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Behavior

Sondare i limiti del riconoscimento uovo utilizzando esperimenti di rifiuto uovo lungo gradienti fenotipiche

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/57512
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 4, 5, 1
1Department of Biology, Long Island University-Post, 2Department of Animal Biology, School of Integrative Biology, University of Illinois, 3Departamento de Ecología, Genética y Evolución, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 4Department of Zoology and Laboratory of Ornithology, Palacký University, 5Institute of Vertebrate Biology, Academy of Sciences of the Czech Republic

Summary

Questo protocollo fornisce linee guida per l'esecuzione di esperimenti di rifiuto di uovo: tecniche relative alla struttura per pittura sperimentale uovo modelli da emulare i colori delle uova di uccello naturale, lo svolgimento di lavoro sul campo e analizzare i dati raccolti. Questo protocollo fornisce un metodo uniforme per lo svolgimento di esperimenti di rifiuto uovo comparabili.

Abstract

Parassiti depongono le uova nei nidi di altre femmine, lasciando i genitori ospitanti per schiudersi e posteriore i loro piccoli. Studi come parassiti manipolare gli host in allevamento loro piccoli e come padroni di casa rilevare parassitismo fornire le comprensioni importanti nel campo della biologia coevolutionary. Parassiti, come i cuculi e cowbirds, guadagnano un vantaggio evolutivo, perché non hanno a pagare i costi di allevamento i propri giovani. Tuttavia, questi costi seleziona per difese ospite contro tutte le fasi di sviluppo di parassiti, tra cui uova, giovani e adulti. Gli esperimenti di rifiuto dell'uovo sono il metodo più comune utilizzato per studiare le difese ospite. Durante questi esperimenti, un ricercatore depone un uovo sperimentale in un nido di host e controlla come padroni di casa rispondono. Colore viene spesso manipolato, e l'aspettativa è che la probabilità di discriminazione di uovo e il grado di dissimilarità tra l'host e uovo sperimentale sono positivamente correlati. Questa carta serve come guida per lo svolgimento di esperimenti di rifiuto di uovo da che descrive metodi per la creazione di colori coerenti uovo ad analizzare i risultati di tali esperimenti. Particolare attenzione è data per un nuovo metodo che coinvolgono le uova in modo univoco colorate lungo gradienti di colore che ha il potenziale per esplorare pregiudizi di colore nel riconoscimento di host. Senza standardizzazione, non è possibile confrontare i risultati tra gli studi in modo significativo; un protocollo standard all'interno di questo campo permetterà per risultati sempre più precisi e comparabili per ulteriori esperimenti.

Introduction

Parassiti depongono le uova nei nidi di altre specie che possono quindi allevare i loro piccoli e pagare i costi di cure parentali1,2,3. Questo atto di inganno di superare in astuzia l'host da parte del parassita e investigatore per rilevare il parassita da parte dell'host fornisce forti pressioni selettive su entrambi gli attori. In alcuni casi di parassitismo aviaria, riconoscimento dell'ospite di diverse uova parassita seleziona per parassiti che imitano uova host, che produce una corsa agli armamenti evolutiva tra ospite e parassita4. Studiare il parassitismo è importante perché è un sistema modello per lo studio di dinamiche coevolutionary e decisionali allo stato selvatico5. Gli esperimenti di rifiuto dell'uovo sono uno dei metodi più comuni utilizzati per studiare il parassitismo aviaria nel campo e uno strumento importante che gli ecologisti utilizzano per analizzare le interazioni interspecifiche6.

Nel corso di esperimenti di rifiuto di uovo, i ricercatori in genere introducono naturale o uova di modello e valutare la risposta dell'host a queste uova sperimentale per un periodo standardizzato. Tali esperimenti possono coinvolgere lo scambio uova reali (che variano in apparenza) tra nidi7, o la tintura o le superfici di uova reali (facoltativamente aggiungere modelli) e restituirli ai loro nidi originale8o la generazione di modello di pittura delle uova che hanno manipolato la tratti come colore9, spotting10, dimensione11e/o forma12. La risposta dell'ospite alle uova di aspetto variabile in grado di fornire informazioni preziose nel contenuto di informazioni che utilizzano per raggiungere una decisione di rifiuto dell'uovo13 e quanto diversi che uovo deve essere di suscitare una risposta14. Accettazione ottimale soglia teoria15 afferma che i padroni di casa dovrebbe bilanciare i rischi di erroneamente accettando un uovo di parassita (errore di accettazione) o rimuovere erroneamente le proprie uova (errore di rigetto) esaminando la differenza tra le proprie uova (o un modello interno di quelle uova) e le uova del parassita. Come tale, una soglia di accettazione esiste oltre la quale host decidono che uno stimolo è troppo diverso da tollerare. Quando rischio di parassitismo è basso, il rischio di errori di accettazione è inferiore rispetto a quando il rischio di parassitismo è alto; così, le decisioni sono contesto specifico e si sposteranno in modo appropriato come i rischi percepiti cambiamento14,16,17.

Teoria di soglia ottimale accettazione presuppone che i padroni di casa basare le decisioni su variazione continua nei fenotipi ospite e parassita. Pertanto, misurare le risposte ospite di diversi fenotipi di parassita è necessario stabilire come tollerante è una popolazione ospitante (con la propria variante fenotipica) ad una gamma di fenotipi parassitari. Tuttavia, praticamente tutti gli studi precedenti hanno fatto affidamento su uovo categorico colore e maculazione trattamenti (ad es., mimetico/non-mimetico). Solo se fenotipi host guscio d'uovo non variano, che non è un'aspettativa biologicamente pratica, sarebbe direttamente comparabili (indipendentemente dal grado di mimetismo) tutte le risposte. In caso contrario, un modello di "mimetico" uovo varierà in quanto simili è alle uova di host all'interno e tra popolazioni, che potrebbero potenzialmente portare a confusione quando si confrontano i risultati18. La teoria suggerisce che ospitano le decisioni sono basate sulla differenza tra l'uovo del parassita e proprio14, non necessariamente un colore particolare uovo parassita. Pertanto, utilizzando un tipo di modello singolo uovo non è un approccio ideale per testare ipotesi su host decisione soglie o capacità di discriminazione, a meno che la differenza appena evidente (d'ora in avanti JND) tra il tipo di modello di uovo e colore dell'uovo singolo host è il variabile di interesse. Questo vale anche per gli studi sperimentali che scambia o aggiungono uova naturali per testare la risposta dell'ospite per un intervallo di colori19naturali. Tuttavia, mentre questi studi consentono la variazione nei fenotipi ospite e parassita, sono limitati dalla variazione naturale trovata in tratti6, particolarmente quando usando uova conspecifici7.

Al contrario, i ricercatori che fanno uova artificiali di vari colori sono liberi dai vincoli di variazione naturale (ad esempio, possono indagare le risposte a superstimuli20), permettendo loro di sondare i limiti di host percezione6. La ricerca recente ha utilizzato tecniche di romanzo per misurare le risposte ospite attraverso una gamma fenotipica, da uova della pittura sperimentale progettate per abbinare e superare l'intervallo di variazione in guscio d'uovo9 e colori spot21naturali. Studiando le risposte ospite le uova con colori lungo gradienti può scoprire i processi cognitivi sottostanti perché predizioni teoriche, come soglie di accettazione15 o mimetismo si4, sono basati su differenze continue fra tratti. Ad esempio, utilizzando questo approccio, Dainson et al. 21 stabilito che quando contrasto cromatico tra il guscio d'uovo terra colorazione e colorazione spot è superiore, il pettirosso americano Turdus migratorius tende a rifiutare le uova più fortemente. Questa scoperta fornisce preziose indicazioni su come questo host elabora le informazioni, in questo caso attraverso spotting, per decidere se rimuovere un uovo di parassita. Personalizzando le miscele di vernice, i ricercatori possono manipolare precisamente la somiglianza tra colore di un uovo sperimentale e dell'host uovo, standardizzando altri fattori confondenti come spotting modelli10, uovo dimensioni22 e uovo Figura23.

Per incoraggiare ulteriore replica e metareplication24 di uovo classico e recente lavoro di rifiuto, è importante che gli scienziati usano metodologie che sono standardizzati attraverso filogenesi (specie di host diversi)7,22, (popolazioni host diversi)7,22,25,26 di spazio e tempo (stagioni di riproduzione diversi)7,22,25,26 ,27, che è stato fatto solo raramente. Metodologie che non sono stati standardizzati28 più successivamente sono stati indicati per portare a risultati artefactual29,30. Questa carta serve come un insieme di linee guida per i ricercatori che cercano di replicare questo tipo di esperimento di rifiuto di uovo che esamina le risposte alla variazione continua ed evidenzia una serie di importanti concetti metodologici: l'importanza dei nidi di controllo, aprioristicamente ipotesi, metareplication, pseudoreplication e colore e analisi spettrale. Nonostante gli esperimenti di rifiuto di uovo che domina il campo di coevoluzione ospite-parassita aviaria, nessun protocollo completo esiste ancora. Pertanto, queste linee guida sarà una risorsa preziosa per aumentare inter - e intra-laboratorio ripetibilità come la vera prova di qualsiasi ipotesi si trova in metareplication, vale a dire, ripetendo tutto studi attraverso filogenesi, spazio e tempo24, che può essere chiaramente fatto solo quando si utilizzano metodi coerenti29,30,31.

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Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Long Island University-Post.

1. miscelazione vernici acriliche

  1. Mescolare la colorazione del guscio d'uovo terra, che è il colore che coprirà in modo uniforme sull'intera superficie del guscio d'uovo. La seguente ricetta farà 50 g di vernice, che riempirà un po' più di due tubi di vernice alluminio 22 mL.
    1. Generare un colore blu-verde, che rappresenta un guscio d'uovo blu-verde (ad es., un guscio d'uovo di pettirosso americano T. migratorius ), utilizzando g 18,24 del turchese di cobalto chiaro, 20,77 g di bianco di titanio 6,52 g di cobalto verde e 2,86 g del turchese di cobalto e 1,61 g di terra d'ombra bruciata.
    2. Generare un colore marrone, che rappresenta un guscio d'uovo marrone (ad es., un guscio d'uovo di pollo Gallus gallus domesticus ), utilizzando 4,12 g di ossido di ferro rosso, 9,75 g di arancio cadmio, 22,15 g di cruda luce terra d'ombra e 13,97 g di bianco di titanio.
    3. Generare un colore beige, che rappresenta un guscio d'uovo beige (ad es., un guscio d'uovo di quaglia (Coturnix japonica) ), utilizzando 10,60 g di uovo marrone colore, 8,28 g di colore blu-verde, 18,51 g di bianco di titanio e 12,61 g di ocra gialla.
    4. Generare un colore bianco con bianco di titanio senza mescolare.
  2. Mescolare un colore spot marrone scuro che rappresenta i punti trovati su uova di quaglia c. japonica , utilizzando 8,38 g di uovo marrone colore, 26,04 g di terra d'ombra bruciata e 15,59 g di nero di Marte.
  3. Mescolare colori intermedi che abbracciano il gamut di guscio d'uovo dal blu-verde al marrone, miscelazione vernici blu-verde e marrone insieme e variando il loro contributo reciprocamente (ad esempio, parti del blu-verde al marrone vernice: 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6, 4, 5, 5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 e 0:10, vedere Figura 1E).
    1. Per generare più colori intermedi, semplicemente mescolare insieme anche quantitativi di questi colori intermedi e ripetere fino a creare il numero desiderato di colori unici. La miscela anche di blu-verde e marrone produrrà un colore grigio neutro, ma questo colore può essere registrato utilizzando bianco o beige come necessario. Se un colore più esatto (per esempio, di un uovo di host specifico) è necessario, utilizzare modelli di mixaggio dei colori sottrattivo per predire la riflettanza spettrale di combinazioni uniche di vernici e utilizzare la miscela producendo più basso appena evidente differenza (JND) per la colore desiderato (vedere passaggi 3.3 – 3,7).
  4. Negozio di vernice in tubi di vernice alluminio vuoto 22 mL.
    1. Posizionare la vernice in un sacchetto di sandwich di plastica con una piccola porzione di un angolo tagliato. Posizionare l'estremità del sacchetto di plastica nel tubo e spremere la vernice nel tubo, toccando il tubo dolcemente contro la tabella.
    2. Guarnizione tubo usando il bordo adesivo e pieghevole alla fine sopra se almeno 3 – 4 volte.

2. pittura sperimentale uovo modelli

  1. Ottenere modelli sperimentali dell'uovo.
    1. Uova di modello utilizzando un tridimensionale (aldilà, 3D) di stampa della stampante o l'acquisto da un distributore28. Questo semplice approccio è consigliato perché genera le uova che sono di dimensione consistente e forma28.
      Nota: Uova di modello possono anche essere modellate da gesso, argilla, legno o altre sostanze.
  2. Aggiungere uno strato uniforme di bianco di titanio sopra ogni uovo per ostacolare il colore sottostante.
  3. Tenere ogni uovo usando il forcipe, dipingere il colore desiderato utilizzando vernici acriliche di alta qualità e un pennello pulito per ogni uovo di colore in modo univoco.
  4. Utilizzare un asciugacapelli in un luogo fresco impostazione per accelerare il processo di essiccazione di ogni uovo dipinto di fresco.
  5. Utilizzare una carta vetrata per levigare eventuali urti che possono essere l'uovo una volta che l'uovo è completamente asciutto.
    1. Ripetere il passaggio 2.3 fino a quando l'uovo ha un rivestimento anche di vernice senza grumi. Uova richiedono non meno di due mani.
  6. Aggiungere eventuali macchie di uova modello accuratamente applicando questi con un pennello e spruzzi con cura la vernice con uno spazzolino da denti. Solo una sola mano è necessaria.
    Attenzione: Se si desidera la riflettanza (UV) ultravioletto di replica, applicare uno strato uniforme di vernice UV; Tuttavia, questo non è consigliato a meno che il permesso di usare queste vernici è ottenuto da istituzionali, statale/provinciale e federale permettendo uffici.

3. quantificare il colore

  1. Accendere lo spettrometro premendo il pulsante di alimentazione.
  2. Inserire la SD card in slot per schede SD e link per il sistema premendo il rosso Annulla, selezionare "File System" premendo il pulsante verde accetta, selezionare "Trovare schede SD" premendo il menu tasto up. In seguito, premere il pulsante rosso Annulla due volte oppure premendo il tasto home.
  3. Collegare i cavi in fibra ottica di spettrometro e luce sorgente.
    1. Collegare l'estremità etichettato "Sorgente luminosa" al modulo-luce e collegare l'estremità etichettato "Spettrometro" al modulo spettrometro.
  4. Inserire la punta della sonda sull'estremità della sonda in fibra ottica.
    Nota: La punta della sonda un esempio stampabile su una stampante 3D è disponibile come un File di codice supplementare. Questo oggetto richiederà la filettatura di una vite a testa zigrinata di vostra scelta.
    1. Stabilire una distanza (per esempio, 5 mm) tra il campione e la sonda di misurazione che massimizza il rapporto segnale-rumore. Garantire una distanza di misurazione coerente utilizzando un righello flessibile.
      Nota: La distanza esatta può variare con la combinazione unica di ogni singolo spettrometro di grata e larghezza della feritoia, larghezza ottica e fonte di luce. Mantenere la stessa distanza per tutte le misurazioni. Una regola flessibile è disponibile per il download come un File di codice supplementare.
    2. Utilizzare un angolo di misurazione normale coincidente (90°), a meno che l'ospite naturale uova o modello uova hanno una superficie lucida, nel qual caso utilizzare un angolo di coincidente misura obliquo di 45°. Misurare tutte le uova, reale e artificiale, utilizzando lo stesso angolo.
    3. Lavare la punta della sonda con etanolo al 95%.
  5. Accendere la sorgente di luce premendo il pulsante giù tre volte, selezionare PX-lampada premendo il pulsante verde accetta, selezionare Setup premendo il tasto di scorrimento destro, selezionare "Timing controlli" premendo il tasto di scorrimento destro, il down tre volte e quindi selezionare libero funzionamento premendo il pulsante accetta.
    1. Aspettare almeno 15 minuti prima di ogni misurazione.
  6. Calibrare e configurare lo spettrometro. Per effettuare questa operazione, premere il tasto home, quindi selezionare "Strumenti" premendo la pergamena di sinistra pulsante, selezionare "Controllo manuale" premendo il menu tasto e selezionare "Acquisire parametri" premendo il menu tasto up.
    1. Impostare boxcar lisciatura a cinque premendo il tasto di scorrimento destro, spostando il cursore a destra di due spazi premendo due volte il tasto di scorrimento destro, e quindi aumentare l'impostazione di boxcar premendo menu pulsante su cinque volte. Selezionare "Accetta" premendo il pulsante verde accetta una volta completato.
    2. Set medie a 10 premendo il menu verso il basso pulsante, poi spostando a destra due luoghi premendo due volte il tasto di scorrimento destro e regolando il valore in decine posto premendo una volta il menu tasto up e spostando a quelli posto premendo il tasto destro o di scorrimento NCE e riducendo a zero premendo una volta il menu verso il basso pulsante. Selezionare "Accetta" premendo il pulsante verde accetta una volta completato.
    3. Premere il tasto home, selezionare riflettanza premendo il menu tasto up e posizionare la sonda saldamente sullo standard bianco. Memorizzare quindi uno standard di riferimento bianco premendo il menu tasto up. Memorizzare un standard scuro premendo il tasto di scorrimento destro e Mostra la riflettanza premendo il menu verso il basso pulsante.
  7. Misurare la riflettanza di ogni guscio d'uovo sei volte misurando due volte vicino al Polo smussato (più larga di uovo), due volte all'Equatore dell'uovo e due volte vicino al Polo tagliente (estremità più stretta). Assicurati di segnalare se le macchie sono evitati o no. Questo condotta su uova sperimentale come pure le uova dell'ospite.
  8. Utilizzare una funzione polinomiale localmente ponderata con un 0.25 nm levigante span per attenuare il rumore in curve di riflettanza, usando colore analisi software29. Se il gol di colore, quali luminosità, non sono ripetibili in modo significativo tra le regioni del modello uovo (punto 3.7), ridisegnato l'uovo (passaggi 2.2 – 2,6); in caso contrario, media la colorazione del modello uovo attraverso l'uovo.
  9. Decidere sul set più appropriato di sensibilità relativa del fotoricettore per la domanda.
    Nota: Questo può essere un generico ultravioletto sensibile o violetto sensibile uccello, o una volta può scegliere di modello di sensibilità relative30,31,32.
  10. Quantificare la quantistica catture33 per ogni fotorecettore, sia singolo34 e doppio coni35,36, integrando il prodotto di riflettanza guscio d'uovo, sensibilità del fotoricettore e un appropriato spettro di irraggiamento attraverso lo spettro visivo aviaria (cioè, 300 – 700 nm).
    1. Quantum relativo uso prendere stime per generare le coordinate all'interno il colore tetraedrico aviaria spazio33,37. Garantire che, a differenza di catture di quantum, questi relativo quantum catture somme a 1.
  11. Le catture di quantum di uso (punto 3.10) per stimare la discriminability, in JND, tra guscio d'uovo ospite di colore (Vedi punto 2.6.1) e i colori percepiti di ciascun uovo straniero utilizzando un modello visual rumore-limitato neurale32 , 38 , 39.
    1. Misurare la colorazione di guscio d'uovo dell'host utilizzando la stesso spettrometro e la sorgente di luce utilizzata per misurare le uova di modello (punto 3.7), se possibile.
      Nota: Considerazioni di ordine pratici o logistici può rendere questo impossibile, nel qual caso misurare un sottoinsieme delle uova di host da diversi nidi per stabilire una colorazione media host guscio d'uovo.
    2. Utilizzare una frazione di Weber per il cono lungo-onda-sensibili di 0.140.
    3. Rappresentano l'abbondanza relativa di coni e il membro principale del doppio cono30.
      Nota: Se i colori di uovo utilizzati sono solo su una pendenza corrispondenti ai colori naturali di guscio d'uovo, la JND tra l'host e uovo sperimentale può essere moltiplicato per 1 o -1 per differenziare le differenze su uno dei due estremi (per esempio, blu-verde o marrone, Vedi passi 1.1.1–1.1.2). Se uovo colori utilizzati cadono attraverso molteplici sfumature o riempiono lo spazio di colore, riassumere le differenze di colore percepibile tra uova utilizzando percettivamente uniforme cromaticità diagrammi41. Le coordinate all'interno di questo tipo di diagramma descrive la direzione e l'entità delle differenze di colore percepito tra uova sperimentale e colore dell'uovo di host e questi possono essere utilizzati in ulteriori analisi.

4. campo di lavoro

  1. Determinare la specie di studiare.
    Nota: I fattori da considerare includono (ma non sono limitati a) l'abbondanza della specie ospite e/o parassita e se l'host è una stretta42 o puntura43 rejecter, che avrà un impatto il tipo di uovo da utilizzare (ad esempio, non utilizzare duro uova di modello artificiale per puntura eiettori44).
  2. Sistematicamente cercare nidi nell'area di studio. Controllare il precedente record di nidificazione che può fornire un punto di partenza ragionevole in alcune specie45.
    Nota: Marcatori visibili o segnalazione può aumentare il rischio di predazione46; Pertanto, è consigliabile utilizzare un palmare GPS.
  3. Monitorare quei nidi quotidianamente utilizzando metodi di registrazione diretta o video per registrare la presenza di ogni uovo ospite fino all'inizio dell'esperimento (punto 4.4); ad esempio, un giorno dopo il completamento di frizione.
    Nota: Questo monitoraggio quotidiano continuerà fino a quando l'esperimento ha concluso (punto 4.6).
    1. Ascolta per le chiamate di allarme effettuate dagli adulti e lasciare la zona, se continuano per più di 30 s. Non si avvicini a un nido quando qualsiasi potenziale predatore di nido è presente, soprattutto se si tratta di un predatore orientato visivamente (ad es., corvidi).
    2. Approccio e lasciare nidi da posizioni diverse, vale a dire, a piedi passato nidi, quindi mammiferi predatori non possono seguire i segnali chimici direttamente ai nidi.
      Nota: Questo approccio potrebbe essere impraticabile in alcuni habitat, vale a dire densi canneti.
    3. Ridurre sempre al minimo il disturbo fisico per il nido e l'area attorno al nido.
    4. Non avvicinarsi a nidi durante il periodo di costruzione del nido, perché molti uccelli abbandoneranno i nidi se vengono disturbati prima della deposizione delle uova46.
  4. Aggiungere delicatamente un uovo sperimentale al nido di un host facendo scivolare il lato della tazza di nido. Non far cadere i modelli sperimentali che possa danneggiare le uova dell'ospite.
    Nota: Assegnare casualmente trattamenti.
    1. Record se il genitore ospitante rimane vicino e ha così l'opportunità di testimoniare l'atto di parassitismo artificiale47. Record e statisticamente controllo per una variabile che indica se l'host è stato scaricato dal nido47. Condotta, introduzioni di uovo mentre il padre è lontano.
    2. Raccogliere un uovo di host se il parassita nel sistema rimuove un uovo di host.
      Nota: Questo può non essere necessario in host dove uovo rimozione non influisce risposta ospite alla sperimentale uova22.
  5. Impiegare un set di nidi di controllo (nidi che sono visitati, controllato e uova uovo gestito ma non sperimentale viene aggiunto o scambiato) per determinare i tassi di abbandono nido naturale. Rimuovere un uovo di host dal nido controllo solo se vengono rimossi dai nidi sperimentali (Vedi punto 4.5.1).
    Nota: Questo è fondamentale perché diserzione non può essere una risposta mirata a certe uova estranee ma può essere una risposta per altri tipi di uova.
    1. Scegliere il numero di controllo nidi a priori basato su delle dimensioni dei campioni conosciuti o aspettati e stimato l'effetto. Assegnare ogni nido nth come un nido di controllo fino a quando la determinazione statistica se nido diserzioni sono una risposta ospite a uova sperimentale o non può essere ottenuta (punto 5.1).
      Nota: Se viene rimosso un uovo di host, rimuovere lo stesso numero di uova di host come trattamento sperimentale, tenere un host uovo in mano per 5 s e quindi sostituire esso e rimanere al nido per la stessa durata di tempo come trattamento nidi. Se le uova host non vengono rimossi, tenere un host uovo in mano per 5 s e quindi sostituire esso, rimangono al nido per la quantità di tempo trascorso in nidi sperimentali (ad esempio, 10 s).
  6. Rivisitare il nido abbastanza per determinare la risposta al nido di ciascun host, inclusi i controlli. Controllare il nido entro poche ore della manipolazione sperimentale.
    Nota: In alcune specie, respingimenti possono verificarsi lo stesso giorno come parassitismo sperimentale; Pertanto, è importante controllare il nido entro poche ore di manipolazione sperimentale48.
    1. Utilizzare uno specchio telescopico quando si controlla il nido per evitare il contatto diretto con il nido o la frizione.
    2. Evitare osservazioni in caso di maltempo (pioggia, calore o freddo) perché ciò può aumentare il pericolo per i nidiacei e le uova46.
    3. Eseguire controlli giornalieri fino a quando l'host ha risposto all'uovo introdotto o una certa quantità di tempo è passato.
      Nota: Per convenzione, se l'uovo rimane nel nido per 5 – 6 giorni, l'host è considerato un accettore22; Tuttavia, alcuni individui host rispondono anche più tardi49 , e l'omissione di tali risposte necessariamente biases uovo rifiuto tasso stime. Idealmente, i ricercatori dovrebbero determinare il superiore 95% allargare intervallo di latenza al rifiuto nel loro sistema e usare questo come loro criterio.

5. statistiche analisi

  1. Utilizzare il test esatto di Fisher, una in uno studio randomizzato perfettamente (cioè, sperimentale e controllo nidi sono perfettamente sparpagliati e così non differiscono in posa data, frizione o qualsiasi altro parametro noti per influenzare la diserzione di nido) per confrontare il numero di diserzioni tra controllo (punto 4.5) e nidi di trattamenti. In caso contrario, utilizzare un modello lineare generalizzato (GLM) con covariate potenzialmente rilevanti (Vedi sotto), come un approccio generalmente più cauto.
    1. Se sperimentali nidi hanno un tasso significativamente più alto di diserzione di nidi di controllo, codice sia rimosso le uova e le uova abbandonate come 'rifiutato'.
      Nota: Per convenzione l'host ha 'rifiutato' l'uovo quando ha riconosciuto l'uovo del parassita e sia stato rimosso o abbandonato (con il nido tutto).
    2. Se tassi di diserzione non differiscono tra sperimentale e di controllo nidi, escludere diserzioni dall'analisi, perché non sono una risposta ospite a parassitismo e codice risposte come 'espulso'.
      Nota: Per convenzione, 'espulso' intende quando un uovo è stato effettivamente rimosso dal nido.
    3. Registrare la data e l'ora quando l'host ha rifiutato l'uovo. Ricodificare la variabile di risposta a seconda delle tue scoperte su passaggi 5.1.1–5.1.2.
  2. Report test esatto di Fisher, il rapporto di probabilità associato e relativo intervallo di confidenza adeguato.
  3. Decidere su qualsiasi significativi covariate che verranno aggiunti ai modelli predittivi (ad esempio, passaggi 5.4 – 5.5).
    1. Specificare la codifica (ad esempio, continuo, categorica o ordinale) di ogni covariata.
    2. Codice le date come giorni ordinale e centro date separatamente all'interno di anni per rimuovere qualsiasi potenziale confondono dovuto variazione attribuibile ad anni o stagionalità7,47,50,51.
    3. Centro qualsiasi covariate coinvolti in un'interazione per consentire più facile interpretazione dei loro termini di ordine inferiore nel modello in uscita.
      Nota: Scaling covariate permette il semplice confronto degli effetti tra gli studi e a volte possono migliorare la convergenza del modello.
  4. Predire le risposte ospite (espellere o respingere vs accettare) utilizzando un modello lineare generalizzato (GLM) o un modello lineare generalizzato di misto (GLMM) con una distribuzione binomiale errore e la funzione link logit.
    Nota: La scelta tra un GLM o GLMM dipende dai dati e se tra cui un effetto casuale (ad esempio, ID nido, anno). Fattori casuali dovrebbero avere almeno 5 livelli varianze altrimenti rischiano di essere scarsamente stimato52.
    1. Segnalare il coefficiente di determinazione (solitamente R2) per mostrare quale percentuale della varianza è stata spiegata da un modello lineare53,54.
  5. Predire quanto tempo ci vuole l'uccello per rispondere al parassitismo sperimentale utilizzando un GLM con una distribuzione binomiale negativa di errore (o una distribuzione di Poisson errore se i dati non sono overdispersed) e accedere a link.
    Nota: I ricercatori si riferiscono alla lunghezza del tempo che ci vuole per un uccello di rispondere come latenza di risposta, che è segnalata con precisione per giorni, tale che le uova respinte il giorno dell'esperimento hanno una latenza pari a zero. Modello variabili di risposta con troppi zeri (> 50%) utilizzando zero-gonfiato o transenna modelli55.
  6. Utilizzare strumenti di diagnostica per verificare se il modello prevede i dati in modo soddisfacente e relazione statistica Riepilogo modello per quantificare quale proporzione del modello di varianza spiegata56 , 57. segnalare il coefficiente di determinazione (solitamente R2), vedere il punto 5.4.2.
    1. Convalida dei modelli binomiale negativi tramite la convalida grafica producendo un plot quantile-quantile e tramando residui di Pearson contro i valori di misura.
      Nota: Un modello ben gestito non avrà alcun outlier o modelli imprevisti55.
    2. Convalida dei modelli binomiali utilizzando test di bontà di adattamento come test di Hosmer-Lemeshow e altri strumenti di diagnostica disponibili nel pacchetto R, 'binomTools'58 contenente l'intero set di strumenti diagnostici.
  7. Considera il controllo per le covariate coerente ai fini della coerenza e comparabilità fra gli studi.
    Nota: Covariate comuni includono frizione formato22, posa data59, nidificare manipolazione49, all'età e se l'host è stato svuotato dal nido o non47. Gli studi di molti, soprattutto all'inizio, non hanno utilizzato alcun covariate. Gli autori dovrebbero considerare inoltre analizzando gli effetti di tipi di uovo (o vari gradienti) senza covariate per rendere i loro risultati quantitativamente paragonabile a questi studi manca covariate.
    1. Utilizzare un approccio teorico-informazioni e segnalare il risultato di una media di molti potenziali modelli spiegando host comportamento60.
      Nota: In alternativa, utilizzare l'analisi di regressione graduale come un algoritmo di selezione modello61. I ricercatori dovrebbero utilizzare un criterio predefinito (ad esempio, registrato R2, degli Mallows Cp, di Akaike Information Criterion, di Schwarz BIC o p-valore) e fornire sia il modello completo (con covariate comuni) e un modello ridotto finale.

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Representative Results

Generazione di modelli uovo variopinto

Spettri di riflettanza di miscele di verniciatura personalizzata e uova naturali sono mostrati in Figura 1A-D. Miscele di vernice utilizzate negli studi di parassitismo dovrebbero corrispondere fedelmente con misure di riflettanza naturale in termini di forma spettrale (colore) e magnitudine (luminosità). Se che è raggiunto, il colore dell'uovo sperimentale dovrebbe essere percepito dall'host come un colore naturale d'uovo. Per valutare il riconoscimento di host, queste riflettanze dovrebbero essere trasformate in uno spazio colore aviaria pertinenti. A tal fine, il prodotto di questi spettri di riflettanza, irraggiamento solare e la sensibilità del fotoricettore può essere integrato per il calcolo quantistico catture33. Percezione di colore aviaria è diversa da quello in esseri umani, perché gli uccelli vedono colori utilizzando fotorecettori quattro, anziché tre. La cattura di quantum da questi quattro recettori può essere trasformata in coordinate all'interno di uno spazio di colore tetraedrico (Figura 1E), dove ogni vertice rappresenta la stimolazione relativa di un fotorecettore specifiche: ultravioletto, breve, medio e lungo lunghezza d'onda sensibili fotorecettori37. Le coordinate all'interno di questo spazio forniscono un metodo per confrontare i colori e diversità fenotipica dei colori, che è relativamente limitata rispetto al colore di uccelli gusci d'uovo62. Stampa colore sperimentale dell'uovo in uno spazio colore è importante perché le loro coordinate all'interno di quello spazio determinerà se queste uova sembrerebbe naturale. La figura 1 illustra i colori delle vernici personalizzate (puntini colorati, lettere corrispondono con gli spettri di riflettanza mostrati in Figura 1A-D) che sono descritti in questa carta e come si confronta con colori guscio d'uovo naturale degli uccelli. Questo approccio novello fornisce opportunità per nuovi disegni sperimentali e può fornire nuove intuizioni riconoscimento uovo host.

Quantificare le risposte ospite a guscio d'uovo colori

Esplicitamente o implicitamente, tutti tranne uno studio precedente di9 ha assunto che padroni di casa rispondono a dissomiglianza di tratto, ad esempio, la differenza tra un uovo di parassita e loro, in modo assoluto o simmetrico (Figura 2, tratteggiata). Questa differenza varia solitamente da identici (0) a infinitamente diversi; Tuttavia, la maggior parte delle caratteristiche variano lungo molteplici dimensioni e c'è senza una ragione a priori ad assumere le loro risposte dovrebbe essere simile in tutto lo spazio fenotipico. Ricerca che manipola i tratti attraverso il proprio areale pieno fenotipica (Figura 2, solido), può testare questa ipotesi. Per due Turdus spp., Hanley et al. 9 trovato che tra un uovo marrone e blu-verde, entrambi ugualmente diversi dal proprio, l'host l'uovo marrone era più probabilità di essere respinto. Utilizzando modelli di uovo con coordinate note all'interno di uno spazio di colore aviaria (Figura 1E), i ricercatori possono lavorare all'interno della gamma fenotipica naturale o estendere tale gamma fenotipica (ad es., verso il blu-verde o marrone) per esplorare la risposta dell'ospite e sonda i limiti percettivi del riconoscimento di host. Tale approccio fornisce un contesto (basato su spazio fenotipico) per comprendere le risposte dei padroni di casa.

Quantificare le risposte ospite a guscio d'uovo colori spot

Un recente studio21 ha mostrato che Pettirossi americani hanno maggiori probabilità di rifiutare uova sperimentale maculate quando percepiscono quelle macchie marroni come quella del colore blu-verde di guscio d'uovo (Figura 3). Questo host depone uova immacolate, ma loro parassita il Molothrus ater Molothrus ater ha macchie marroni e di conseguenza, questa regola di decisione sembra adattiva. Questi risultati rinforzano i risultati precedenti che hanno dimostrato che American robins basare le decisioni su entrambi terra colore e punti13; Tuttavia, misurando le loro risposte attraverso un colore gradiente Dainson et al sono stati in grado di stabilire che Pettirossi americani utilizzano il contrasto cromatico tra terra e tinta piatta all'uovo rifiuto decisioni21. Disegni sperimentali che impiegano tale variazione continua in colorazione consentono ai ricercatori di esplorare il ruolo di host sensoriale e meccanismi percettivi in uovo riconoscimento più a fondo.

Figure 1
Figura 1: variazione rappresentante in colori naturali di guscio d'uovo aviaria e artificiali. La media di dieci misure di riflettanza spettrale di (A), il blu-verde, beige (B), (C) marrone, bianco (D) e (E) miscele di vernice marrone scuro (1.2.1 a 1.2.5, linee continue) a fianco la riflettanza di un vero e proprio uovo con un aspetto simile: pettirosso americano (A) T. migratorius, (B) quaglia c. japonica, un marrone (C) e (D) bianco uovo di pollo domestico g. Gallus domesticus (linee tratteggiate). Il picco in riflettanza ultravioletto a (D) è a causa della rimozione della cuticola67. Inserto di fotografie di uova reali sulle uova artificiali e sinistra a sinistra per scalare (la barra sopra "artificiale" rappresenta 1 cm). L'immagine dell'uovo di quaglia reale (nel riquadro B) è stata modificata da una fotografia scattata da Roger Culos che è con licenza CC BY 4.0. Vi illustriamo gli uccelli adulti come immagini di inserto (crediti fotografici di uccello inserti rispettivamente A-D: Tomáš Grim, Ingrid Taylar sotto CC BY 2.0, Sheroole Dejungen sotto CC-BY-SA-3.0). I colori percepiti aviaria tracciati anche all'interno dello spazio di colore tetraedrico aviaria (E) per lo spettatore medio di aviaria ultravioletto-sensibili. I vertici rappresentano il relativo stimolo dei raggi ultravioletti (U), brevi (S), medio (M) e lunghi fotorecettori di lunghezza d'onda-sensibile (L). Puntini grigi rappresentano i colori di uova aviaria naturale attraverso la diversità filogenetica completa66, i dati precedentemente pubblicati68, mentre i punti colorati rappresentano i colori delle formulazioni di verniciatura personalizzata qui (passi 1.1.1 a 1,2), e piccoli punti solidi rappresentano colori intermedi (punto 1.3). Lettere in corsivo al lato di puntini colorati fanno riferimento a differenza della riflettanza spettrale mostrato in questa figura, mentre (e) fa riferimento le macchie scure da un uovo di quaglia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: respingimenti uovo ospite rappresentativo delle uova con colorazione variabile di guscio d'uovo. Tradizionalmente, la probabilità di rigetto (tratteggiata) previsto per un host si basa sull'assoluto percepito differenza tra uovo uovo straniero e i padroni di casa (vale a dire, come l'uovo straniero è più diversa risposte a quell'uovo sono più probabili, non importa la direzione della differenza nello spazio di colore). Questa pratica ignora naturale variazione nel colore dell'uovo dell'host. Tuttavia, è più probabile che Pettirossi americani (N = 52) rifiuterà uova marroni rispetto altrettanto dissimili uova blu-verde (linea continua), che evidenzia l'importanza dell'esame delle risposte dell'ospite attraverso un gradiente fenotipica9. Questa figura è stata modificata da Hanley et al. 9 e questi dati65 sono con licenza CC BY 4.0. Inserto uova sono rappresentativi della gamma colore, ma le loro posizioni sono approssimative. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.  

Figure 3
Figura 3: rifiuto di uovo ospite rappresentativo delle uova con colorazione spot variabile. Il contrasto cromatico (JND) tra le tinte piatte dipinte sulle uova modello sperimentale e il colore di questi modelli ha predetto la risposta dell'ospite (0 = accettazione, 1 = espulsione) nel pettirosso americano. Questa figura è stata modificata da Dainson et al. 21. inset uova rappresentano variazione nella colorazione spot utilizzato, ma le loro posizioni sono approssimative. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Anche se gli esperimenti di rifiuto dell'uovo sono il metodo più comune per studiare coulors parassita-ospite coevolution66, sforzi concertati per standardizzare i materiali, tecniche, o protocolli sono carenti. Questo è particolarmente problematico per le meta-analisi. Nessuna meta-analisi, a nostra conoscenza, del rifiuto di uovo host finora ha controllato per differenze metodologiche tra studi67,68, tra cui quello che è considerato mimetico o non-mimetico. Questo rappresenta un grosso problema perché mimetiche (per gli standard umani) uova possono essere rifiutate dai padroni di casa più spesso che apparentemente non-mimetico quelli69, che dimostra che la classificazione di colore dell'essere umano è sia insufficiente e inadeguato per inferenze per quanto riguarda aviaria cognizione18. Inoltre, la meta-analisi ignorano il fatto che alcuni studi, anche della stessa specie ospite, gestito diserzioni in modo diverso, o contarli come risposte22 o escludendoli dall'analisi7,67, 68. Inoltre, incorrettamente uovo modelli come uova o non-mimetico o mimetiche, può portare a fallace comparazioni tra gli studi che entrambi utilizzati queste classificazioni per i tipi di modello differenti uovo70. Differenze tra studi1,70 possono riflettere sia differenze nel design studio (ad esempio, tipi di modello dell'uovo) o differenze tra popolazioni, entrambi ad un grado sconosciuto; Questo impedisce la chiara interpretazione delle differenze e preclude respingendo l'ipotesi di null e alternativi. Questo protocollo fornisce un approccio standardizzato per uovo esperimenti di rifiuto e sottolinea in particolare la colorazione e quantificare il colore dei modelli di uovo. Seguenti o adeguamento (e in modo adeguato reporting) questo protocollo dovrebbe promuovere la standardizzazione metodologica necessaria per produttivo dibattito scientifico, confronti Inter-studi e futuri progressi in questo campo di ricerca.

Poiché colorazione guscio d'uovo è determinata dal solo due pigmenti, protoporfirina IX apparendo marrone e biliverdina IXα che appaiono blu-verde62,71,72, guscio d'uovo colori occupano solo una piccola sezione della visione aviaria 62. questa variazione può essere replicata attraverso la formulazione di vernici acriliche che corrispondono colori guscio d'uovo naturale con attenzione, e questo porterà ad una migliore comprensione dei meccanismi di riconoscimento dell'ospite. Ad esempio, Turdus padroni di casa sono più propensi a rifiutare uova marroni rispetto alle uova blu-verde, nonostante l'assoluto percepito differenza di colore tra queste uova estranee e loro proprietari (Figura 2). Responses to uova colorate lungo gradienti di colore variano considerevolmente, evidenziando l'importanza di accuratamente produrre e riprodurre i colori utilizzati in esperimenti di rifiuto di uovo. Variazione anche nella colorazione spot può comportare differenze vistose in host risposta (Figura 3)21. Utilizzando questo approccio, i ricercatori più sistematicamente possono sondare i limiti del riconoscimento di host e scoprire l'importanza relativa di cromatica e vie di luminanza nell'informare ospitano le decisioni.

Nonostante i benefici che questo approccio fornisce per quantificare le risposte ospite attraverso una gamma fenotipica, non è adatto per testare ogni ipotesi. Quando i tassi di rifiuto sono necessari per la verifica di ipotesi, in particolare per i confronti di Inter-popolazione, utilizzando uno o più tipi di modello coerente uovo sarebbe un approccio meno costoso e meno esigente. Ad esempio, presentando uovo specifico modello tipi rappresentativo dei polimorfismi di uovo parassita specifico, in grado di fornire approfondimenti storici e contemporanei selezione pressioni73. Calcolare i tassi di rifiuto è Impossibile quando ogni uovo è un colore univoco; Tuttavia, quantificare le risposte ospite attraverso una gamma di possibili colori di uovo parassitarie possono fornire approfondimenti domande relazionati alle soglie di decisione e le capacità di discriminazione. In particolare, questo approccio fornisce uno strumento per i ricercatori misurare le capacità di discriminazione di uovo di un host. Questo protocollo delinea vernice ricette per contribuire a standardizzare il colore dell'uovo modelli utilizzati per entrambi gli approcci. Inoltre, indipendentemente dall'approccio scelto, i ricercatori dovrebbero riferire le vernici hanno usato per colorare i loro modelli di uovo e dovrebbero quantificare accuratamente quei colori. Questo dovrebbe migliorare confronti Inter-studi e meta-analisi.

Gli studi di rifiuto di uovo con continuo colore, modello, dimensioni e caratteristiche di forma hanno rivoluzionato il campo di studi di corsa agli armamenti aviaria ospite-parassita in combinazione con l'utilizzo ora standard della percezione visiva aviaria modellazione69, 74. ora c'è prova che alcuni host non solo utilizzano la differenza percettiva assoluta tra le uova proprie e straniere nel riconoscimento di uovo, ma invece di basare le decisioni di rigetto del verso di queste differenza lungo il gradiente fenotipico di aviaria color guscio d'uovo9. Ricerca futura dovrebbe utilizzare gli studi di formazione assuefazione/disabitudine o strumentale per valutare se host aviaria parassiti può percepire e discriminare i colori naturali e artificiali uovo in contesti non-uovo riconoscimento. Inoltre, questi stessi esperimenti potrebbero rivelare se corrente-, storico-e gli host non possono distinguere naturale da artificiale guscio d'uovo, che vorrei evidenziare il ruolo dei meccanismi sensoriali nella corsa alle armi coevolutionary. Infine, adeguatamente incorporando e replicare i componenti UV di aviaria uovo colorazione e maculazione in studi di rifiuto di uovo è una sfida necessaria per superare di ricerca futura75; Questo sarà necessario valutare se segnali di colore di base UV uovo rappresentano uno spunto percettivamente saliente o unico per il riconoscimento di uovo e rifiuto in host aviaria parassiti. Utilizzando questo protocollo coerenza, i ricercatori possono creare nuovi esperimenti e più facilmente interpretare e confrontare i loro risultati6,29,30,31.

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Disclosures

L'ottica dell'oceano ha finanziato spese di pagina per questo manoscritto.

Acknowledgments

MEH è stato finanziato dalla HJ Van Cleave cattedra presso l'Università dell'Illinois, Urbana-Champaign. Inoltre, per il finanziamento ringraziamo la Human Frontier Science Program (da m.e.h. e T.G.) e il Fondo sociale europeo e il bilancio statale della Repubblica Ceca, nessun progetto. CZ.1.07/2.3.00/30.0041 (a T.G.). Ringraziamo l'ottica dell'oceano per la copertura dei costi di pubblicazione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Replicator Mini + Makerbot
Professional Acrylic Paint Cobalt Turquoise Light Winsor & Newton 28382
Professional Acrylic Paint Titanium White Winsor & Newton 28489
Professional Acrylic Paint Cobalt Green Winsor & Newton 28381
Professional Acrylic Paint Cobalt Turquoise Winsor & Newton 28449
Professional Acrylic Paint Burnt Umber Winsor & Newton 28433
Professional Acrylic Paint Red Iron Oxide Winsor & Newton 28486
Professional Acrylic Paint Cadmium Orange Winsor & Newton 28437
Professional Acrylic Paint Raw Umber Light Winsor & Newton 28391
Professional Acrylic Paint Yellow Ochre Winsor & Newton 28491
Professional Acrylic Paint Mars Black Winsor & Newton 28460
Paint Brush Utrecht 206-FB Filbert brush
Paint Brush Utrecht 206-F Flat brush
Hair Dryer Oster 202
Fiber optic cables Ocean Optics Inc. OCF-103813 1 m custom bifurcating fiber optic assembly with blue zip tube (PVDF), 3.8mm nominal OD jeacketing and 2 legs
Spectrometer Ocean Optics Inc. Jaz Spectrometer unit with a 50 um slit width, installed with a 200-850 nm detector (DET2B-200-850), and grating option # 2.
Battery and SD card module for spectrometer Ocean Optics Inc. Jaz-B
Light source Ocean Optics Inc. Jaz-PX A pulsed xenon light source
White standard Ocean Optics Inc. WS-1-SL made from Spectralon
OHAUS Adventurer Pro Scale OHAUS AV114C A precision microbalance
Gemini-20 portable scale AWS Gemini-20 A standard scale
Empty Aluminum Paint Tubes (22 ml) Creative Mark NA
Telescopic mirror SE 8014TM
GPS Garmin Oregon 600
220-grit sandpaper 3M 21220-SBP-15 very fine sandpaper
400-grit sandpaper 3M 20400-SBP-5 very fine sandpaper
color analysis software: ‘pavo’, an R package for use in, R: A language and environment for statistical computing v 1.3.1 https://cran.r-project.org/web/packages/pavo/index.html
UV clear transparent Flock off! UV-001 A transparent ultraviolet paint
Plastic sandwich bags Ziploc Regular plastic sandwich bags from Ziploc that can be purchased at the supermarket.
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 34120 11 x 21 cm kimwipes
Toothbrush Colgate Toothbrush

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Canniff, L., Dainson, M., López, A. V., Hauber, M. E., Grim, T., Samaš, P., Hanley, D. Probing the Limits of Egg Recognition Using Egg Rejection Experiments Along Phenotypic Gradients. J. Vis. Exp. (138), e57512, doi:10.3791/57512 (2018).

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