Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar
Summary
Burada, motor nöron projeksiyon ve transgenik Hb9::GFP fare embriyo axon arborization görüntülenmesi için bir protokol açıklayın. Motor nöronlar için immunostaining sonra hafif levha Floresans mikroskobu Image embriyolar için sonraki kantitatif analiz için kullanılan. Bu iletişim kuralı diğer nöron gezinti süreçlerinde merkezi sinir sistemi için geçerlidir.
Abstract
Omurilik motor nöronlar (MNs) böylece hareket ve karmaşık görevleri omurgalılarda kontrol innervating hedefleri, iletişim kurmak için onların aksonlar genişletir. Böylece, akson gidin, arborize ve periferik onların kas innervate motor geliştirme ve dejenerasyon sırasında nasıl hedefler moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemlidir. Transgenik Hb9::GFP fare hatları uzun motor axon yörüngeleri embriyonik gelişim sırasında görselleştirmek için hizmet etmiş olsa da, terminal akson arborization tam spektrum ayrıntılı açıklamaları desen karmaşıklığı nedeniyle eksik kalır ve sınırlamalar geçerli optik mikroskobu. Burada, hafif levha Floresans mikroskobu (LSFM) ve nitelik ve nicelik motor aksonlar geliştirme görselleştirmek için sağlam görüntü analizi bir araya getiren gelişmiş bir iletişim kuralı açıklar. Bu sistem kolayca genetik mutantlar veya MN hastalık modelleri motor axon gezinti ve arborization yol açan yeni moleküler mekanizmalar açığa Hb9::GFP çizgilerle geçmek için kabul edilebilir.
Introduction
Omurilik MNs merkezi sinir sisteminin parçası olan ancak hareketini denetlemek için periferik kasları innervate. Gelişmekte olan omurilik içinde MN ataları (pMNs) notochord ve bitişik somites yayılan sinyaller göre kurulur. Tüm sonrası Mitotik MNs ayrıştırılan sonra pMNs, sonunda bir dizi omurilik1,2rostrocaudal ekseni boyunca MN türlerinden sebebiyet veren oluşturulur. Omurilik MNs arazi ve anatomik olarak de düzenlenmektedir. Morfolojik düzenleri onların anılan sıraya göre hedef konumunu çevre3ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Kas hedeflerine ulaştıktan sonra akson genişletmek ve şube için onları teşvik hücresel ve eksojen Nörotrofik faktör almak kas içine daha fazla. İnnervasyon ve dallanma kusurları nöromüsküler kavşak (NMJ) oluşturmak için başarısızlık için katkıda bulunabilir. Örneğin, gliyal kaynaklı Nörotrofik faktörler (GDNF)-indüklenen Pea3 axon arborization Kutanöz maximus (CM) içine için vazgeçilmez ve latissimus dorsi (LD) kas4,5. Buna ek olarak, DINE nakavt fare embriyo solunum yetmezliği ve ölüm hemen doğum6,7sonra neden diyafram, frenik sinir arızalı arborization gösterir. Bu nedenle, bu son adım MN olgunlaşma (Yani, aksonlar projeksiyon ve dallanma) nöronlar ve hedef hücreler arasındaki iletişimi sağlamak için önemlidir.
Arborization desenleri görüntülemek için araştırmacılar normalde confocal görüntüleme veya İki fotonlu Floresan ışık mikroskobu kesitli veya bütün-bağlama örnekleri8,9,10kuralları. Bu mikroskobu tekniklerin her ikisi de kabul edilebilir çözünürlük ve derinlik penetrasyonu oluşturmak. İki fotonlu Floresan ışık mikroskobu, iki alt-enerji fotonlar11eşzamanlı absorpsiyonu ile fluorophores uyarma içerir. İki fotonlu uyarma yakın kızılötesi radyasyon kullandığından, azalan uyarma sıklığını azaltılmış saçılma ve daha iyi doku penetrasyonu 1 mm doku, böylece daha büyük derinlik ile görüntülemede izin katkıda bulunur. Confocal mikroskobu odak out ve sinyalleri sadece odak düzlemi12içinde ışık toplar filtreleri kaldırır. Bu yaklaşım ile örnekleri farklı odak uçak görüntülerini bir Z-yığın fonksiyonu üzerinden üç boyutlu (3D) görüntü üretmek için kombine edilebilir. Yine de, sinyal şiddeti ışık çoğunu engellenir ve yüksek sayısal açıklık alan derinliği belirsiz olarak azalır. Daha da önemlisi, herhangi bir anda yalnızca bir uçak bile görüntüsü aydınlatma bütün numune alır bu yana her iki tekniğin de şiddetli duyarlilik ve fototoksisite katkı.
Bu eksikliklerini aşmak için LSFM hızlı, ışık verimli olmanın avantajı ile tercih edilen bir alternatif ve daha az Fototoksik13,14haline gelmiştir. Ayrıca, LSFM çok görünüm görüntüleme sağlar. Bu yaklaşım Özellikle onlar 3D uzayda yaymak gibi motor aksonlar ve dispersiyon onların terminalleri görüntülenmesi için uygundur. Örnekleri x, y ve z eksenleri boyunca hareketler ve bir dikey ekseni çevresinde döndürme sağlar bir sahnede monte edilir çünkü LSFM diğer iki seçenek daha iyi performans. İkisi de montaj örnekleri düz bir slaytta gerektiren bu kurulum sadece örnek en az engellenen bir görünümünü aynı zamanda bir arzu edilen aydınlatma yol, İki fotonlu ve confocal mikroskobu, bir eksiklik seçimi sağlar. Bu nedenle, LSFM en uygun miktar motor sinir Terminal içinde fare embriyo ve akson arborization 3D görüntüleme için bir araçtır.
Protocol
Representative Results
Discussion
İletişim kuralı birkaç adımda belirli koşullar altında değişikliklere tabi olabilir. Örneğin, fiksasyon süresi 2 h paraformaldehyde taze yapılmış kullanarak 1 veya daha fazla gün için değişen embriyo yaşın üzerinde bağlıdır. Fiksasyon için protein crosslinking, hassas antikorlar için bütün Dağı immunostaining önce yürütülen metanol alternatif bir sabitleştirici ajan olarak kullanılabilir. Boyama üzerine bir yüksek sinyal gürültü oranı için deterjan toplama en iyi duruma getirme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSFM deneyleri ve veri analizi kısmen enstrüman hizmet bölümü gelişmiş optik mikroskoplar kullanarak Academia Sinica ve Bayan Shu-Chen Shen yardımı ile yapıldı. Bayan Sue-Ping Lee Imaging Core tesis, IMB Imaris görüntü analizi ile önemli teknik destek için teşekkür ediyoruz. IMB’ın bilimsel İngilizce düzenleme Core el yazması inceledim. Bu eser Academia Sinica kariyer geliştirme Ödülü (CDA-107-L05), en (104-2311-B-001-030-MY3) ve NHRI (NHRI-EX106-10315NC) tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
