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Behavior

Sondar os limites do reconhecimento de ovo usando ovo experiências de rejeição ao longo de gradientes fenotípicas

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/57512
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 4, 5, 1
1Department of Biology, Long Island University-Post, 2Department of Animal Biology, School of Integrative Biology, University of Illinois, 3Departamento de Ecología, Genética y Evolución, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 4Department of Zoology and Laboratory of Ornithology, Palacký University, 5Institute of Vertebrate Biology, Academy of Sciences of the Czech Republic

Summary

Este protocolo fornece diretrizes para a execução de ovo experiências de rejeição: técnicas de estrutura de tópicos para pintura experimental ovo modelos para emular as cores dos ovos de pássaro natural, realizando trabalho de campo e análise dos dados coletados. Este protocolo fornece um método uniforme para a realização de experiências de rejeição de ovo comparáveis.

Abstract

Parasitas de ninhada depositam seus ovos em ninhos das outras fêmeas, deixando os pais de acolhimento para chocar e criar seus filhotes. Estudar parasitas como ninhadas manipulam anfitriões para criar seus filhotes e como anfitriões detectam parasitismo fornecem importantes visões no campo da biologia coevolutionary. Parasitas de ninhada, como cucos e cowbirds, ganham uma vantagem evolutiva, porque eles não têm que pagar os custos de criação de seus próprios filhotes. No entanto, estes custos selecionar para as defesas do hospedeiro contra todas as fases do desenvolvimento de parasitas, incluindo ovos, jovens e adultos. Experiências de rejeição de ovo são o método mais comum usado para estudar as defesas do hospedeiro. Durante estas experiências, um pesquisador coloca um ovo experimental em um ninho de anfitrião e monitora como hosts de respondem. Cor é muitas vezes manipulado, e a expectativa é que a probabilidade de discriminação de ovo e o grau de dissimilaridade entre o host e o ovo experimental estão positivamente relacionados. Este papel serve como um guia para a realização de experiências de rejeição de ovo de descrevendo métodos para criar cores de ovo consistente para analisar os resultados de tais experiências. Especial atenção é dada para um novo método envolvendo ovos exclusivamente coloridos ao longo de gradientes de cor que tem o potencial para explorar preconceitos de cor, em reconhecimento do hospedeiro. Sem padronização, não é possível comparar resultados entre os estudos de uma forma significativa; um protocolo padrão dentro deste campo permitirá resultados cada vez mais precisos e comparáveis para novas experiências.

Introduction

Parasitas de ninhada depositam seus ovos em ninhos de outras espécies que podem, então, criar os seus filhotes e pagar os custos associados com cuidado parental1,2,3. Este ato de decepção para despistar o acolhimento por parte do parasita e investigar para detectar o parasita por parte do host fornece fortes pressões selectivas em ambos os atores. Em alguns casos de parasitismo de ninhada aviária, reconhecimento do hospedeiro de ovos de parasitas díspares seleciona para parasitas que imitam ovos do hospedeiro, que produz uma corrida armamentista evolutiva entre hospedeiro e parasita de4. Estudar o parasitismo de ninhada é importante porque é um sistema modelo para investigar a dinâmica coevolutionary e tomada de decisões no selvagem5. Experiências de rejeição de ovos são um dos métodos mais comuns utilizados para estudar o parasitismo de ninhada aviária no campo e uma importante ferramenta que ecologistas usam para investigar interações interespecíficas6.

Durante o curso das experiências de rejeição do ovo, pesquisadores normalmente apresentar natural ou modelo ovos e avaliar a resposta do host para estes ovos experimentais durante um período normalizado. Tais experiências podem envolver troca de ovos de verdade (que variam na aparência) entre ninhos7, ou tingir ou pintar as superfícies de ovos de verdade (opcionalmente adicionando padrões) e retorná-los ao seu original ninhos8ou gerar modelo ovos que manipularam características tais como cor9, manchando10, tamanho11, e/ou forma12. A resposta do hospedeiro aos ovos de aparência diferentes pode fornecer insights valiosos sobre o conteúdo de informação que eles usam para alcançar um de decisão de rejeição de ovo13 e quão diferente que precisa ser para eliciar uma resposta14de ovo. Limiar de aceitação ideal teoria15 afirma que anfitriões devem equilibrar os riscos de aceitar por engano um ovo parasitário (erro de aceitação) ou por engano, removendo seu próprio ovo (erro de rejeição), examinando a diferença entre seus próprios ovos (ou um modelo interno desses ovos) e os ovos de parasitas. Como tal, um limiar de aceitação existe além do qual anfitriões decidem que um estímulo é muito diferente de tolerar. Quando o risco de parasitismo é baixo, o risco de erros de aceitação é inferior quando o risco de parasitismo é elevado; assim, as decisões são contexto específico e mudará adequadamente como riscos percebidos mudança14,16,17.

Teoria do limiar de aceitação ideal pressupõe que hosts de baseiam as decisões em cima de variação contínua em fenótipos host e parasita. Portanto, medir as respostas do hospedeiro para diferentes fenótipos de parasita é necessário estabelecer como tolerante a uma população de acolhimento (com sua própria variação fenotípica) é a uma gama de fenótipos parasitárias. No entanto, praticamente todos os estudos prévios têm invocado categórica ovo cor e maculation tratamentos (por exemplo, mimética/não-mimético). Apenas fenótipos de anfitrião da casca de ovo não variam, o que não é uma expectativa biologicamente prática, todas as respostas se directamente comparáveis (independentemente do grau de mimetismo). Caso contrário, um modelo de "mimética" ovo variará em como semelhante está a anfitrião ovos dentro e entre populações, que potencialmente podem levar a confusão ao comparar resultados18. Uma teoria sugere que hospedam as decisões baseiam-se se a diferença entre o ovo de parasita e suas próprias14, não necessariamente uma cor particular ovo parasitárias. Portanto, usar um tipo de modelo único ovo não é uma abordagem ideal para testar hipóteses sobre os limites de decisão de acolhimento ou habilidades de discriminação, salvo se a diferença apenas perceptível (doravante JND) entre o tipo de modelo de ovo e cor de ovo do anfitrião individual a variável de interesse. Isto também se aplica aos estudos experimentais que trocar ou adicionar ovos naturais para testar respostas de anfitrião a uma variedade natural de cores19. No entanto, enquanto estes estudos permitem variação no hospedeiro e parasita fenótipos, eles são limitados pela variação natural encontrada em traços6, particularmente ao usar ovos coespecíficas7.

Por outro lado, os investigadores que fazem ovos artificiais de cores variadas são livres dos constrangimentos da variação natural (por exemplo, eles podem investigar respostas para superstimuli20), permitindo-lhes sondar os limites da percepção de anfitrião6. Pesquisas recentes tem usado novas técnicas para medir respostas do hospedeiro através de uma escala fenotípica, por ovos experimental de pintura projetados para corresponder e superar a faixa natural de variação em casca de ovo9 e cores especiais21. Estudar as respostas do hospedeiro para ovos com cores ao longo de gradientes pode revelar os processos cognitivos subjacentes porque predições teóricas, tais como limites de aceitação15 ou mimetismo desenvolvido4, baseiam-se na contínuas diferenças entre traços. Por exemplo, usando esta abordagem, Dainson et al . 21 estabeleceu que, quando o contraste cromático entre a coloração da casca do chão e coloração local é maior, o Tordo-americano Turdus migratorius tende a rejeitar os ovos mais fortemente. Esse achado fornece informações valiosas sobre como este anfitrião processa informações, neste caso através da mancha, para decidir se deseja remover um ovo do parasitário. Personalizando as misturas da pintura, pesquisadores podem manipular precisamente a semelhança entre cor de um ovo experimental e cor de ovo do hospedeiro, enquanto outros fatores de confundimento como detectar padrões10, ovo e ovo tamanho22 a padronização forma23.

Para incentivar ainda mais a replicação e metareplication24 de trabalho de rejeição de ovo clássicos e recentes, é importante que os cientistas usam metodologias que são padronizadas pela filogenia (espécie de host diferente)7,22, espaço (populações de host diferente)7,22,25,26 e tempo (temporadas diferentes reprodutores)7,22,25,26 ,27, que foi feito apenas raramente. Metodologias que não eram padronizados28 mostraram-se mais tarde para levar a resultados artefactual29,30. Este papel serve como um conjunto de orientações para investigadores que pretendam replicar este tipo de experimento de rejeição de ovo que examina as respostas à variação contínua e destaca uma série de conceitos metodológicos importantes: a importância de ninhos de controle, um priori hipóteses, metareplication, pseudoreplication e cor e análise espectral. Apesar das experiências de rejeição de ovo dominando o campo de coevolução aviária hospedeiro-parasita, nenhum protocolo abrangente existe ainda. Portanto, estas orientações será um recurso valioso para aumentar intere intralaboratório repetibilidade, como o verdadeiro teste de qualquer hipótese encontra-se em metareplication, ou seja, repetindo todo estudos através de filogenia, espaço e tempo,24, que Só pode ser significativamente feito quando usando métodos consistentes29,30,31.

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Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Long Island-Post e institucional Cuidado Animal.

1. mistura acrílica pinta

  1. Misture a coloração da casca do chão, que é a cor que cobrirá uniformemente toda a superfície da casca de ovo. A seguinte receita fará 50 g de tinta, que vai encher um pouco mais de dois tubos de tinta de alumínio de 22 mL.
    1. Gerar uma cor azul esverdeado, representando uma casca de ovo azul-verde (por exemplo, uma casca de ovo de americano Robin T. migratorius ), usando 18,24 g de turquesa cobalto luz, 20,77 g de titanium branco 6,52 g de cobalto verde e 2,86 de turquesa de cobalto e 1,61 g de siena queimada.
    2. Gere uma cor marrom, representando uma casca de ovo marrom (por exemplo, uma casca de ovo do frango Gallus gallus domesticus ), usando 4,12 g de óxido de ferro vermelho, 9,75 g de alaranjado de cádmio, 22,15 g da luz umber cru e 13,97 g de branco de titânio.
    3. Gere uma cor bege, representando uma casca de ovo bege (por exemplo, uma casca de ovo do codorna Coturnix japonica ), usando 10,60 g de cor marrom ovo, 8,28 g de cor azul esverdeado, 18,51 g de branco de titânio e 12,61 g de amarelo ocre.
    4. Gere uma cor branca, usando branco de titânio sem misturar.
  2. Misture uma cor spot marrom escura representando as manchas encontradas em ovos de codorna c. japonica , usando 8,38 g de cor marrom ovo, 26,04 g de siena queimada e 15,59 g de negro de Marte.
  3. Misturar cores intermediárias, abrangendo a gama de cores da casca de azul e verde a marrom, misturando tintas azul, verde e marrons juntos e variando sua contribuição reciprocamente (por exemplo, partes de azul esverdeado para tinta marrom: 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 0, 3:7, 2:8, 1:9 e 4:6:10, ver Figura 1E).
    1. Para gerar mais cores intermediárias, simplesmente Misture quantidades mesmo dessas cores intermediárias e repita até criando o número desejado de cores exclusivas. O mesmo mistura de azul e verde e marrom irão produzir uma cor cinza neutra, mas esta cor pode ser ajustada usando branco ou bege, se necessário. Se uma cor mais exata (por exemplo, de um ovo de host específico) for necessária, use modelos de mistura de cores subtrativas para prever a reflectância espectral de combinações únicas de tintas e usar a mistura produzindo menor diferença apenas perceptível (JND) para o desejado de cor (ver passos 3.3 – 3.7).
  4. Loja de pintura em tubos de tinta de alumínio vazio 22 mL.
    1. Coloque a tinta em um saco plástico com uma pequena porção de um canto cortado. Coloque a extremidade do saco plástico dentro do tubo e apertar a tinta para o tubo, batendo o tubo suavemente contra a mesa.
    2. Selo do tubo usando a borda adesiva e final de dobramento sobre si mesma pelo menos 3-4 vezes.

2. pintura Experimental ovo modelos

  1. Obter modelos experimentais de ovo.
    1. Ovos de modelo usando um tridimensional (daqui por diante, 3D) de impressão impressora ou compra de um distribuidor de28. Esta abordagem simples é recomendada porque gera ovos que são de tamanho consistente e moldar a28.
      Nota: Ovos de modelo podem também ser formados a partir de gesso, argila, madeira ou outras substâncias.
  2. Adicione um casaco mesmo de branco de titânio sobre cada ovo para obstruir a cor subjacente.
  3. Segure cada ovo, usando pinças, pintar a cor desejada, usando tintas acrílicas de alta qualidade e um pincel limpo para colorir cada ovo com exclusividade.
  4. Use um secador de cabelo em um cool configuração para acelerar o processo de secagem de cada ovo recém pintado.
  5. Use uma lixa para lixar para baixo qualquer solavancos que podem ser o ovo, uma vez que o ovo está totalmente seco.
    1. Repita a etapa 2.3 até o ovo tem um mesmo revestimento de tinta sem grumos. Ovos exigem nada menos que duas demãos.
  6. Adicione todos os pontos de ovos modelo cuidadosamente aplicando com um pincel e salpicar com cuidado a tinta com uma escova de dentes. Apenas um único revestimento é necessário.
    Cuidado: Se reflectância de (UV) ultravioleta replicação for desejada, aplicar um mesmo casaco de tinta UV; no entanto, isso não é recomendado a menos que a permissão para usar essas tintas é obtida institucional, estadual/provincial e federal permitindo escritórios.

3. quantificação de cor

  1. Ligue o espectrômetro, pressionando o botão power.
  2. Cartão SD de inserir no cartão SD e link para o sistema, pressionando o vermelho cancelar botão, selecione "File System" pressionando o botão aceitar verde, selecione "Encontrar cartões de SD" pressionando o botão menu. Depois, pressione o botão de cancelar vermelho duas vezes, ou pressionando a tecla home.
  3. Prenda os cabos de fibra óptica para o espectrômetro e luz fonte.
    1. Fixe a extremidade rotulada "Fonte de luz" para o módulo luz e ligue a extremidade rotulada "Espectrômetro" para o módulo de espectrômetro.
  4. Inserir a ponta da sonda na extremidade da sonda fibra óptica.
    Nota: Uma exemplo ponta para impressão em uma impressora 3D está disponível como um arquivo de código suplementar. Este objeto exigirá a segmentação de um parafuso de aperto manual de sua escolha.
    1. Estabelece uma distância (por exemplo, 5 mm) entre a amostra e a sonda de medição que maximiza a relação sinal / ruído. Certifique-se de uma distância de medição consistente usando uma régua flexível.
      Nota: A distância exata pode variar com combinação única do cada indivíduo espectrómetro de grade e fenda de largura, largura óptica e fonte de luz. Manter a mesma distância para todas as medições. Uma regra flexível está disponível para download como um arquivo de código suplementar.
    2. Use um ângulo de medição normal coincidentes (90°), a menos que o hospedeiro natural ovos ou ovos de modelo tem uma superfície lustrosa, nesse caso use um ângulo de 45° medição oblíqua coincidentes. Medir todos os ovos, reais e artificiais, usando o mesmo ângulo.
    3. Lave a ponta da sonda com etanol a 95%.
  5. Ligue a fonte de luz, pressionando o botão para baixo três vezes, selecione PX-lâmpada pressionando o botão aceitar verde, selecione configuração pressionando o botão de rolagem direito, selecione "Controles de sincronismo" pressionando o botão de rolagem direito, clique a baixo três vezes e então seleccione correr livre pressionando o botão Accept.
    1. Aguardar pelo menos 15 min antes de se proceder às medições.
  6. Calibrar e configurar o espectrômetro. Para fazer isso, pressione o botão home e, em seguida, selecione "Ferramentas", pressionando a rolagem esquerda botão, selecione "Controle Manual" pressionando o botão menu e selecione "Adquirir parâmetros" pressionando o botão menu.
    1. Defina boxcar alisando a cinco pressionando o botão de rolagem direito, movendo o cursor para os direita dois espaços, pressionando o botão de rolagem direito duas vezes e então aumentando a configuração do vagão premindo menu botão para cima cinco vezes. Selecione "Aceitar" pressionando o botão verde de aceitar uma vez completo.
    2. Conjunto as médias de 10 pressionando menu botão e, em seguida, mover para a direita, dois lugares, pressionando o botão de rolagem direito duas vezes e ajustar o valor de dezenas lugar pressionando menu botão uma vez e movendo-se para os colocar, pressionando o botão certo de rolar o NCE e reduzindo como zero premindo menu tecla uma vez. Selecione "Aceitar" pressionando o botão verde de aceitar uma vez completo.
    3. Pressione a tecla home, selecione reflectância premindo menu botão para cima e coloque a sonda firmemente no padrão branco. Em seguida, armazene um padrão de referência branco pressionando o botão menu. Armazenar um escuro padrão pressionando o botão de rolagem direito e exibir a reflectância premindo menu botão.
  7. Medir a reflectância do cada casca de ovo seis vezes medindo duas vezes perto do polo rombudo (largura final do ovo), duas vezes no Equador do ovo e duas vezes perto do polo afiado (extremidade mais estreita). Certifique-se de informar se as manchas são evitadas ou não. Esta conduta em ovos experimentais, bem como os ovos do hospedeiro.
  8. Use uma função polinomial localmente ponderada com um 0,25 nm suavização span para suavizar o ruído em curvas de reflectância, uso de software de análise de cor29. Se não repetível significativamente entre as regiões do modelo ovo (etapa 3.7), golo de cor, como brilho, repintar o ovo (passos 2.2 – 2.6); caso contrário, média a coloração de modelo do ovo através do ovo.
  9. Decida sobre o conjunto mais apropriado de sensibilidades fotorreceptoras relativo para a questão.
    Nota: Isto pode ser um genérico ultravioleta sensível ou violeta sensível pássaro, ou uma vez pode optar por modelo sensibilidades relativo30,31,32.
  10. Quantificar a quântica capturas33 para cada fotoreceptor, tanto single34 e duplo cones35,36, integrando o produto de reflectância da casca de ovo, sensibilidades fotoreceptor e uma adequada espectro da irradiância em todo o espectro de visual aviária (ou seja, 300-700 nm).
    1. Quântica relativa uso pegar estimativas para gerar coordenadas dentro o espaço de cor tetraédrica aviária33,37. Certifique-se de que, ao contrário das capturas quântica, estes quântica relativa as capturas somas para 1.
  11. Capturas de utilização quântica (etapa 3.10) para estimar a discriminability, no JND, entre casca de ovo hospedeiro de cor (ver passo 2.6.1) e as cores percebidas de cada ovo externa usando um modelo de visual limitada ruído neural32 , 38 , 39.
    1. Medir a coloração da casca do host usando o espectrômetro mesmo e fonte de luz usada para medir os ovos de modelo (passo 3.7), se possível.
      Nota: Considerações práticas ou logísticas podem fazer isto impossível, caso em que medida um subconjunto dos ovos do hospedeiro de ninhos diferentes, para estabelecer uma coloração de casca de ovo médio anfitrião.
    2. Use uma fração de Weber para o cone longo-sensível-onda de 0.140.
    3. Representam a abundância relativa de cones e o principal membro do cone duplo30.
      Nota: Se as cores do ovo usadas somente em um gradiente correspondente às cores da casca naturais, o JND entre o host e o ovo experimental pode ser multiplicado por 1 ou -1 para diferenciar as diferenças em cada extremo (por exemplo, azul e verde ou marrom, ver 1.1.1–1.1.2 de passos). Se as cores do ovo usadas cair através de múltiplos gradientes ou preenchem o espaço de cor, resuma as diferenças de cor perceptível entre ovos usando diagramas de cromaticidade perceptualmente uniforme41. As coordenadas dentro deste tipo de diagrama descreve a direção e magnitude das diferenças de cor percebida entre ovos experimentais e cor de ovo do anfitrião e estes podem ser usados em novas análises.

4. trabalho de campo

  1. Determine a espécie de estudar.
    Nota: Fatores a considerar incluem (mas não estão limitados a) a abundância da espécie hospedeiro e/ou parasita e se o host é um alcance42 ou punção43 rejecter, que terá impacto sobre o tipo de ovo a ser usado (por exemplo, não use duro ovos de modelo artificial para punção ejetores44).
  2. Sistematicamente procure ninhos na área de estudo. Verifica registros de nidificação anteriores que podem fornecer um ponto de partida razoável, em algumas espécies de45.
    Nota: Marcadores visíveis ou embandeiramento pode aumentar o risco de predação,46; Portanto, considere usar um GPS portátil.
  3. Monitorar os ninhos diariamente, usando métodos de gravação direta ou vídeo para registrar a presença de cada ovo hospedeiro até o início do experimento (passo 4.4); por exemplo, um dia após a conclusão da embreagem.
    Nota: Este monitoramento diário irá continuar até que o experimento concluiu (etapa 4.6).
    1. Ouvir alarme chamadas feitas por adultos e deixar a área, se eles continuarem por mais de 30 s. Não se aproxime um ninho quando qualquer potencial predador ninho está presente, especialmente se é um predador visualmente orientado (por exemplo, ninho).
    2. Ninhos de abordagem e deixar de locais diferentes, ou seja, passarem de ninhos, para que mamíferos predadores não podem seguir sugestões químicas diretamente para ninhos.
      Nota: Esta abordagem pode ser inviável em alguns habitats, nomeadamente denso Caniçal.
    3. Sempre minimize a perturbação física para o ninho e a área ao redor do ninho.
    4. Não chegar perto de ninhos durante o período de construção de ninho, porque muitas aves vão abandonar os ninhos, se eles estão perturbados antes da postura46.
  4. Adicione suavemente um ovo experimental para o ninho de um host deslizando-a para o lado da Copa do ninho. Não deixe cair os modelos experimentais podem danificar os ovos do hospedeiro.
    Nota: Atribua tratamentos aleatoriamente.
    1. Recorde-se o pai de anfitrião permanece nas proximidades e, portanto, tem a oportunidade de presenciar o ato de parasitismo artificial47. Registro e estatisticamente o controle para uma variável, indicando se o host foi liberado o ninho47. Realizar apresentações de ovo enquanto o pai está fora.
    2. Colete um ovo de acolhimento se o parasita no sistema remove um ovo do hospedeiro.
      Nota: Isto pode não ser necessário em hospedeiros onde ovo remoção não afeta respostas do hospedeiro para ovos experimental22.
  5. Empregar um conjunto de ninhos de controle (ninhos que são visitados, verifiquei e ovos ovo manipulado, mas não experimental é adicionada ou trocada) para determinar as taxas de abandono do ninho natural. Remova um ovo hospedeiro do ninho controle apenas se eles são retirados dos ninhos experimentais (consulte a etapa 4.5.1).
    Nota: Isto é crucial porque deserção pode não ser uma resposta direcionada para certos estrangeiros ovos, mas pode ser uma resposta para outros tipos de ovo.
    1. Escolha o número de ninhos de controlo a priori baseada os tamanhos de amostra conhecida ou esperada e estima-se efeito. Atribua cada ninho nth como um ninho de controle até determinação estatística se ninho deserções são uma resposta do hospedeiro aos ovos experimentais ou não pode ser obtida (etapa 5.1).
      Nota: Se um ovo de anfitrião é removido, retirar o mesmo número de ovos do hospedeiro como o tratamento experimental, segure um host de ovo na mão para 5 s e depois substituir isso e permanecem no ninho para o mesmo período de tempo como ninhos de tratamento. Se o anfitrião ovos não são removidos, segurar um host de ovo na mão para 5 s e depois substituir isso, permanecem no ninho para a quantidade de tempo gasto em ninhos experimentais (por exemplo, 10 s).
  6. Revisitar o ninho suficiente para determinar a resposta no ninho de cada host, incluindo controles. Verifique o ninho dentro de algumas horas da manipulação experimental.
    Nota: Em algumas espécies, rejeições podem ocorrer no mesmo dia como parasitismo experimental; Portanto, é importante verificar o ninho dentro de algumas horas de manipulação experimental48.
    1. Use um espelho telescópico ao verificar o ninho para evitar o contato direto com o ninho ou a embreagem.
    2. Evite observações em mau tempo (chuva, calor ou frio), pois isso pode aumentar o perigo para os filhotes e os ovos de46.
    3. Execute verificações diárias até o host tem respondido ao ovo introduzido ou uma certa quantidade de tempo já passou.
      Nota: Por convenção, se o ovo permanece no ninho durante 5-6 dias, o host é considerado um aceitador22; no entanto, alguns indivíduos de acolhimento respondem até mais tarde,49 , e a omissão de tais respostas necessariamente polarizações estimativas de taxa de rejeição de ovo. Idealmente, pesquisadores devem determinar o superior 95% family-wise intervalo de confiança de latência para rejeição no sistema deles e usar isto como seu critério.

5. estatísticas análises

  1. Use o teste exato de Fisher, um em um estudo randomizado perfeitamente (ou seja, experimental e controle ninhos são perfeitamente intercalados e assim não diferem em que fixa a data, embreagem ou qualquer outro parâmetro conhecido por afetar a deserção de ninho) para comparar o número de deserções entre controle (etapa 4.5) e ninhos de tratamentos. Caso contrário, use um modelo linear generalizado (GLM) com covariáveis potencialmente relevantes (veja abaixo), como uma abordagem geralmente mais cautelosa.
    1. Se ninhos experimentais tem uma taxa de deserção significativamente mais elevada do que os ninhos de controle, código ambos removidos de ovos e ovos abandonados como 'rejeitaram'.
      Nota: Por convenção o host tem 'rejeitada' o ovo quando ele foi reconhecido o ovo do parasitário e também removeu ou abandonado (com o ninho todo).
    2. Se taxas de deserção não diferem entre experimental e controlar ninhos, excluir deserções de análise, porque eles não são uma resposta do hospedeiro ao parasitismo e código respostas como 'expulso'.
      Nota: Por convenção, 'expulso' refere-se quando um ovo na verdade foi removido de seu ninho.
    3. Grave a data e hora quando o host rejeitou o ovo. Recodificar a variável de resposta, dependendo de sua descoberta em etapas 5.1.1–5.1.2.
  2. Relatar o teste exato de Fisher, sua razão de chances associado e seu intervalo de confiança apropriado.
  3. Decida sobre qualquer covariáveis significativas que serão adicionados aos modelos preditivos (por exemplo, passos 5.4 – 5.5).
    1. Especifica a codificação (por exemplo, contínuo, categórica ou ordinal) de cada covariável.
    2. Código data como ordinais dias e datas de centro separadamente dentro de anos para remover qualquer potencial confundem devido à variação atribuível a anos ou sazonalidade7,,47,50,51.
    3. Centro de qualquer covariáveis envolvidas em uma interação para permitir a fácil interpretação dos seus termos de ordem mais baixas na saída do modelo.
      Nota: Escala covariáveis permite a comparação direta dos efeitos entre os estudos e às vezes pode melhorar a convergência do modelo.
  4. Prever as respostas do hospedeiro (ejetar ou rejeitar vs aceitam) usando um modelo linear generalizado (GLM) ou um modelo linear generalizado misto (GLMM) com uma distribuição binomial erro e função de ligação logit.
    Nota: A escolha entre um GLM ou GLMM varia de acordo com os dados e se incluindo um efeito aleatório (por exemplo, ID do ninho, ano). Fatores aleatórios devem ter pelo menos 5 níveis caso contrário variâncias são prováveis ser mal estimado52.
    1. Apresente-se o coeficiente de determinação (geralmente R2) para mostrar que a proporção da variância foi explicada por um modelo linear53,54.
  5. Prever quanto tempo demora o pássaro para responder ao parasitismo experimental usando um GLM com uma distribuição binomial negativo do erro (ou uma distribuição de Poisson erro se os dados não são overdispersed) e efetuar a ligação.
    Nota: Os pesquisadores referem-se ao comprimento de tempo que leva para um pássaro responder como 'latência de resposta,' que é relatada com precisão de dias, tal que ovos rejeitados no dia do experimento tem uma latência de zero. Modelo de variáveis de resposta com muitos zeros (> 50%) usando zero-inflado ou obstáculo modelos55.
  6. Use ferramentas de diagnóstico para verificar se o modelo prevê os dados de forma satisfatória e relatório estatística Resumo do modelo para quantificar o que proporção do modelo de variância explicado56 , 57. relatar o coeficiente de determinação (geralmente R2), consulte a etapa 5.4.2.
    1. Valide modelos binomial negativos, usando validação gráfica produzindo uma trama de Quantil-Quantil e plotagem de resíduos Pearson contra os valores cabidos.
      Nota: Um modelo bem gerido não terá valores atípicos ou padrões inesperados55.
    2. Valide modelos binomial usando testes de bondade de ajuste, tais como testes de Hosmer-Lemeshow e outros diagnósticos disponíveis no pacote de R, 'binomTools'58 , contendo o conjunto de ferramentas de diagnóstico.
  7. Considere a possibilidade de controlar para covariáveis consistentes para fins de consistência e comparabilidade entre os estudos.
    Nota: Covariáveis comuns inclui embreagem tamanho22, que fixa a data59, ninho de idade na manipulação49, e se o host foi liberado do ninho ou não47. Estudos de muitos, especialmente no início, não usou qualquer covariáveis. Os autores devem considerar adicionalmente analisando os efeitos de tipos de ovo (ou vários gradientes) sem covariáveis para tornar seus resultados quantitativamente comparáveis para estes estudos falta covariáveis.
    1. Usar uma abordagem teórico-informações e informar o resultado de uma média de muitos modelos potenciais explicando o anfitrião comportamento60.
      Nota: Como alternativa, use a análise de regressão passo a passo como uma seleção de modelo algoritmo61. Pesquisadores devem usar um critério predefinido (por exemplo, ajustado R2, dos Mallows Cp, do Akaike critério de informação, do Schwarz BIC ou p-valor) e fornecer o modelo completo (com covariáveis comuns) e um modelo de redução final.

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Representative Results

Geração de modelos de ovo colorido

Espectros de reflectância de misturas de pintura personalizada e ovos naturais são mostrados na figura 1A-D. Misturas de tinta utilizadas em estudos de parasitismo de ninhada devem corresponder estreitamente com medições de reflectância natural em termos de forma espectral (cor) e magnitude (brilho). Se isso for alcançado, a cor do ovo experimental deve ser encarada pelo host como uma cor de ovo natural. Para avaliar o reconhecimento do hospedeiro, estes refletâncias devem ser transformadas em um espaço de cor aviária relevantes. Para fazer isso, o produto de tais espectros de reflectância, irradiação solar e sensibilidade fotorreceptoras podem ser integrados para calcular quântica pega33. Percepção de cor aviária é diferente do que nos seres humanos, porque aves ver cores usando quatro, ao invés de três fotorreceptores. A captura de quântica destes quatro receptores pode ser transformada em coordenadas dentro de um espaço de cor tetraédrica (Figura 1E), onde cada vértice representa a estimulação relativa de um fotoreceptor específico: ultravioleta, curto, médio e longo fotorreceptores sensíveis ao comprimento de onda37. Coordenadas dentro deste espaço fornecem um método para comparar as cores e diversidade fenotípica de cores, que é relativamente limitado em relação a cor das cascas de ovos de aves62. Plotagem cor de ovo experimental em um espaço de cores é importante porque suas coordenadas dentro desse espaço irão determinar se estes ovos parece naturais. A Figura 1 ilustra as cores de tintas personalizadas (pontos coloridos, letras correspondem com os espectros de reflectância, mostrados na figura 1A-D) que são descritos neste trabalho e como eles se comparam às cores da casca natural das aves. Esta nova abordagem fornece oportunidades para novos projetos experimentais e pode fornecer novos insights sobre reconhecimento de ovo do hospedeiro.

Quantificar as respostas do hospedeiro às cores da casca de ovo

Explicitamente ou implicitamente, a todos, mas um estudo anterior de9 assumiu que anfitriões respondem a dissimilaridade de traço, por exemplo, a diferença entre um ovo de parasita e suas próprias, de forma absoluta ou simétrica (Figura 2, tracejada). Essa diferença geralmente varia entre idênticos (0) infinitamente diferente; no entanto, a maioria dos traços variam ao longo de várias dimensões e não há nenhum priori razão para supor que suas respostas deve ser semelhante em todo o espaço fenotípico. Pesquisa que manipula traços dentro do seu perímetro completo fenotípico (Figura 2, sólido), pode testar esta hipótese. Para dois Turdus spp., Hanley et al 9 descobriu que, entre um ovo marrom e azul esverdeado, ambos igualmente diferente do próprio, do hospedeiro, o ovo marrom era mais provável de ser rejeitada. Usando modelos de ovo com coordenadas dentro de um espaço de cor padrão aviária (Figura 1E), os pesquisadores podem trabalhar dentro da escala natural fenotípica ou estender esse intervalo fenotípico (por exemplo, no sentido de azul e verde ou marrom) para explorar a resposta do hospedeiro e sondar os limites perceptuais do reconhecimento do hospedeiro. Essa abordagem fornece um contexto (baseado no espaço fenotípico) para compreender as respostas dos anfitriões.

Quantificar as respostas do hospedeiro para cores especiais da casca de ovo

Um recente estudo21 mostrou que robins americanos são mais propensos a rejeitar ovos experimentais manchados quando eles percebem essas manchas marrom mais do que a cor azul e verde da casca da ovo (Figura 3). Esse host põe ovos imaculados, mas sua parasita o brown-headed cowbird Molothrus ater tem manchas marrons e portanto, esta regra de decisão parece adaptável. Tais achados reforçam as conclusões anteriores que mostraram que robins americanos baseiam as decisões em ambos os chão cor e manchas13; no entanto, medindo suas respostas através de uma cor gradiente Dainson et al foram capazes de estabelecer que robins americanos usem o contraste cromático entre o chão e a cor spot em ovo rejeição decisões21. Projetos experimentais empregando tal variação contínua em coloração permitem aos investigadores explorar o papel do anfitrião sensorial e perceptuais mecanismos em ovo reconhecimento mais minuciosamente.

Figure 1
Figura 1: variação representativa em cores naturais aviária e artificiais da casca de ovo. A média das medições de reflectância espectral dez do (A), o azul esverdeado, bege (B), (C) marrons, branco (D) e (E) misturas de tinta marrom escuro (1.2.1 a 1.2.5, linhas sólidas) ao lado de reflexão de um ovo de verdade com uma aparência similar: Tordo-americano (A) T. migratorius, codorna (B) c. japonica, um marrom (C) e (D) branco ovo de galinha interno Gallus g. domesticus (linhas tracejadas). O pico de reflectância ultravioleta em (D) é devido à remoção da cutícula67. Fotos de ovos de verdade, nos ovos artificiais e esquerdos para a esquerda para escala de encastrar (a barra acima "artificial" representa 1 cm). A imagem do ovo de codorna real (encarte B) foi modificada de uma fotografia tirada por Roger Culos que é licenciado sob CC-BY-4.0. Podemos ilustrar aves adultas como imagens de baixo-relevo (créditos da foto do pássaro inserções A D respectivamente: Tomáš Grim, Ingrid Taylar sob CC-BY-2.0, Sheroole Dejungen sob CC-BY-SA-3.0). As cores percebidas aviária são plotadas também dentro do espaço de cor tetraédrica aviária (E) para o telespectador médio de aviária ultravioleta-sensível. Os vértices representam a estimulação relativa a ultravioleta (U), curta (S), média (M) e fotorreceptores de sensíveis ao comprimento de onda longas (L). Pontos cinzento representam as cores dos ovos aviária naturais em toda a diversidade filogenética completa66, de dados previamente publicados68, enquanto os pontos coloridos representam as cores de formulações de pintura personalizada aqui (etapas 1.1.1 para 1.2), e pequenos pontos sólidos representam cores intermediárias (etapa 1.3). Letras em itálico, ao lado de pontos coloridos referência refletâncias espectrais mostradas nesta figura, enquanto que (e) referencia as manchas escuras de um ovo de codorna. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: rejeições de ovo hospedeiro representativa de ovos com coloração variável de casca de ovo. Tradicionalmente, a probabilidade de rejeição (tracejada) previsto para um host baseia-se se o absoluto percebida a diferença entre dos hosts ovo e ovo estrangeiro (i.e., como o ovo de estrangeiro é mais diferente respostas para esse ovo são mais prováveis, não importa o direção da diferença no espaço de cor). Esta prática ignora a variação natural na cor ovo do hospedeiro. No entanto, é mais provável que robins americanos (N = 52) rejeitará ovos marrons que igualmente dissimilares ovos azuis-verdes (linha contínua), que destaca a importância de examinar as respostas do hospedeiro através de um gradiente fenotípica9. Esta figura foi modificada de Hanley et al 9 e estes dados65 são licenciados sob CC-BY-4.0. Ovos de baixo-relevo são representante da gama de cores, mas suas posições são aproximadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.  

Figure 3
Figura 3: rejeição de ovo hospedeiro representativa de ovos com coloração variável de local. O contraste cromático (JND) entre as cores spot, pintadas em ovos de modelo experimental e a cor do chão destes modelos previu a resposta do hospedeiro (0 = aceitação, 1 = ejeção) no Tordo-americano. Esta figura foi modificada de Dainson et al . 21. inset ovos representam a variação em coloração local usada, mas suas posições são aproximadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Embora as experiências de rejeição de ovo são o método mais comum para estudar ninhada parasita-hospedeiro coevolução66, esforços concertados para padronizar materiais, técnicas, ou protocolos são escassos. Isto é especialmente problemático para meta-análises. Nenhuma meta-análise, ao nosso conhecimento, rejeição de ovo hospedeiro até agora tem controlado por discrepâncias metodológicas entre os estudos67,68, incluindo o que é considerado não-mimética ou mimética. Isto representa um grande problema porque ovos miméticas (pelos padrões humanos) podem ser rejeitados por hosts mais frequentemente do que aparentemente não-mimética queridos69, que mostra que a classificação de cor humana é inadequado e impróprio para inferências sobre aviária cognição18. Além disso, meta-análises ignoram o fato de que alguns estudos, até mesmo da mesma espécie hospedeiro, Tratado deserções de forma diferente, contando-lhes como respostas22 ou excluindo-os de análises7,67, 68. Além disso, misclassifying modelos de ovo como ovos ou não-mimética ou miméticas, pode levar a falaciosas comparações entre estudos que ambos usados essas classificações para modelo de ovo de diferentes tipos de70. Diferenças entre estudos1,70 podem refletir ambas as diferenças no design do estudo (por exemplo, tipos de ovo modelo) ou diferenças entre as populações, ambos a um grau desconhecido; Isto impede interpretação clara das diferenças e se opõe a rejeitar as hipóteses nulos e alternativas. Este protocolo fornece uma abordagem padronizada para ovo experiências de rejeição e particularmente enfatiza a coloração e quantificar a cor dos modelos de ovo. Seguir ou adaptação (e apropriadamente relatórios) Este protocolo deve promover a padronização metodológica necessária para futuros progressos neste campo de pesquisa, comparações inter estudas e produtivo debate científico.

Desde que a coloração da casca é determinada por apenas dois pigmentos, protoporfirina IX aparecendo marrom e biliverdin IXα aparecendo azul esverdeado62,,71,72, cores da casca ocupam apenas uma pequena parte da visão aviária 62. esta variação pode ser replicada através de cuidadosamente formular tintas acrílicas que correspondem as cores naturais da casca de ovo, e isso levará a uma melhor compreensão dos mecanismos de reconhecimento do hospedeiro. Por exemplo, Turdus anfitriões são mais propensos a rejeitar ovos marrons que ovos azuis, apesar do absoluto percebida diferença de cor entre estes ovos estrangeiros e seus próprios (Figura 2). Respostas para ovos coloridos ao longo de gradientes de cor variam consideravelmente, destacando a importância da precisão, produzindo e reproduzindo as cores usadas em experimentos de rejeição do ovo. Até mesmo variação na coloração local pode resultar em diferenças marcantes no anfitrião resposta (Figura 3)21. Usando essa abordagem, pesquisadores mais sistematicamente podem sondar os limites do reconhecimento do hospedeiro e descobrir a importância relativa da cromática e percursos de luminância em informando hospedam as decisões.

Apesar dos benefícios que esta abordagem fornece para quantificar respostas do hospedeiro através de uma escala fenotípica, não é adequado para testar cada hipótese. Quando as taxas de rejeição são necessárias para testar hipóteses, particularmente para as comparações entre a população, usar um ou mais tipos de modelo de ovo consistente seria uma abordagem menos onerosa e mais exigente. Por exemplo, apresentando representante de tipos específicos de ovo modelo de polimorfismos de ovo parasitárias específicas, pode fornecer a introspecção de pressões de seleção histórica e contemporânea73. Cálculo de taxas de rejeição é impossível quando cada ovo é uma cor única; no entanto, quantificar respostas do hospedeiro através de uma gama de cores de ovo parasitárias potenciais pode fornecer insights sobre questões relacionadas a limites de decisão e habilidades de discriminação. Especificamente, essa abordagem fornece uma ferramenta para investigadores medir habilidades de discriminação de um host ovo. Este protocolo descreve pintura receitas para ajudar a uniformizar a cor do ovo modelos usados para qualquer abordagem. Além disso, independentemente da abordagem escolhida, pesquisadores devem relatar as tintas usaram para colorir seus modelos de ovo e deve quantificar essas cores cuidadosamente. Isto deve melhorar as comparações inter estudas e meta-análise.

Estudos de rejeição de ovo com cor contínua, padrão, tamanho, e/ou traços de forma revolucionaram o campo dos estudos de corrida armamentista aviária hospedeiro-parasita em combinação com o uso agora padrão de percepção visual aviária modelagem69, 74. agora, não há evidência que alguns hosts não apenas uso a diferença perceptual absoluta entre ovos próprias e estrangeiras, em reconhecimento do ovo, mas em vez disso baseiam as decisões de rejeição com a direção destas diferença ao longo do gradiente fenotípica de aviária cor de casca de ovo9. Futuras pesquisas devem usar estudos de treinamento de habituação/dishabituation ou operante para avaliar se os hospedeiros de parasitas de ninhada aviária podem perceber e discriminar entre as cores naturais e artificiais de ovo em contextos de reconhecimento não-ovo. Além disso, estas mesmas experiências poderiam revelar se corrente, histórico e anfitriões não podem distinguir natural da casca de ovo artificial, que gostaria de destacar o papel dos mecanismos sensoriais em coevolutionary-corridas armamentistas. Finalmente, adequadamente incorporando e replicando os componentes UV de aviária do ovo de coloração e maculation em estudos de rejeição de ovo é um desafio necessário para superar por futuras pesquisas75; Isso será necessário avaliar se o ovo baseados em UV cor sinais representam um taco perceptualmente saliente ou exclusivo para reconhecimento de ovo e rejeição em hospedeiros de parasitas de ninhada aviária. Usando este protocolo consistente, os investigadores podem criar novas experiências e mais facilmente interpretam e comparam suas conclusões6,29,30,31.

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Disclosures

Ocean Optics financiou as acusações de página para este manuscrito.

Acknowledgments

MEH foi financiado pelo HJ Van Cleave Cátedra da Universidade de Illinois, Urbana-Champaign. Além disso, para o financiamento Agradecemos o humano Frontier Science Program (para M.E.H. e T.G.) e do Fundo Social Europeu e o orçamento de estado da República Checa, não do projeto. CZ.1.07/2.3.00/30.0041 (de T.G.). Agradecemos a Ocean Optics para cobrir os custos de publicação.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Replicator Mini + Makerbot
Professional Acrylic Paint Cobalt Turquoise Light Winsor & Newton 28382
Professional Acrylic Paint Titanium White Winsor & Newton 28489
Professional Acrylic Paint Cobalt Green Winsor & Newton 28381
Professional Acrylic Paint Cobalt Turquoise Winsor & Newton 28449
Professional Acrylic Paint Burnt Umber Winsor & Newton 28433
Professional Acrylic Paint Red Iron Oxide Winsor & Newton 28486
Professional Acrylic Paint Cadmium Orange Winsor & Newton 28437
Professional Acrylic Paint Raw Umber Light Winsor & Newton 28391
Professional Acrylic Paint Yellow Ochre Winsor & Newton 28491
Professional Acrylic Paint Mars Black Winsor & Newton 28460
Paint Brush Utrecht 206-FB Filbert brush
Paint Brush Utrecht 206-F Flat brush
Hair Dryer Oster 202
Fiber optic cables Ocean Optics Inc. OCF-103813 1 m custom bifurcating fiber optic assembly with blue zip tube (PVDF), 3.8mm nominal OD jeacketing and 2 legs
Spectrometer Ocean Optics Inc. Jaz Spectrometer unit with a 50 um slit width, installed with a 200-850 nm detector (DET2B-200-850), and grating option # 2.
Battery and SD card module for spectrometer Ocean Optics Inc. Jaz-B
Light source Ocean Optics Inc. Jaz-PX A pulsed xenon light source
White standard Ocean Optics Inc. WS-1-SL made from Spectralon
OHAUS Adventurer Pro Scale OHAUS AV114C A precision microbalance
Gemini-20 portable scale AWS Gemini-20 A standard scale
Empty Aluminum Paint Tubes (22 ml) Creative Mark NA
Telescopic mirror SE 8014TM
GPS Garmin Oregon 600
220-grit sandpaper 3M 21220-SBP-15 very fine sandpaper
400-grit sandpaper 3M 20400-SBP-5 very fine sandpaper
color analysis software: ‘pavo’, an R package for use in, R: A language and environment for statistical computing v 1.3.1 https://cran.r-project.org/web/packages/pavo/index.html
UV clear transparent Flock off! UV-001 A transparent ultraviolet paint
Plastic sandwich bags Ziploc Regular plastic sandwich bags from Ziploc that can be purchased at the supermarket.
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 34120 11 x 21 cm kimwipes
Toothbrush Colgate Toothbrush

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Comportamento edição 138 percepção aviária parasitismo de ninhada visão de cores cognição cor da casca experimento de rejeição
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Canniff, L., Dainson, M.,… More

Canniff, L., Dainson, M., López, A. V., Hauber, M. E., Grim, T., Samaš, P., Hanley, D. Probing the Limits of Egg Recognition Using Egg Rejection Experiments Along Phenotypic Gradients. J. Vis. Exp. (138), e57512, doi:10.3791/57512 (2018).

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