Summary

Визуализация мотор Axon навигации и количественной оценки Axon арборизация эмбрионов мыши, с помощью микроскопии флуоресцирования света лист

Published: May 11, 2018
doi:

Summary

Здесь мы описываем протокол для визуализации мотонейрона проекции и аксон арборизация в трансгенной эмбриона мыши Hb9::GFP . После иммуноокрашивания для двигательных нейронов мы использовали свет лист флуоресцентной микроскопии для изображения эмбрионов для дальнейшего количественного анализа. Этот протокол применяется к другим процессам навигации нейрон в центральной нервной системе.

Abstract

Мотонейронов спинного мозга (MNs) расширить их аксоны общаться с их innervating цели, тем самым контроль движения и сложные задачи в позвоночных. Таким образом важно выявить молекулярные механизмы как Мотор аксоны перейдите к arborize и иннервируют их периферические миорелаксанты цели во время разработки и дегенерации. Хотя трансгенных линий мыши Hb9::GFP долго служил для визуализации траекторий двигателя аксона во время эмбрионального развития, подробные описания полного спектра терминала арборизация аксона остаются неполными ввиду сложности шаблон и ограничения текущей оптической микроскопии. Здесь мы описываем улучшение протокол, который сочетает в себе свет лист флуоресцентной микроскопии (LSFM) и анализ надежной изображений и количественно и качественно визуализировать развивающихся мотор аксоны. Эта система может быть легко принял пересечь генетических мутантов или MN болезни модели с Hb9::GFP линиями, раскрывая новые молекулярные механизмы, которые приводят к дефектам в мотор аксона навигации и арборизация.

Introduction

MNs позвоночника являются частью центральной нервной системы, но иннервируют периферийных мышцы для контроля движения. В развивающихся спинного мозга MN прародителями (ПНЛ) устанавливаются согласно сигналы, исходящие от хорда и смежные сегменты. Все продифференцировано пост митотическая MNs затем создаются из ПНЛ, в конечном счете порождает ряд подтипов MN вдоль оси rostrocaudal спинного1,2. Позвоночника MNs топографически и анатомически хорошо организованы. Расположение их морфологические коррелирует с позиции их соответствующих целевых в периферии3. По достижении их целей мышц, аксоны получать сотовой и экзогенных нейротрофических факторов, которые побудить их расширения и филиал в мышцы. Иннервация и ветвления дефекты могут способствовать несоздания нервно развязок (NMJ). Например, глиальные нейротрофического факторы (GDNF)-индуцированной Pea3 является необходимым условием для арборизация аксона в кожный maximus (см) и мышцы, широчайшая мышца спины (LD)4,5. Кроме того рестораны нокаут мыши эмбрионов показывают дефектных арборизация диафрагмального нервов в диафрагмы, вызывая дыхательной недостаточности и смертности сразу же после рождения6,7. Таким образом этот последний шаг MN созревания (то есть, аксональное проекции и ветвление) имеет решающее значение для обеспечения связи между нейронами и клеток-мишеней.

Чтобы просмотреть шаблоны арборизация, исследователи обычно проводят конфокальная томография или легкие микроскопии флуоресцирования двух Фотон секционного или целое гора образцов8,9,10. Оба эти методы микроскопии генерировать приемлемое разрешение и глубину проникновения. Световой микроскопии флуоресцирования двух Фотон предполагает возбуждения флуорофоров одновременное поглощение двух нижнего энергии фотонов11. Поскольку два Фотон возбуждения использует ближнего инфракрасного излучения, снижение возбуждения частоты способствует уменьшение рассеяния и лучшего проникновения ткани до 1 мм в ткани, таким образом позволяя изображений с большей глубиной. Конфокальная микроскопия удаляет фильтры из фокус сигналов и только собирает свет в пределах фокальной плоскости12. С этим подходом изображения образцов из разных фокальной плоскости могут быть объединены для получения трехмерных (3D) изображения через функцию Z-стека. Тем не менее интенсивность сигнала снижается, как большинство свет блокируется и высокой численного отверстия закрывают глубина резкости. Что еще более важно обе методики способствуют тяжелые фотоповреждения и Фототоксичность поскольку весь образец получает свечение, даже тогда, когда только один самолет отображаемого в данный момент.

Чтобы обойти эти недостатки, LSFM стал благоприятствования альтернативы, с преимуществами, быстро, эффективно свет и меньше фототоксических13,14. Кроме того LSFM позволяет нескольких изображений. Этот подход особенно подходит для визуализации мотор аксонов и их диспергирования терминалы, как они распространились в трехмерном пространстве. LSFM превосходит другие два варианта, поскольку образцы устанавливаются на сцене, которая позволяет вращение вокруг вертикальной оси и движения вдоль x, y и z оси. Эта установка позволяет не только минимально заблокированных вид образца, но и выбор желательной освещение пути, недостаток двух фотонов и конфокальная микроскопия, оба из которых требуют монтажа образцов на слайде плоских. Таким образом LSFM является наиболее подходящим инструментом для 3D визуализации арборизация аксона и количественного определения двигательного нерва терминалов в эмбрионов мыши.

Protocol

Все живые животные хранились в конкретного возбудителя бесплатно (SPF) животных фонда, утвержденных и контролируется IACUC Синика. 1. Фиксация Собирать эмбрионов эмбриональных день 12,5 (E12.5) затем обезглавить и потрошение их. Исправьте эмбрионы индивидуально в 24-ну ?…

Representative Results

LSFM предоставляет подробные 3D визуализация MN траектории и аксон арборизация в мыши эмбрионов. Под ярким полем тканей появляются полностью прозрачным после погружения в коммерческой очистки реагента. Нет усадки или припухлость образца было замечено после хранения в о?…

Discussion

Несколько шагов в протоколе могут подвергаться изменениям при определенных обстоятельствах. Например длительность фиксации зависит от возраста эмбрионов, колеблется от 2 h 1 или более дней, используя свежеприготовленные параформальдегида. Так как фиксация осуществляется до вся гора и…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

LSFM экспериментов и анализ данных проводились в части с помощью передовых оптических микроскопов службу отдела инструмент в Синика и при содействии г-жи Шу-Чэнь Шэн. Мы благодарим г-жа Сью-пинг ли от Imaging основного объекта IMB для значительной технической помощи с анализа изображений Imaris. IMB научных Английский редактирования основных рассмотрел рукопись. Эта работа финансируется Academia хвощевой карьеры развитию премии (CDA-107-L05), наиболее (104-2311-B-001-030-MY3) и национальных правозащитных учреждений (НПУ-EX106-10315NC).

Materials

Hb9::GFP The Jackson labortory 005029 Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5)
4% Paraformaldehyde (PFA) For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT.
Triton X-100 Sigma X100-500ML
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 26140079
Sheep polyclonal anti-GFP AbD Serotec 4745-1051 1:1000
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep Invitrogen A-11015 1:1000
RapiClear 1.47 clearing reagent SunJin Lab RC147001
1.5ml micro tube Sarstedt 72.690.001
24 wells plate ThermoFisher 142475
5 SA Tweezer ideal-tek 3480641
Iris Scissors striaght sharp/sharp Aesculap BC110R
Microsurgery Scalpels, single use Aesculap BA365
Dissecting microscope Nikon SMZ800
Shaker TKS RS-01
Lightsheet Z.1 microscope Carl Zeiss Microscopy
Imaris 8.4.0 image analysis software Bitplane, Zurich, Switzerland
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) The Jackson Laboratory 005029

References

  1. Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
  2. Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
  3. Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
  4. Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
  5. Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
  6. Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
  7. Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
  8. Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
  9. Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
  10. Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
  11. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  12. Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
  13. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
  14. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
  15. Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
  16. De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
  17. Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
  18. Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
  19. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
  20. Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).

Play Video

Cite This Article
Liau, E. S., Yen, Y., Chen, J. Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57546, doi:10.3791/57546 (2018).

View Video