bağımlı şekilde yönetimi için duyarlı. PEUI(+) vektör transgene ifade Biyolojik araştırma ve önceden klinik çalışmalar kontrolünü geliştirmek için potansiyel olarak güçlü bir araçtır. Burada, detaylı bir iletişim kuralı modülasyonu pEUI(+) vektör tebufenozide (Teb) tedavi ile kullanarak bir geçici ve istikrarlı transgene ifade için mevcut. Ayrıca, kimyasal bir uyarıcı olarak Teb kullanımı için önemli bir yönerge paylaşıyoruz.
Introduction
Tam olarak hücre kültürü ve hayvan modellerinde başarı1,2,3değişen derecelerde transgene ifade düzenlemek yeteneklerini için birkaç farklı gen anahtar incelemiş bulunuyoruz. Potansiyel gen anahtar sistemleri de dahil olmak üzere birkaç sıkı kriterleri karşılamak: hassas yönlü ifade transgene, dozaj ve zaman bağımlı kavramaları indükleyicileri, düzenleyicinin önemsiz leakiness, transgene reversibility etkinleştirme uyarıcı kaldırma ve uyarıcı toksisite düzeyleri hücre satırları ve laboratuvar hayvanları1,2,3için tolere edilebilir. Birkaç küçük molekül indükleyicileri, tetrasiklin4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10da dahil olmak üzere istismar, ve ecdysone11,12,13,14. Genel olarak, bu sistemler, iki ya da üç ayrı ifade birimleri içeren en az iki plazmid gerektirir, bir ya da iki tanesi transkripsiyon etkinlik kazanmak için bir küçük molekül uyarıcı bağlar bir düzenleyici öğesi (uyarıcı plazmid) oluşturmak; ve başka bir plazmid (efektör plazmid) uyarıcı bağlı yasal öğe erişim sağlar düzenleyici bir DNA bölge kontrol altında transgene içeren. En büyük dezavantajı ikili sistemdeki hedef hücre içine iki vektörlerin (uyarıcı ve efektör) giriş eşlik eden gerektirmesidir. Geçici transgene ifade denemelerinde iki plazmid aynı anda transfection kaçınılmaz bir nüfus tek başına uyarıcı ya da efektör ile transfected veya unequally co transfected hücre üretir. Ayrıca, ikili sistem istikrarlı hücre hatları, zaman alan ve zahmetli olan kurmak için antibiyotik seçimi en az iki tur gerektirir. Bu nedenle, tüm bileşenleri birleştirerek transgene ifade için gerekli ve yönetmelik tek bir vektör içine tek bir hücredeki tüm gerekli öğeleri eşlik eden ifade garanti ve transgene ifade Yönetmeliği için izin vermek ideal olacaktır Küçük molekül indükleyicileri ile tedavi yoluyla.
İkili gen anahtarları eksikliklerin üstesinden gelmek için biz son zamanlarda bir tekil gen anahtar, bir Drosophila melanogaster EcR tabanlı gen indüklenebilir sistem15kullanılarak geliştirilmiş. Sırayla DNA düzenleyici elemanlarının3,11EcR bağlama indükler EcR/ultraspiracle (USP) heterodimerdir için bağlandığında ecdysone gen ekspresyonu aracılık eder. Omurgalı retinoid X reseptör (RXR), böcek USP, bir ortholog bir etkin transkripsiyon aktivatör16oluşturmak için EcR acemi. Böylece, omurgalı hücreleri veya doku transgene hedeflenen ifadesi için EcR ve RXR aynı anda ecdysone veya onun agonistler tarafından daha önce uyarılmış ortak ifade olması gerekir. Heterodimeric özelliği EcR tabanlı gen anahtarının endojen RXR düzeyi, Padidam ve arktarafından etkilenmiş olabilir beri. EcR DNA’ya bağlanıcı ve harekete geçirmek etki alanları kapaklı GAL4 DNA’ya bağlanıcı ile herpes simpleks virüs protein vmw65 yerine (VP16) etkinleştirme etki alanları erimiş olan o zaman endojen RXR tepkisiz oldu ve bir homodimer oluşan EcR ligand bağlayıcı etki Transkripsiyon etkinliği17kazanmak için. EcR tabanlı gen anahtar en az VP16 harekete geçirmek etki alanı olan bir homodimer oluşmuş ve ecdysone agonist, Teb16yokluğunda sitozol lokalize GvEcR ile birlikte oluşan bir chimeric protein oluşturmak yoluyla daha da geliştirildi, 18. Teb için bağlama tarafından GvEcR onun hücre altı yerelleştirme sitozol en az organizatörü kombine ile on bir tandem Zebra balığı E1b oluşan bir karma organizatörü ters yönde harekete geçirmek dizileri (UASs) başlatmak için tekrar tanımak için çekirdek değişti Transkripsiyon hedef gene16.
Daha önce raporlanmış EcR tabanlı gen basitleştirmek için16,18geçer, uyarıcı transgene ifade için tüm gerekli öğeleri ile donatılmış ve daha sonra belirlenen bir tek vektör ikili sistemin özelliklerini kombine Yeni oluşturulan vektör pEUI(+) (GenBank üyelik numarası: KP123436, şekil 1A)15. GvEcR sürücü (bundan sonra sürücü) yanıt efektör on tandem birden çok klonlama sitesi (MCS) tarafından takip E1b en az organizatörü yanındaki UAS tekrarlar, EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ve AflII tanıma dizileri ile (şekil 1B) oluşur. Buna ek olarak, seçimi kolaylaştırmak için transfected hücreleri, bir SV40 organizatörü tahrik puromisindir N-asetil-transferaz (PAC) gen istikrarlı hücre satır (şekil 1) korumak için sürücü ve efektör bölgeler arasında yerleştirildi.
Biz transgene ifade pEUI(+) kullanarak geçici ve istikrarlı modülasyon için detaylı bir protokol tanımlamak. Buna ek olarak, bir ecdysone agonist TEB’in başarılı kullanımı için ayrıntılı yönergeler sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir ikili gen ifade anahtarı kullanmanın en büyük dezavantajı aynı anda iki ayrı plazmid (sürücü ve efektör) hedef hücreye teslim etmek ihtiyacıdır. Bu eşitsiz dağılımı Plazmid ve tutarsız bir yanıt sonucu indükleyicileri1,2,3geçmek için yol açabilir. İki-vektör sisteminin başka bir eksiklik en az iki el antibiyotik seçimi taahhüdü hücre satırları tanımlamak için gerekli olmasıdır. Bu nedenl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar S-İ Choi (Chonnam National University) değerli yorum ve bizim el yazması ayrıntılı okuma için teşekkür ederiz. Bu eser Chungnam Ulusal Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
References
- Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
- Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
- Suzuki, Y., Suzuki, Y., Xu, K. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. , 285-309 (2011).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
- Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).
- Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
- Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).
- Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).
- Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).
- Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).
- Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).
- Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).
- Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).
- Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).
- Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).
- Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N’-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).
- Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).
- Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).
- McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).
- Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).
- Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
- Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).
- Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).
