Summary
Kalium ioner bidrar til hvile membran potensialet i celler og ekstracellulære K+ konsentrasjon er en viktig regulator av mobilnettet excitability. Beskriver vi hvordan å gjøre, kalibrere og bruke monopolar K+-selektiv microelectrodes. Med slike elektrodene kan måling av elektrisk vakte K+ konsentrasjon dynamikk i voksen hippocampus skiver.
Abstract
Kalium ioner betydelig bidrar til hvile membran potensialet i celler, og derfor ekstracellulære K+ konsentrasjon er en viktig regulator av cellen excitability. Endret konsentrasjoner ekstracellulære K+ påvirker hvile membran potensial og mobilnettet excitability av skiftende likevekt mellom lukket, åpen og deaktivert for spenningen-avhengige ionekanaler som ligger til grunn for handlingen potensial initiering og gjennomføring. Derfor er det verdifullt å måle direkte ekstracellulære K+ dynamikk i helse og syke tilstander. Her beskriver vi hvordan å gjøre, kalibrere og bruke monopolar K+-selektiv microelectrodes. Vi satt dem i voksen hippocampus hjernen skiver å måle elektrisk vakte K+ konsentrasjon dynamics. Forstandig bruk av slike elektrodene er en viktig del av verktøysett for å evaluere mobilnettet og Biofysiske mekanismer som styrer ekstracellulære K+ konsentrasjoner i nervesystemet.
Introduction
Kalium ion konsentrasjoner er strengt regulert i hjernen, og deres svingninger utøver en mektig innflytelse på hvile membran potensialet i alle celler. I lys av disse viktige bidrag er et viktig mål for biologi å fastslå mobilnettet og Biofysiske mekanismene som brukes til å regulere tett konsentrasjonen av K+ på ekstracellulære plass i ulike organer av kroppen1 , 2. et viktig krav i disse studiene er muligheten til å måle K+ konsentrasjoner nøyaktig. Selv om mange komponenter som bidrar til kalium homeostase i hjernen i friske og syke tilstander har blitt identifisert3,4,5, har ytterligere fremgang blitt redusert på grunn av spesialiserte natur forbereder ion selektiv microelectrodes for kalium måling. Microelectrode sensorer representerer gullstandarden for måling K+ konsentrasjoner i vitro, vev skiver og i vivo.
Nyere metoder for K+ overvåking er under utvikling med optiske sensorer, men dette ikke oppdager en biologisk relevante utvalg av K+ konsentrasjoner eller har ikke blitt fullt sjekket i biologiske systemer, selv om resultatene vises lovende6,7,8. Sammenlignet med optiske sensorer, er microelectrodes fundamentalt begrenset til en kilde måling av ioner, selv om elektroden matriser kan forbedre romlig oppløsning9. Denne artikkelen fokuserer på enkelt-barreled microelectrode sensorer for å overvåke K+ dynamics.
I dette arbeidet vi rapporterer detaljert gradvis prosedyrer å gjøre K+ selektiv microelectrodes, med en valinomycin-baserte kalium ionophore som tillater svært selektive (104 brett K+ å Na+ selektivitet) K+ bevegelse over membraner10. En naturlig forekommende polypeptid, valinomycin fungerer som en K+ gjennomtrengelig pore og forenkler flyten av K+ ned den elektrokjemiske gradering. Vi beskriver hvordan å kalibrere elektrodene, lagre og bruke dem og til slutt hvordan du distribuerer dem til å måle K+ konsentrasjon dynamikk i akutt hippocampus hjernen skiver fra voksne mus. Bruk av slike elektroder med genmodifiserte mus som mangler spesifikke ionekanaler foreslått å regulere ekstracellulære K+ dynamics skal avsløre de cellulære mekanismene brukes av nervesystemet for å kontrollere ambient konsentrasjonen av K + i ekstracellulære miljøet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til National Institute of helse Guide og bruk av forsøksdyr og ble godkjent av kansler dyr forskningsutvalg ved University of California, Los Angeles. Alle mus ble plassert med mat og vann tilgjengelig annonsen libitum i 12 h lys og mørke omgivelser. Alle dyrene var friske med ingen åpenbare atferdsendringer, var ikke involvert i tidligere studier og ble ofret under lyset syklus. Data for eksperimenter ble samlet inn fra voksen mus (6-8 uker gammel for alle eksperimenter).
1. utarbeidelse av K+ selektiv microelectrodes
- Silanization av Borosilikatglass
- Fjerne tilstrekkelig glass kapillærer fra emballasje og plasser i en 50 mL konisk rør. Fyll konisk rør til toppen med 1 M HCl. vask elektroder med mild agitasjon i HCl over natten eller i minst 6 timer.
- Skyll kort kapillærene med 70% etanol og tørk helt på 100-120 ° C for 6-8 timer. Lagre vasket kapillærene i beholdere med vannfri kalsium sulfat tørkemiddel 4 uker før videre bruk.
- Før silanization, trekk kapillærene en fin spiss med en microelectrode avtrekker. Microelectrodes som vi bruker er ca 2-5 mikrometer i diameter. Håndter vasket kapillærene med hansker, som oljer fra huden kan forstyrre silanization.
- Plasser microelectrodes i en glassbeholder slik at elektrodene er opphøyet fra bunnen til forhindre tips brekkasje. Fastsette microelectrodes beholderen autoclavable tape eller lignende teip.
- Fjern ca 0,5 mL 5% dichlorodimethylsilane (DDS) silanization løsning fra beholderen med metoden nitrogen erstatning (se figur 2). Fylle en ballong med nitrogen gass og fest en sprøyte eller rør og p til ballongen. Sett inn nålen i beholderen DDS mens du tegner opp DDS separat sprøyter til via en lengre nål.
- Bruke silanization løsningen dropwise tips av Pipetter og umiddelbart dekker. Plass beholderen holder microelectrodes med silanization-løsning i en forvarmes (170-180 ° C) laboratorium ovnen i 10-12 timer eller ved 200-220 ° C i 30 minutter
- Etter inkubasjon, slå av ovnen og deretter fjerne platen fra ovnen. Vær forsiktig når du fjerner platen settefiskanlegg, som det er ekstremt varme. Plass platen på en benk i romtemperatur i 10-15 minutter å tillate glass avkjøles.
- Fjerne microelectrodes fra platen (med et barberblad eller skalpell blad for å kutte båndet) og plassere dem i en tørkemiddel fylt lufttett beholder. Silanized microelectrodes holdes fri for fuktighet kan brukes i opptil 1 uke etter silanization.
- Grunning elektrodene
- Forberede en lagerløsning av K+ ionophore cocktail: 5% w/v valinomycin, 93% v/v 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene, 2% w/v kalium tetrakis(4-chlorophenyl) borate11. Denne løsningen er en svak gul farge. Holde i en lufttett, ugjennomsiktig beholder ved romtemperatur. Hvis riktig lagret denne løsningen kan vare mange måneder.
- Forberede en lagerløsning 10 mm HEPES bufret 300 mM NaCl ved pH 7.4. Fastsette elektroden i en klemme og etterfylle med den bufrede NaCl bruker en 28G microfil tips koblet til en sprøyte. Observere at saltvann har nådd slutten av microelectrode spissen. Bekreft at microelectrode er store bobler som kan forstyrre flyten av gjeldende.
- Bryte spissen av elektroden til ca 10-20 µm bred, bruker blunt siden av en skalpell eller barberblad.
- Brønnene, bruk en liten dråpe (~0.1 µl) av K+ ionophore nær spissen av microelectrode. Hvis elektroden er blitt riktig silanized slippverktøyet blir absorbert inn brutt spissen. Fyll elektroden til 1-2 mm med K+ ionophore og fjern overflødig bruk silkepapir.
2. kalibrering av K+ selektiv Microelectrodes
- Utarbeidelse av kalibrering løsninger
- Forberede løsninger av ulike konsentrasjoner av KCl i lik osmolaritet kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) ved å erstatte NaCl med KCl. Vi brukte 0.1, 1, 4.5, 10 og 100 mM K+ ACSF, for kalibrering av elektrodene. Oppskrifter for følgende kalibrering er oppført i tabell 1.
| Kjemisk | MW | siste mM | 0,1 mM [K +] | 1 mM [K +] | 4,5 [K +] | 10 mM [K +] | 100 mM [K +] |
| (g / mol) | |||||||
| NaCl | 58.44 | varierer | 1.51 g | 1,50 g | 1,44 g | 1.4 g | 0.345 g |
| KCl | 1 M lager | varierer | 20 µl | 200 µl | 900 µl | 2 ml | 20 ml |
| CaCl2 | 1 M lager | 2 | 400 µl | ||||
| MgCl2 | 1 M lager | 1 | 200 µl | ||||
| NaH2PO4 | 119.98 | 1.2 | 0.29 g | ||||
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 0.437 g | ||||
| D-glukose | 180.16 | 10 | 0.360 g | ||||
| Vann | QS 200 ml | ||||||
Tabell 1. Kalium kalibrering løsninger
- Microelectrode kalibrering
- Boble alle løsninger med 95% O2/5% CO2 i minst 20 minutter før du starter eksperimentet. Starte perfusing bad med 4,5 [K+] ACSF med en hastighet på 3 mL per minutt. Plasser K+ selektiv elektroden i elektrodeholderen festet til elektroden headstage på manipulatoren. Denne headstage er koblet til en passende forsterker. Sett tuppen av elektroden i Bad perfusate.
- Sikre Ag/AgCl bakken elektroden er badet i den samme løsningen og at strømmen er jevn. Bruke kalibrering løsninger i en gradvis mote og Registrer den mulige endringer i mV over elektroden spissen. Vent potensial på elektroden spissen til å nå et stabilt verdi før neste løsning
- Måle steady state voltage endre svar til programmet kalibrering løsninger til elektroden spissen. Bekrefte at skråningen av elektroden svaret er minst 52 og ikke større enn 58 mV per Logg endring i [K+].
3. forberedelse av akutt hippocampus hjernen skiver
- Utarbeidelse av skive løsninger
- Forberede 500 mL sukrose kutte løsningen består av: 194 mM sukrose, 30 mM NaCl, 4,5 KCl, 10 mM D-glukose, 1 mM MgCl2, 1.2 mM NaH2PO4, og 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, mettet med 95% O2 og 5% CO2.
- Forberede 1-2 liter innspillingen løsning (ACSF) består av: 124 mM NaCl, 4,5 KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glukose, 2 mM CaCl2, 1.2 mM NaH2PO4og 26 mM NaHCO3; pH 7.3-7.4 (etter boblende), 290-300 mOsm, mettet med 95% O2 og 5% CO2. Fylle et beger som inneholder en hjernen stykke holder kammer med innspillingen løsning og holde det ved 32-34 ° C. Fyll vibratome kammeret med isvann forespørselen.
- Akutt skive forberedelse
- Dypt bedøve musen ved å plassere den i en bjelle krukke precharged med 2-3 mL isoflurane. Kontroller for tå knipe refleks, og hvis frakobling raskt halshugge det med en skarp saks eller giljotinen som dyr protokollen krever.
- Gjøre en 2-3 cm snitt ved hjelp av saks fra caudal delen av skull kutte hodebunnen langs midtlinjen. Mens manuelt trekke i hodebunnen, gjør to 1 cm horisontale incisions fra de foramen magnum langs sidene av skallen. Deretter bruker fine sakser, kuttet et snitt lengden på skallen, langs midtlinjen fra baksiden av skallen til nesen.
- Bruke fine tang satt inn midtlinjen, trekke radert skallen i to deler. Musen hjernen fra skallen og bruker et blad fjerne lillehjernen og olfactory pærene, som er henholdsvis plassert på den caudal og rostral delen av hjernen. Disse kan bli identifisert av store sprekker, som skiller dem fra cortex.
- Montere hjernen blokken på vibratome skuffen bruker superlim. Fyll vibratome skuffen med iskald kutte løsning.
- Kuttet vev deler på koronale flyet på 300 µm tykkelse. Vanligvis kan 6 koronale hippocampus skiver samles.
- Etter hver del er kuttet, øyeblikkelig overføre skiver til stykket holder kanne varmet til 32-34° C. Holde delene ved denne temperaturen for 20 min før du fjerner begeret inneholder delene og sted dette ved romtemperatur for minst 20-30 minutter før opptak.
4. måling av elektrisk vakte K+ Dynamics
- Definere skive forberedelse
- Forsiktig plassere hjernen sektoren i badekaret med en Pasteur pipette og hold det på plass med en platina harpe nylon strenger.
- Sikre tips av bipolar stimulerende elektroden er parallelle med hverandre og nivå med flyet av stykket. Sakte, i løpet av 6-7 sekunder inn elektrodene CA3 stratum radiatum ca 40-50 µm dypt for å stimulere Schaffer materiell. I framskaffet, kan CA3 bli ca identifisert som delen av hippocampus riktig sideveis på granule celle laget på hippocampus genu, med stratum radiatum faller mediale og ventrale på pyramideformet celle laget.
- Nøye setter K+-selektiv elektrode i CA1 stratum radiatum ca 50 µm dypt, ved å senke sakte elektroden over ca 3-4 sekunder. Tillate potensial til å stabilisere over elektroden før du bruker stimulations på stykket: Dette skjer vanligvis 5 til 10 minutter. Hvis skive utstillinger spontan endringer i ekstracellulære K+ deretter forkaste og gjenta prosessen med et nytt stykke.
- Måle vakte K+ utgivelse
- Bruk tog for elektrisk stimulering (8 pulser) ved manuelt deprimerende utløseren på stimulator mens digitalt svar. Bruke stimulering 10 Hz og 1 ms pulsbredde, starter på 10 µA stimulans amplitude.
- Bruke økende stimulering amplituder med en faktor på 2 til en maksimal K+ svar amplituden oppdages. Hvis du ikke ser noen respons, flytte K+ elektroden nærmere til stimulering området i 100 µm i intervaller
- Bestemme stimulans amplituden som produserer halvparten maksimal svaret. I vår erfaring er mellom 40-160 µA, avhengig av den forberedelse kvalitet, dyret, og avstanden mellom stimulering elektroder og K+ selektiv elektroden.
- I samme stykke, bruker en stimulans amplituden på ett trinn lavere enn amplituden som produserer halvparten maksimal svaret (f.eks hvis 80 µA produserer en halv maksimal respons, bruker 40 µA) bruke stimulans tog av økende antall pulser. Først har vi brukt tog 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 og 128 pulser.
- For å bekrefte at K+ signaler er formidlet av handlingen potensial avfyring av elektrisk stimulert Schaffer collaterals badekaret, gjelder 0,5 µM TTX i ACSF i 10 minutter og gjenta stimulering protokollen. Ingen vakte svar praktiseres.
- Etter endt skive eksperimentet, bekrefte elektroden har beholdt sin responsivity ved å kalibrere elektroden kalibrering løsninger og sikre svaret har ikke avveket med mer enn 10% fra første kalibreringen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For selektiv måling ekstracellulære k+forberedt vi ion-selektiv microelectrodes belagt med et hydrofobe lag gjennom silanization av ren Borosilikatglass Pipetter (figur 1A). Dette belegg kan K+ ionophore som inneholder valinomycin for å hvile på spissen av elektroden og tillater bare K+ flux gjennom en smal åpning på elektroden spissen (figur 1B). Etter grunning elektrodene fylt saltvann og K+ ionophore, kan elektrodene bli testet for deres raske og lineær respons på gradvis endringer i Bad K+ konsentrasjoner (figur 3A) og deres svar bad K+ endrer over kalibrering området (figur 3B) i saltvann eller ACSF på en måte spådd av han ligning2. Endringen i steady state potensielle kan tegnes mot badekaret K+ konsentrasjon for å finne stigningstallet for linjen skal ca 58,2 mV per Logg [K+], han ligningen, og ikke mindre enn 52 mV per Logg [K+] (Figur 3 c). Vi i tillegg testet responsen til K+ selektiv elektrodene og fant at de svarte til en 5,5 i K+ med økning og forfall tid konstantene av ca 85 ms (figur 3D,E).
Elektrofysiologiske opptak riggen består av et standard oppreist mikroskop tilkoblet en LCD-skjerm for identifisere plasseringen av den stimulerende og ta elektroder. Ingen spesielle optikk er nødvendig for visuell plassering av K+ og stimulering elektroder; Vi bruker en 5 x eller 10 x linsen og hvitt lys fra en halogenlyspære, men en hvit LED kan brukes i stedet. Stimulerende elektroden er knyttet til produksjon av en stimulans isolator, som leverer depolarizing gjeldende via tidsbestemt levering pulser fra en stimulator eller andre slike tidsmåler. Med andre ord, leverer stimulator tog 2 V 10-20 Hz timing pulser til stimulans isolator. Ved mottak pulserer, leverer stimulans isolator da ønskede gjeldende til stimulering elektrodene. Innspillingen elektroden er koblet til en elektrodeholderen, koblet til en headstage, forsterker og A/D styret, som grensesnitt til en PC med elektrofysiologiske innspillingen programvare (figur 4A). Når elektroden er kalibrert og akutt sektorene har utarbeidet, kan sektoren plasseres i ACSF perfusate. Å stimulere Schaffer materiell, K+-selektiv elektrode plasseres innenfor CA1 stratum radiatum og feltet stimulering elektroden er plassert i CA3 (figur 4B).
Når elektrodene er plassert og K+ innspillingen har nådd en stabil plan, deretter pulser av økende gjeldende amplituden kan brukes på stykket (figur 5, topp). Bølgeform denne aktiviteten vises som en rask økning i K+ med en eksponensiell decay rente, som er avskaffet med TTX program (figur 5, bunnen).
Figur 1 : Av silanization reaksjon og K+ selektiv microelectrode arkitektur. A. skjematisk fremstilling av silanization reaksjon mellom synlige polar hydroksyl gruppene av Borosilikatglass og silanization reagens dichlorodimethylsilane (DDS). Denne reaksjonen gjengir overflaten av glasset hydrofobe, hvilke innrømmer K+ -ionophore til en tynn skive. B. Diagram av K+ selektiv microelectrode. K+ selektiv løsningen er plass i et 1-2 mm tykt lag på spissen elektroden er fylt med saltvann. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Diagram DDS ekstraksjon. Skjematisk fremstilling av nitrogen erstatning prosedyren for DDS utvinning fra en beholder. DDS er flyktig og brennbare og kan reagere voldsomt med atmosfæriske gassene når den er i høye konsentrasjoner derfor er det nødvendig å erstatte DDS fjernet med inert nitrogen gass. En ballong fylt med nitrogen er koblet til en nål via en sprøyte eller aktuelle rør. Denne p inn gjennom tetningsmasse på beholderen tillater nitrogen-gasstrømmen (N2) i beholderen. Separat, er en lang (3-10 cm) nål koblet til en 1 mL sprøyte og satt inn i beholderen. Denne sprøyte brukes deretter trekke ut DDS, mens bare nitrogen gass kan angi beholderen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Kalibrering av microelectrodes. A. bad perfusjon anvendelse av ulike K+ konsentrasjoner i saltvann kan raskt og reversibel produsere Nernstian endringer i potensial over elektroden spissen. B. gradvis anvendelse av K+ i ACSF fremkaller en karakteristisk og stabil endring i elektrode tips potensial. C. tomt mV endring av K+ selektiv elektroden som svar på økende konsentrasjoner av K+ i fire elektroder; R2 er 0.9995 for disse fire elektroder. D. Rask perfusjon bad systemprogrammet på 10 mM K+ forårsaker trinn svar i spenning over K+ selektiv elektrode spissen. E. tomt målt svaret tid (tau i ms). ingen forskjell mellom stige og forfall ble oppdaget (mener ± SEM, p = 0.939, to sample t-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Apparater for ekstracellulære K+ måling. A. elektrofysiologi riggen består av et mikroskop fast til en anti-vibrasjon tabell med et tilkoblet kamera og LCD-skjerm for skive visualisering. K+ elektroden fast til headstage, forsterker og analog til digital styret som utganger signalet til en tilkoblet PC med elektrofysiologiske innspillingen programvare. Elektrisk stimulering elektrodene er koblet til en stimulans isolator som varierer stimulering amplituden og en stimulator timing stimulans levering. B. Diagram av skive utarbeidelse og plasseringen av plasseringen av ulike elektrodene på stykket. CA3 kan identifiseres som delen av hippocampus riktig sideveis på granule celle laget på hippocampus genu, ca med stratum radiatum faller rostral på pyramideformet celle laget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Måling av elektrisk vakte K+ utgivelsen. Representant spor av K+ slipp fra opptak elektroden under basale forhold (øverst) og deres tap ved bruk av tetrodotoxin (0,25 µM) i 5 minutter før opptak (nederst). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som beskriver vi her har tillatt oss å vurdere K+ dynamics svar på elektrisk stimulering av Schaffer collaterals i akutt hippocampus skiver fra voksne mus. Vår metode for å forberede K+ ion selektive microelectrodes ligner på tidligere beskrevet prosedyrer12,13,14,15. Denne metoden har imidlertid fordeler over alternative elektrode konfigurasjoner i at det er rask og ukomplisert å forberede K+ selektiv microelectrodes. Etter riktig kalibrering, disse elektrodene fant robust måle K+ dynamics i skiver under elektrisk stimulering, og slike svar ble blokkert av TTX. I disse eksperimentene, ble stimulations av 80-160 uA ved 10 brukt; optimalisering av stimulering betingelser for et bestemt eksperiment og en hjerne interesseområde vil imidlertid være nødvendig. Disse verdiene vises som en guide.
Skråningen av responsen av elektrodene skal 58,2 mV per Logg [K+]. Så verdi er spådd fra han og Nicolsky-Eisenman ligninger et K+ selektiv halvt gjennomtrengelig membran; sistnevnte bedre står for interaksjoner mellom ioner16. Hvis elektroden ikke fungerer på forventet måte, kan dette være for en av to hovedgrunner. Første kan silanization være utilstrekkelig, forårsaker membranen å være tapt eller salt broer til skjemaet. Bekreft at membranen er intakt ved observasjon gjennom mikroskop, bør det være et klart grensesnitt mellom pipette løsningen og membranen. En annen grunn, kan være tilstedeværelsen av bobler i pipette som hindrer flyten av gjeldende fra sølv klorid ledningen. Hvis boblene er observert, deretter fjerne pipette og flick kraftig for å fjerne dem. Hvis disse løsningene mislykkes, re-Make en annen K+ selektiv elektrode eller gjenta silanization for lenger eller ved høyere temperaturer. Det er imidlertid viktig å gjenta disse nøkkelen kontrollerer hver gang en ny hjernen regionen er studert eller en ny microelectrode er testet.
To bestemte forsterkere ble brukt i disse eksperimentene, men andre forsterkere kan brukes så lenge inngangsimpedans er større enn eller lik for 500 MΩ. Har kalibrert elektrodene med både 500 MΩ og 5 GΩ inn impedances, fant vi det var ingen forskjell i skråningen av spenning svaret enten innstillingen over et utvalg av K+ konsentrasjoner (56.9 ± 0,7 og 56,5 ± 0,9 mV per tidoble endring i [K+ < / C1 >] for 500 MΩ og 5 GΩ inngang impedances, henholdsvis; P = 0.759, sammenkoblet t-test, n = 4 elektroder).
Vi brukte også rask løsning brytere for å anslå responstid for elektrodene til en kjent hoppe i [K+] fra 4.5 10 mm (figur 3D). Elektrodene svarte med økning og forfall (tau) 85 ± 12 og 85 + 15 ms, henholdsvis. Dette svare løsning exchange kinetics for våre tilpasset rask løsning Skiftelokomotiv var 85 ± 27 ms. derfor K+ selektiv elektrodene med kinetics så fort som løsning switcher vi ansatt og langt raskere enn dynamikken i K+ i ekstracellulære miljøet som følge av Schaffer sikkerhetsstillelse stimulering (figur 5). Disse data tyder på at K+ selektiv elektrodene kan brukes til å beregne the kinetics av K+ akkumulering og klarering i hjernevevet. Men i fremtiden fungere egnede kontroller og kalibreringer vil være nødvendig på et sak-til-sak grunnlag. Vi foreslår at det er verdifullt å tilbringe tid å forstå løsning exchange kinetics i din innspillingen kammer.
Vi fant tre kritisk viktige faktorer som påvirker kvaliteten og robusthet av K+ målinger i skiver. Først er kvaliteten på utarbeidelse, både tissue sunnhet og alder av dyrene brukes synes å være relevant. For denne studien, har vi brukt C57/Bl6N musene som ~ 12 ukens gamle. I sjeldne tilfeller fant vi skiver med spontan K+ svingninger beløper seg til ~0.1 mM og varig 5-10 sekunder. disse sektorene ble forkastet. Andre er kvaliteten på opptaket microelectrode. Det primære spørsmålet er tid og temperatur som brukes for silanization av trakk glasset kapillær. Vi anbefaler > 170 ° C i minst 6 timer (opptil overnatting er akseptabelt) eller på 200 ° C i 30 minutter. Utilstrekkelig varme av elektrodene med silanization reagensen kan føre til elektroder som ikke opprettholde en stabil tilstand potensial på grunn av gradvis tap av K+ -ionophore. I tillegg når forbereder elektrodene, anbefaler vi å plassere et tynt lag (1-2 mm) med ionophore K+ i spissen med en diameter på 10-20 µm dvs på omtrent på størrelse med en gjennomsnittlig celle kroppen (figur 1B). Bryte ikke spissen svært bred, eller K+ selektiv membranen mister integritet og elektroden vil mislykkes. Dette trinnet krever litt øvelse å oppnå tips av riktig størrelse. K+ selektiv elektroder med for fin tips eller for tykk for et lag kan ha treg svar, sammenlignet med riktig konstruert elektroder. Den tredje faktoren er avstanden mellom stimulering elektroden og K+ selektiv elektroden. Vi har brukt en Inter elektrode avstand på ca 500 µm, men optimal avstanden kan variere betydelig med området personlige hjernen og må nøye vurderes for det bestemte eksperimentet for hånden.
I tillegg til enkelt fat konfigurasjonen, det finnes flere metoder for å lage K+-selektiv microelectrodes i bipolar og konsentriske formater17. Sammenlignet med de publiserte beskrivelsene av disse metodene, enkeltkanals elektroder har to viktigste ulempene: 1) en litt større tuppens diameter (~ 10 vs 4 µm), som kunne anledning større forstyrrelsen ekstracellulære plass comparted bipolar og konsentriske elektroder og 2) inkompatibilitet med samtidig måling av flere ion arter som bipolar elektrodene. Enkeltkanals elektrodene tilbyr imidlertid flere fordeler. Spesielt disse elektrodene kan fremstille i mindre enn fem minutter og er derfor mer disponibel og kan gjøres og kalibrert raskt før eksperimenter. Risikoen for elektrode brudd under kurset eksperimenter er derfor mindre betydning. I tillegg fordi bakken elektroden og opptak elektrode er fysisk atskilt med volumet badet, er det ingen sjanse for dannelsen av salt broer på spissen av elektroden, som kan føre til elektroden svikt i konsentriske og bipolar elektroder. Responstid for enkeltkanals elektrodene er raskere enn bipolar elektroder og sannsynlig sammenlignes konsentriske elektroder (~ 20 ms), selv om rask perfusjon systemet bare tillatt en måling av responstid på 80 ms (figur 3E ). Videre tilbyr disse elektrodene lavere støy i forhold til bipolare elektrodene, som har større tips motstand og krever bruk av forsterkere med høyere input motstand. Til slutt, disse elektrodene ikke krever bruk av en spesialisert micromanipulator eller headstage som kreves for konsentriske elektroder. På balanse oppveier fordelene ved bygging og brukervennlighet av enkeltkanals elektroder ulempene.
Tilnærmingen som vi brukes her til å måle K+ dynamics i skiver kan brukes i mange områder av hjernen for å studere K+ regulering. Selv om denne protokollen viser bruken av K+-selektiv elektroder målinger av dynamikken i elektrisk vakte kalium ioner i hjernen vev, denne protokollen kan grovt brukes i mange ulike vev der det er ønskelig å måle K+ dynamics. Slike situasjoner kan inkludere spontan dynamikk og endringer i respons til farmakologisk, optogenetic, eller chemogenetic aktivering. Disse microelectrodes kan gjøres med tilstrekkelig kvalitet og pålitelighet som tillater rask integrering av denne teknikken i et laboratorium verktøykassen. De detaljerte analysene for K+ i helse og syke tilstander gjør ytterligere gjenkjenning og kvantifisering av hvordan ulike molekylær og cellulære komponenter bidrar til hvile K+ konsentrasjoner i hjernen3, 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Khakh lab ble støttet av NIH MH104069. Mody laboratoriet ble støttet av NIH NS030549. J.C.O. takk NIH T32-Grant(NS058280) for trening av Neural Microcircuits.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
- McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer. Sunderland, MA. 507 (2001).
- Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
- Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
- Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
- Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
- Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
- Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
- Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
- Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
- Amzica, F., Steriade, M. The functional significance of K-complexes. Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).
- MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
- Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
- Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
- Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
