Summary

Dreidimensionale organotypischen Kulturen der vestibulären und akustische Sinnesorgane

Published: June 01, 2018
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Summary

Dreidimensionale organotypischen Kulturen der murinen Utricle und Cochlea in optisch klar Kollagen ich bewahren angeborene Gewebe Morphologie Gele ermöglichen für mechanische Stimulation durch Anpassung der Matrix Steifigkeit und Virus-vermittelten gen Lieferung zu ermöglichen.

Abstract

Die Sinnesorgane des Innenohrs sind eine Herausforderung, um bei Säugetieren wegen ihrer Unzugänglichkeit experimentelle Manipulation und optischen Beobachtung zu studieren. Darüber hinaus obwohl bestehende Kulturtechniken biochemische Störungen können, bieten diese Methoden keine Mittel zur Untersuchung der Auswirkungen der mechanischen Kraft und Gewebe Steifigkeit während der Entwicklung der Sinnesorgane Innenohr. Hier beschreiben wir eine Methode zur dreidimensionalen organotypischen Kultur der intakten murinen Utricle und Cochlea, die diese Grenzen überwindet. Die Technik für die Anpassung der eine dreidimensionale Matrix Steifigkeit, die hier beschriebenen ermöglicht Manipulation die elastische Kraft gegen Gewebewachstum. Diese Methode kann daher zur Untersuchung der Rolle von mechanischen Kräfte während der Innenohr-Entwicklung. Darüber hinaus erlauben die Kulturen Virus-vermittelten gen Lieferung, die für Gewinn und Verlust-of-Function-Experimente genutzt werden kann. Diese Kultur-Methode bewahrt angeborene Haarzellen und Unterstützung von Zellen und dient als eine potentiell überlegene Alternative zu traditionellen zweidimensionalen Kultur der vestibulären und akustische Sinnesorgane.

Introduction

Die Studie der meisten Aspekte der Säugetier-Organentwicklung wurde durch in-vitro- Systeme erleichtert. Zwei Hauptmethoden werden jetzt verwendet, für die Kultur der vestibulären Sinnesorgane: freischwebende1 und anhaftende2 Vorbereitungen. Beide Methoden erlauben die Untersuchung der Haarzelle Schwachstellen3 und Regeneration1,4 in Vitro. Darüber hinaus haben die entwicklungspolitischen Rollen der Kerbe5,6, Wnt7,8und epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR)9,10 Signalisierung Kaskaden im Innenohr etabliert, unter anderem durch den Einsatz von in-vitro- Kulturen von sensorischen Epithelien. Jedoch sind Zellwachstum und Differenzierung, nicht nur durch die Signalisierung von Morphogens, sondern auch durch physikalische und mechanische Signale z. B. interzellulären Kontakte, der Steifigkeit der extrazellulären Matrix und mechanische Dehnung oder Verengung gesteuert. Die Rolle solcher mechanischer Reize ist eine Herausforderung, in den Entwicklungsländern Innenohr in Vivozu untersuchen. Bestehenden freischwebend und anhaftende Kulturmethoden eignen sich darüber hinaus nicht für solche Studien in Vitro. Hier beschreiben wir eine Methode für die dreidimensionale organotypischen Kultur in Kollagen ich Gele unterschiedlicher Steifigkeit. Diese Methode weitgehend bewahrt die in Vivo -Architektur der vestibulären und Cochlea-Sinnesorgane und ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der mechanischen Kraft auf Wachstum und Differenzierung11.

Da mechanische Reize bekannt sind, um nachgeschaltete molekularen Ereignisse, z. B. das Nilpferd Weg12,13,14,15, Signalisierung zu aktivieren ist es wichtig, mechanische Stimulation kombinieren zu können mit biochemischen und genetischen Manipulationen. Die hier beschriebene Methode Kultur gestattet Virus-vermittelten gen Lieferung und kann daher verwendet werden, um mechanische und molekularen Signalisierung im Innenohr Entwicklung11zu studieren.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Animal Care und Nutzung Ausschüsse der Rockefeller University und der University of Southern California zugelassen. 1. (optional) Vorbereitung des Kollagens ich Lösung von Mouse-tail sehnen Hinweis: Kollagen ich Lösungen sind im Handel erhältlich. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für Gel-Vorbereitung. Einschläfern Sie 5-10 junger Erwachsener (3-5 Wochen alt) Mäusen Wildtyp-Sta…

Representative Results

Vestibuläre und akustische Sinnesorgane aus embryonalen Ohren kultiviert in 40-Pa Kollagen Gele imitiert geringe Steifigkeit embryonalen Bedingungen11, relativ normale dreidimensionale Strukturen (Abbildung 1) behalten und pflegen Haarzellen und Stützzellen (Abbildung 2 und Abbildung 3). Obwohl Zelldichte zu unterstützen um über 30 % verringert (Studenten t -Test:…

Discussion

Die molekularen Signale, die vermitteln Wachstum und Differenzierung im Innenohr während der Entwicklung wurden studiert ausgiebig5,6,7,8,9,10. Aus der utricular Modellsystem erlangte Beweismittel deuten jedoch darauf hin, dass mechanische Hinweise, spürte durch Zelle Kreuzungen und die Aktivierung von Hippo-Signalisierung,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi und A. Petelski für ihre Beiträge an die ursprüngliche Forschung, auf der dieses Protokoll basiert. Wir danken auch Lamas J. und W. Makmura für technische Hilfe und Tierhaltung. Wir erkennen NIDCD Ausbildung Grant T32 DC009975 NIDCD gewähren R01DC015530, therapeutische Entwicklungsfonds Robertson und Caruso Family Foundation für die Finanzierung. Schließlich erkennen wir Unterstützung vom Howard Hughes Medical Institute, von denen Dr. Hudspeth ein Ermittler ist.

Materials

#10 Surgical Blades Miltex 4-110
#5 Forceps Dumont 11252-20
100 mm Petri dish Sigma P5856-500EA
250 uL large orifice pipette tips USA Scientific 1011-8406
30 mm glass-bottom Petri dish Matsunami Glass USA Corporation D35-14-1.5-U
4 well plate Thermo Fisher Scientific 176740
4-Hydroxytamoxifen  Sigma H7904
60 mm Petri dish Thermo Fisher Scientific 123TS1
Acetic acid  Sigma 537020
Ad-GFP Vector Biolabs 1060
Anti-GFP, chicken IgY fraction Invitrogen A10262 
Anti-Myo7A Proteus Biosciences 25-6790
Anti-Sox2 Antibody (Y-17) Santa Cruz sc-17320
Bicinchoninic acid assay Thermo Fisher Scientific 23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10340
Collagenase I Gibco 17100017
D-glucose Sigma G8270
DMEM/F12  Gibco 11320033
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 16140063
Fibroblast growth factor Sigma F5392
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97
Glutamine Sigma G8540
HBSS Gibco 14025092
Hemocytometer  Daigger EF16034F
HEPES Sigma H4034
Insulin Sigma I3536
Iridectomy scissors  Zepf Medical Instruments 08-1201-10  
Microinjector Narishige IM-6
Nicotinamide Sigma N0636
PBS (10X), pH 7.4 Gibco 70011044
PBS (1X), pH 7.4 Gibco 10010023
Phenol Red pH indicator  Sigma P4633 
Pure Ethanol, 200 Proof Decon Labs  2716
RFP antibody ChromoTek  5F8
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium hydroxide Sigma S8045
Sodium selenite Sigma S5261
Tabletop vortex  VWR 97043-562
Transferrin Sigma T8158
Trypan blue  Sigma T6146

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Gnedeva, K., Hudspeth, A. J., Segil, N. Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs. J. Vis. Exp. (136), e57527, doi:10.3791/57527 (2018).

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