Summary

Culturas Organotypic tridimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares

Published: June 01, 2018
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Summary

Culturas organotypic tridimensional do utrículo murino e cóclea em opticamente clara colágeno eu geles preservar tecido inata morfologia, permitam a estimulação mecânica através do ajuste da rigidez da matriz e permitam a entrega de genes mediada por vírus.

Abstract

Os órgãos sensoriais do ouvido interno estão desafiando a estudar em mamíferos devido a sua inacessibilidade à óptica observação e manipulação experimental. Além disso, apesar de técnicas de cultura existentes permitem que as perturbações bioquímicas, esses métodos não fornecem um meio para estudar os efeitos da força mecânica e a rigidez do tecido durante o desenvolvimento dos órgãos sensoriais ouvido interno. Aqui nós descrevemos um método para a cultura de organotypic tridimensionais da cóclea que supera essas limitações e utrículo murino intacto. A técnica para o ajuste de uma rigidez de matriz tridimensional descrita aqui permite a manipulação da força elástica contra o crescimento do tecido. Portanto, esse método pode ser usado para estudar o papel das forças mecânicas durante o desenvolvimento do ouvido interno. Além disso, as culturas permitem a entrega de genes mediada por vírus, que pode ser usada para experiências de ganho e perda-de-função. Este método de cultura preserva inata de células ciliadas e apoiar as células e serve como uma alternativa potencialmente superior à tradicional cultura bidimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares.

Introduction

O estudo de quase todos os aspectos de desenvolvimento de mamíferos órgão tem sido facilitado pelos sistemas em vitro . Dois métodos principais são usados agora para a cultura de órgãos sensoriais vestibulares: flutuante1 e aderente2 preparações. Ambos os métodos permitem a investigação de cabelo célula vulnerabilidades3 e regeneração1,4 em vitro. Além disso, as funções do desenvolvimento do entalhe5,6, Wnt7,8, fator de crescimento epidérmico do receptor (EGFR)9,10 , sinalizando cascatas no ouvido interno e têm foi estabelecido, em parte, através do uso de culturas em vitro de epitélios sensoriais. No entanto, diferenciação e crescimento celular são controlados, não só através de sinalização por morphogens, mas também através de sinais físicos e mecânicos como contatos intercelulares, a rigidez da matriz extracelular e mecânicos de alongamento ou constrição. O papel de tais estímulos mecânicos é um desafio para investigar no ouvido interno em desenvolvimento em vivo. Além disso, métodos de cultura livre-flutuante e aderente existentes não são adequados para tais estudos in vitro. Aqui nós descrevemos um método de cultura de organotypic tridimensionais de colágeno géis de rigidez diferentes. Esse método amplamente preserva a arquitetura na vivo dos órgãos sensoriais vestibulares e cocleares e permite a investigação dos efeitos da força mecânica em crescimento e diferenciação11.

Porque os estímulos mecânicos são conhecidos para ativar eventos moleculares a jusante, tais como o hipopótamo sinalização via12,13,14,15, é importante ser capaz de combinar a estimulação mecânica com manipulações genéticas e bioquímicas. O método de cultura descrito aqui permite a entrega de genes mediada por vírus e, portanto, pode ser usado para estudar a sinalização da mecânica e molecular durante a orelha interna desenvolvimento11.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado Animal e uso comissões da Rockefeller University e da University of Southern California. 1. (opcional) preparação de colágeno solução de tendões Mouse-tail Nota: Colágeno soluções estão disponíveis comercialmente. Siga as instruções do fabricante para preparação do gel. Eutanásia em 5-10 ratos de jovem adulto (3-5 semanas de idade) de qualquer estirpe de tipo se…

Representative Results

Órgãos sensoriais vestibulares e auditivos de orelhas embrionárias, cultivadas em 40-Pa colágeno géis imitando rigidez baixa condições embrionárias11, reter relativamente normais estruturas tridimensionais (Figura 1) e manter as células ciliadas e apoiar as células (Figura 2 e Figura 3). Embora apoiando a densidade celular diminui por mais de 30% (teste t de…

Discussion

Os sinais moleculares que crescimento mediato e diferenciação na orelha interna durante o desenvolvimento foram extensivamente estudaram5,6,7,8,9,10. No entanto, evidências obtidas a partir do sistema modelo utricular sugerem que pistas mecânicas, sentidas-se através de cruzamentos de celular e a ativação da sinalizaç…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi e r. Petelski por suas contribuições para a pesquisa original em que se baseia este protocolo. Agradecemos também J. lhamas e W. Makmura para assistência técnica e criação de animais. Reconhecemos o subsídio de formação NIDCD T32 DC009975, NIDCD conceder R01DC015530, fundo de desenvolvimento terapêutico Robertson e Fundação da família Caruso para financiamento. Finalmente, reconhecemos o apoio do Howard Hughes Medical Institute, da qual Dr. Hudspeth é um investigador.

Materials

#10 Surgical Blades Miltex 4-110
#5 Forceps Dumont 11252-20
100 mm Petri dish Sigma P5856-500EA
250 uL large orifice pipette tips USA Scientific 1011-8406
30 mm glass-bottom Petri dish Matsunami Glass USA Corporation D35-14-1.5-U
4 well plate Thermo Fisher Scientific 176740
4-Hydroxytamoxifen  Sigma H7904
60 mm Petri dish Thermo Fisher Scientific 123TS1
Acetic acid  Sigma 537020
Ad-GFP Vector Biolabs 1060
Anti-GFP, chicken IgY fraction Invitrogen A10262 
Anti-Myo7A Proteus Biosciences 25-6790
Anti-Sox2 Antibody (Y-17) Santa Cruz sc-17320
Bicinchoninic acid assay Thermo Fisher Scientific 23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10340
Collagenase I Gibco 17100017
D-glucose Sigma G8270
DMEM/F12  Gibco 11320033
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 16140063
Fibroblast growth factor Sigma F5392
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97
Glutamine Sigma G8540
HBSS Gibco 14025092
Hemocytometer  Daigger EF16034F
HEPES Sigma H4034
Insulin Sigma I3536
Iridectomy scissors  Zepf Medical Instruments 08-1201-10  
Microinjector Narishige IM-6
Nicotinamide Sigma N0636
PBS (10X), pH 7.4 Gibco 70011044
PBS (1X), pH 7.4 Gibco 10010023
Phenol Red pH indicator  Sigma P4633 
Pure Ethanol, 200 Proof Decon Labs  2716
RFP antibody ChromoTek  5F8
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium hydroxide Sigma S8045
Sodium selenite Sigma S5261
Tabletop vortex  VWR 97043-562
Transferrin Sigma T8158
Trypan blue  Sigma T6146

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Cite This Article
Gnedeva, K., Hudspeth, A. J., Segil, N. Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs. J. Vis. Exp. (136), e57527, doi:10.3791/57527 (2018).

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