Summary
هنا نقدم بروتوكول الذي يهدف إلى تحليل ملزمة على نطاق الجينوم عامل النسخ oligodendrocyte 2 (Olig2) في الدماغ تنقية حادة oligodendrocyte خلايا السلائف (OPCs) بأداء منخفضة خلايا الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (شريحة) ، إعداد مكتبة والتسلسل الفائق وتحليل البيانات بيوينفورماتيك.
Abstract
في خلايا الثدييات، ينظم التفاعلات بين العوامل النسخي مع الحمض النووي الجينات النسخ بطريقة محددة نوع خلية. وتعتبر عوامل النسخ الخاصة بالنسب القيام بأدوار أساسية في مواصفات الخلية والتمايز من خلال التنمية. رقاقة مقترنة بتسلسل الحمض النووي الفائق (الرقائق-seq) يستخدم على نطاق واسع لتحليل مواقع على نطاق الجينوم ربط عوامل النسخ (أو المعقدة المرتبطة به) للحمض النووي. ومع ذلك، عدد كبير من الخلايا مطلوبة من أجل رد رقاقة قياسي واحد، مما يجعل من الصعب على دراسة عدد محدود من الخلايا الأولية المعزولة أو خلية نادرة السكان. من أجل فهم الآلية التنظيمية للنسخ الخاصة بالنسب oligodendrocyte يظهر عامل Olig2 في الماوس المنقي حادة المعاونة، طريقة مفصلة باستخدام رقاقة seq لتحديد المواقع على نطاق الجينوم ملزمة Olig2 (أو Olig2 المعقدة). أولاً، البروتوكول يوضح كيفية تنقية ألفا مستقبلات عامل النمو المشتقة من الصفيحات (PDGFRα) المعاونة الإيجابية من العقول الماوس. المقبل، بوساطة جسم Olig2 رقاقة وتتم بناء مكتبة. ويصف الجزء الأخير بيوينفورماتيك البرامج والإجراءات المستخدمة لتحليل Olig2 رقاقة-seq. وباختصار، تقارير هذه الورقة أسلوباً لتحليل الارتباطات على نطاق الجينوم النسخي عامل Olig2 في الدماغ تنقية حادة المعاونة.
Introduction
من المهم دراسة البروتين (أو البروتين المعقدة) ربط الحمض النووي وعلامات جينية لبناء الشبكات التنظيمية النسخي الضالعة في العمليات البيولوجية المختلفة. خاصة، ارتباطات عوامل النسخ إلى الحمض النووي يمكن أن تلعب دوراً هاما في تنظيم الجينات، والتفريق بين الخلية، وتطوير الأنسجة. أداة قوية لدراسة تنظيم النسخي والآليات جينية الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة). نظراً للتقدم السريع في تكنولوجيا الجيل القادم على التسلسل، يستخدم رقاقة مقترنة بتسلسل الحمض النووي الفائق (الرقائق-seq) لتحليل روابط البروتين-الحمض النووي وعلامات جينية1. ومع ذلك، تتطلب بروتوكول seq رقاقة قياسي الخلايا حوالي 20 مليون كل رد فعل، الأمر الذي يجعل تطبيق هذه التقنية صعبة عندما يقتصر عدد الخلايا، مثل الخلايا الأولية المعزولة وخلية نادرة السكان.
وتوزع على نطاق واسع في جميع أنحاء الدماغ oligodendrocyte خلايا النسب بما في ذلك الخلايا السليفة oligodendrocyte (OPCs) و oligodendrocytes وضرورية للتنمية ووظيفة المخ. كنوع من خلايا السلائف، قادرون على المعاونة للتجديد الذاتي والتمايز. المعاونة ليس فقط بمثابة المتكفل ل oligodendrocytes ولكن أيضا تلعب دوراً هاما في نشر الإشارات العصبية بالتواصل مع أنواع أخرى من خلايا الدماغ2. وأشارت الدراسات السابقة أن التنمية أوليجوديندروسيتي يخضع لعوامل النسخ الخاصة بالنسب مثل Olig2 و Sox103،4. تم العثور على هذه العوامل النسخ لربط مناطق المروج أو محسن لبعض الجينات الحاسمة للتأثير على التعبير عنها أثناء أوليجوديندروسيتي مواصفات وتفرقة. ومع ذلك، أنها صعبة لتحديد ربط الحمض النووي للبروتين (أو البروتين المعقدة) الاهتمام بالمعاونة الأولية النقية حادة مع عدد محدود جداً من الخلايا.
هذا البروتوكول وصف كيفية التحقيق بشكل منهجي إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي الجينوم ب Olig2 في الماوس المنقي المعاونة في نطاق الجينوم باستخدام تقنية رقاقة seq. المعاونة من العقول الماوس حادة تنقيته من إيمونوبانينج والمستخدمة في تجربة رقاقة دون الانتشار في المختبر. عدد محدود من المعاونة يمكن الحصول عليها من إيمونوبانينج وهو غير كاف لإجراء التجارب على رقاقة seq القياسية. هنا، أن بروتوكول seq رقاقة خلية منخفض مع منخفضة تصل إلى 20 ألف الخلايا كل رقاقة رد فعل لعوامل النسخ وصف. وباختصار، تفكيك خلايا cross-linked وسونيكاتيد بجهاز سونيكيشن القص في الكروماتين. كان المحتضنة الكروماتين المنفصمة مع الأجسام المضادة Olig2، فضلا عن البروتين الخرز المغلفة يعجل بالحمض النووي Olig2 جسم ملزمة. بعد شطف من البروتينات المغلفة بالخرز والعابرة للربط العكسي، تمت تنقية الحمض النووي عجلت بجسم Olig2 باستخراج الفينول كلوروفورم. وناتج كمياً وتعرض لتراجع تي، التمهيدي الصلب القالب التبديل والتمديد، إضافة محولات والتضخيم، واختيار حجم المكتبة وتنقية خطوات لبناء مكتبة شرائح seq.
بعد التسلسل، وقد تم تحليل النوعية من الخام على ما يلي من العينة أعد مع جسم عامل النسخ Olig2 ونموذج عنصر تحكم. زوج قاعدي منخفض الجودة والتي تحتوي على محول قراءة أجزاء تم اقتطاعها. كانت محاذاة القراءات القادمة، قلصت إلى الجينوم إشارة الماوس. مناطق الجينوم التي كانت أثرت إلى حد كبير على رقاقة على ما يلي، بالمقارنة إلى نموذج عنصر تحكم، تم الكشف عنها كقمم. تم تصفية قمم كبيرة، تمثل مواقع الربط عامل النسخ المحتملة، وتصور في مستعرض جينوم.
جدير بالذكر أن الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن استخدامها على نطاق واسع ل seq رقاقة من عوامل النسخ الأخرى مع أي نوع من الخلايا لعدد محدود.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع استخدام الحيوان والبروتوكولات التجريبية تجري وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ووافقت عليها لجنة السلامة المؤسسية ولجنة رعاية الحيوان في مركز العلوم الصحية في جامعة تكساس هيوستن.
1-تنقية PDGFRα إيجابية الخلايا Oligodendrocyte النسب من "الدماغ الماوس" (معدلة من إيمونوبانينج هو موضح سابقا البروتوكولات5،،من67)
-
إعداد صفيحة إيمونوبانينج لتحديد الخلية إيجابية PDGFRα ولوحات 2 لاستنفاد الخلايا البطانية وميكروجليا.
ملاحظة: يرجى ملاحظة أن أطباق بيتري لكن لا خلية ثقافة الأطباق تعمل للتجربة إيمونوبانينج؛ إذا كان سيتم استخدام الخلايا المنقي لاستزراع، يجب تنفيذ الخطوات إيمونوبانينج في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء- معطف من 10 سم لوحة بيتري مع 30 الفئران لمكافحة الماعز ميليلتر مفتش في 10 مل pH 9.5، 50 مم تريس-HCl بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تحرض على لوحة للتأكد من أسطح اللوحات يشملها الحل الطلاء بالتساوي وبشكل كامل.
- تحضير PDGFRα جسم حل بتمييع ميليلتر 40 من جسم PDGFRα مكافحة الفئران مع 12 مل من الفوسفات مخزنة المالحة في دولبيكو (دببس) يحتوي على 0.2% جيش صرب البوسنة.
- بعد يغسل 3 من لوحة مفتش المغلفة مع 10 مل احتضان x DPBS 1، كل لوحة المغلفة بمفتش مع حل جسم PDGFRα في درجة حرارة الغرفة ح 4.
- أغسل PDGFRα مكافحة الفئران جسم معدني مغلف لوحة 3 مرات مع 10 مل كل 1 x DPBS. إضافة حل دببس على طول الجدار الجانبي اللوحة بلطف وعدم الإزعاج الأسطح المطلية.
- معطف 2 15 سم بيتري لوحات جديدة لاستنزاف خلايا بطانية و microglia مع 20 مل دببس التي تحتوي على 2.3 ميكروغرام/مل من يكتين سيمبليسيفوليا بانديريايا 1 (BSL-1) ح 2.
- أغسل المغلفة BSL-1 لوحات 3 مرات مع 20 مل 1 x DPBS. إضافة حل دببس على طول الجدار الجانبي من اللوحات بلطف وعدم الإزعاج الأسطح المطلية.
-
يتم تعديل تنقية PDGFRα الإيجابية oligodendrocyte خلايا النسب من أساليب المنشورة سابقا6 , 7 , 8-
- تشريح الأنسجة القشرية من 2 بعد الولادة يوم 7 (P7) الماوس العقول سابقا وفقا للبروتوكولات المنشورة5،6.
- ننأى بالانسجة لتوليد تعليق خلية واحدة مع تفكك الأنسجة العصبية كيت (ع) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مفصلة.
- بإيجاز، يقتطع قطعة مع مشرط تشريح الأنسجة القشرية وإخضاعها الهضم الأنزيمي في 37 درجة مئوية. وبعد الهضم، يدوياً ننأى بالقطع مع الزجاج المصقول النار الماصات باستور في تعليق خلية واحدة.
- الطرد المركزي من تعليق خلية واحدة على 300 غرام x لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتعليق بيليه خلية تستخدم 15 مل من المخزن المؤقت إيمونوبانينج (إيمونوبانينج المخزن المؤقت هو دببس مع جيش صرب البوسنة 0.02 في المائة و 5 ميكروغرام/مل الأنسولين).
- احتضان تعليق خلية واحدة من العقول الماوس 2 التتابع في لوحات BSL-1 المغلفة 2 لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف لصفيحة كل 5 دقائق لضمان أفضل استنفاد microglia وخلايا بطانية.
- بلطف دوامة لوحة لجمع الخلايا غير ملتصقة في تعليق خلية واحتضانها لهم على لوحة المغلفة بالأجسام المضادة PDGFRα الفئران لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد الحضانة لتعليق خلية في لوحة المغلفة بجسم الجرذ-PDGFRα، بلطف دوامة لوحة لجمع تعليق خلية، وشطف لوحة 8 مرات مع دببس للتخلص من الخلايا غير ملتصقة. بلطف إضافة الحل أغسل على طول الجدار الجانبي اللوحة وتحرض اللوحة عدة مرات للتخلص من الخلايا غير ملتصقة.
- فصل الخلايا من لوحة جسم معدني مغلف الفئران-PDGFRα استخدام مل 4 خلايا مفرزة حل المعاملة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. اهتزاز لوحة لإزاحة الخلايا ملتصقة.
- جمع المعاونة المنقي بالطرد المركزي في ز 300 x في درجة حرارة الغرفة، وتعليق بيليه الخلية مع 2 مل OPC خلية الثقافة المتوسطة وعد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير (500 مل خلية الثقافة المتوسطة هو DMEM/F12 المتوسطة التي تحتوي على 5 مل الحل البنسلين والستربتوميسين (P/S)، 5 مل N2، 10 مل B27, 5 ميكروغرام/مل الأنسولين، 0.1% جيش صرب البوسنة، 20 نانوغرام/مل بفجف و 10 نانوغرام/مل PDGFRα).
-
التحقق من صحة نقاء المعاونة بعد إيمونوبانينج.
- بغية تقييم إثراء المعاونة بعد إيمونوبانينج، واستخدام بعض المعاونة المنقي لاستخراج الحمض النووي الريبي مع ثيوسيانات جوانيديوم أساس استخراج وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- إجراء qRT PCR باستخدام صبغ أخضر نيون مزيج الرئيسي للتحقق من أجل إثراء التعبير PDGFRα في تنقية المعاونة بالمقارنة مع خلايا الدماغ ينتابها وفقا للمواد المنشورة سابقا4.
- بالإضافة إلى ذلك، بذور بعض المعاونة المنقاة في بولي-د-يسين مغلفة ألواح 24 جيدا إيمونوستينينج مع مكافحة NG2 كبريتات شوندروتن بروتيوغليكان (NG2) الأجسام المضادة كما سبق نشر المواد9.
2-إعداد شرائح منخفض-الخلية وبناء مكتبة شرائح للتسلسل الفائق
-
إعداد شرائح منخفضة-خلية Olig2 مع نظام سونيكيشن متاحة تجارياً وعدد خلايا منخفض متاحة تجارياً رقاقة كيت (انظر الجدول للمواد) باتباع الإجراءات القياسية مفصلة من إرشادات الشركة المصنعة.
- بعد فصلها من الفئران مكافحة--PDGFRα وضع لوحة المغلفة بالأجسام المضادة وخلية العد مع تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير 1 مل OPC خلية الثقافة المتوسطة لكل رد فعل رقاقة 20,000 المعاونة المنقي.
- إضافة 27 ميليلتر من 36.5% فورمالدهايد لإصلاح تعليق خلية لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه: يرجى ملاحظة أنه يجب استخدام الفورمالدهايد في غطاء الأبخرة الكيميائية لأسباب تتعلق بالسلامة. - إيقاف البروتين الحمض النووي العابرة للربط مع 50 جليكاين 2.5 م ميليلتر لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: جميع الخطوات يجب أن تنفذ على الجليد أو في غرفة باردة 4 درجات مئوية من هذه النقطة. - تغسل الكريات خلية cross-linked مع 1 مل من متوازن الملح الحل (حبس المثلج هانكس) مع مثبطات البروتياز كوكتيل والحصول على خلايا القريبون من يبرد قبل أجهزة الطرد مركزي في 300 غرام x عند 4 درجة مئوية.
- بيليه الخلية في 25 ميليلتر الكامل "تحلل المخزن المؤقت" لمدة 5 دقائق على الجليد.
ملاحظة: تحرض على أنبوب لتعليق الخلايا الموجودة في "المخزن المؤقت لتحلل". - الملحق الخلية مع 75 ميليلتر المثلج حبس المحتوية على مثبطات البروتياز كوكتيل والقص الكروماتين خلية التي تبرد قبل نظام سونيكيشن مع 5 دورات 30 ق على وق 30 إيقاف البرنامج. دائماً sonicate أنابيب 6 معا والتأكد من رصيد أنابيب تحتوي على 100 ميليلتر المياه.
- وبعد القص، الطرد المركزي في س 14,000 ز لمدة 10 دقائق 4 درجات مئوية وجمع المادة طافية في أنبوب جديد بعد الطرد المركزي.
- تمييع 100 ميليلتر من الكروماتين المنفصمة مع تساوي حجم الجليد "العازلة رقاقة" كاملة مع مثبط البروتياز.
- إنقاذ 20 ميليلتر من الكروماتين المنفصمة المخفف كنموذج عنصر تحكم الإدخال.
ملاحظة: نموذج عنصر تحكم الإدخال مطلوب أيضا بالمقارنة إلى Olig2 إيمونوبريسيبيتاتيد العينة لتحديد Olig2 جسم إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي. - أضف 1 ميليلتر من جسم olig2 مكافحة الأرانب إلى 180 ميليلتر من تضعف المنفصمة الكروماتين واحتضان الأنبوب رد فعل على عجلة دوارة في 40 دورة في الدقيقة ح 16 عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غرفة باردة. - لكل رد فعل رقاقة، أغسل ميليلتر 11 بروتين المغناطيسي الخرز المغلفة بألف مع ميليلتر 55 "الخرز يغسل المخزن المؤقت" ووضع حبة بيليه في ميليلتر 11 حبة يغسل المخزن المؤقت بعد يغسل 2.
ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غرفة باردة. - لكل رد فعل رقاقة، إضافة 10 ميليلتر من حبات المغلفة بالبروتين قبل غسلها لرقاقة رد فعل أنبوب. تنفيذ هذه الخطوة في غرفة باردة.
- احتضان الأنبوب رقاقة رد الفعل عند 4 درجة مئوية لآخر ح 2 على عجلة دوارة.
- وضع أنبوب رد فعل رقاقة على الرف المغناطيسية لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غرفة باردة. - إزالة المادة طافية ولا إزاحة بيليه حبة.
- تغسل حبة بيليه مع 100 ميليلتر لكل من مخازن الغسيل 4 على التوالي لمدة دقيقة 4 على عجلة دوارة في 4 درجات مئوية.
- بعد يغسل، إضافة 200 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت إلى بيليه حبة واحتضان الأنبوب رقاقة رد الفعل عند 65 درجة مئوية ح 4 عكس قياس البروتين-الحمض النووي.
- بالإضافة إلى ذلك، أضف ميليلتر 180 شطف المخزن المؤقت إلى نموذج عنصر تحكم الإدخال ميليلتر 20 واحتضان عند 65 درجة مئوية ح 4 عكس قياس البروتين الحمض النووي، وكذلك.
- إضافة 200 ميليلتر 25:24:1 (v/v) خليط من الكحول الفينول كلوروفورم وإيسواميل لكل أنبوبة رد فعل رقاقة.
- الدوامة بقوة عن 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل في المرحلة العليا لأنبوب جديد.
- إضافة ميليلتر 40 م 3 صوديوم اسيتات الحل، 1,000 ميليلتر من الإيثانول 100% و 2 ميليلتر من الجليكوجين مرسب مرتبطة تساهميا بصبغة زرقاء لكل أنبوبة رد فعل رقاقة بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- تجاهل المادة طافية وتغسل مع 500 ميليلتر الباردة الإيثانول 70% والطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- تجاهل المادة طافية والحفاظ على الهواء بيليه الجافة لمدة 10 دقائق وحل بيليه مع 50 ميليلتر المياه.
-
رقاقة بناء مكتبة للتسلسل الفائق
- تنظيف وتركز "رقاقة الحمض النووي" مع مجموعة أدوات تنظيف وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
- تحديد حجم العينة رقاقة من بيكو-أخضر وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- استخدام مجموعة شرائح seq تي-تراجع والنسخ المتماثل وتراجع، وتبديل القالب والتمديد، إضافة محولات والتضخيم، واختيار حجم المكتبة وتنقية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- بعد تمسخ دسدنا، ديفوسفوريلاتي 3 ' نهاية سدنى بالجمبرى الفوسفاتيز القلوية وإضافة ذيل بولي (T) إلى سدنى ترانسفيراز ديوكسينوكليوتيديل المحطة الطرفية.
- يصلب التمهيدي "بولي الحمض النووي" (دا) على قالب سدنى لتكرار الحمض النووي وتبديل القالب.
- بعد القالب التبديل، تضخيم المكتبة seq رقاقة ببكر مع الإشعال إلى الأمام وعكس للفهرسة.
- حدد بكر تضخيم مكتبة seq رقاقة مع الشظايا التي تتراوح ما بين 250 إلى 500 bp بالخرز باراماجنيتيك بالخيار 2 لمضاعفة حجم التحديد.
- دراسة نوعية المكتبة seq رقاقة المحدد باستخدام جهاز التفريد الشعرية رقاقة موائع جزيئية.
3-بيانات التحليل
- إعداد بنية الدليل.
- قم بإنشاء دليل لتنفيذ تحليل البيانات رقاقة seq. داخل الدليل الذي تم إنشاؤه حديثا، قم بإنشاء الدلائل الفرعية الستة مع الأسماء التالية: raw.files، fastqc.output، bowtie.output، homer.output، macs2.output، motif.analysis، والتقارير.
- إعداد البيانات والقيام بتحليل مراقبة الجودة للبيانات الأولية تسلسل.
- الانتقال إلى الدليل "raw.files" وتحميل ملفات البيانات رقاقة seq.
- التحقق من أسماء الملفات. إذا كان التسلسل نهاية الاقتران، سيكون هناك 4 ملفات (اثنان للعلاج)، واثنان للإدخال مع أسماء قاعدة مشابهة: PDGFRα_Olig2.read1.fastq، PDGFRα_Olig2.read2.fastq، PDGFRα_input.read1.fastq، و PDGFRα_input.read2.fastq. إذا كانت أسماء الملفات مختلفة، إعادة تسميتها باستخدام الأمر "أم".
- الانتقال إلى الدليل "fastqc.output".
- الحصول على مقاييس الجودة من يقرأ الخام باستخدام برامج مراقبة جودة ملف فستق10. استخدام الأمر في الشكل S1A لتشغيل عملية مراقبة الجودة بشكل منفصل لكل ملف فاستق. سيتم عرض البرنامج عدة مقاييس مراقبة الجودة في ملف html.
- فتح ملف html مراقبة الجودة والتحقق من عدد ما يلي: قراءة طول الواحدة ونوعية قاعدة التسلسل، كل تسلسل الجودة عشرات وتسلسل GC المحتوى، ومستويات التسلسل الازدواجية، المحتوى المحول والمحتوى kmer.
- تقليم زائدة على ما يلي منخفضة الجودة والمحتوى المحول.
- مراقبة "لكل تسلسل قاعدة نوعية" وقطع "محول المحتوى". تحديد طول التشذيب لكل رأس وذيل لكل عملية قراءة. هو طول الكافي للتشذيب حيث نوعية قاعدة أقل من 30 وهناك أدلة على المحتوى المحول.
- الانتقال إلى الدليل "raw.files".
- تحميل وتثبيت برنامج حاسوبي لاقتطاع ما يلي:11. استخدم الأمر في الشكل S1B للتشذيب العلاج والإدخال بشكل منفصل. المعلمة 'المحاصيل' يشير إلى طول القراءة المتبقية بعد اقتطاع قواعد من النهاية و 'هيدكروب' يحدد عدد القواعد القضاء على من بداية القراءة.
- كما يتضمن الأمر اقتطاع الحد الأدنى قراءة طول مقبولاً بعد التصفية في المعلمة 'مينلين'. إذا كان يقرأ على الأقل 50 شركة بريتيش بتروليوم، استخدام 35 شركة بريتيش بتروليوم، كعتبة طول القراءة.
- الانتقال إلى الدليل "fastqc.output".
- أداء تحليل مراقبة جودة الملف فستق بعد التشذيب على ما يلي. تحقق من أن قضايا مراقبة الجودة قد تم حلها. استخدم الأمر في الشكل S1C للحصول على قياسات مراقبة الجودة.
- قم بمحاذاة يقرأ seq رقاقة واحدة-نهاية أو نهاية الاقتران للجينوم إشارة الماوس.
- الانتقال إلى الدليل "bowtie.output" لرسم الخرائط.
- تحميل الجينوم إشارة الماوس mm10 جينكودي. إعادة تسمية جينوم إشارة الماوس mm10 ك "mm10.fa".
- تحميل مخطط قراءة12 وتثبيته في النظام.
- إنشاء ملف فهرس الجينوم المرجع الذي تم تحميله باستخدام الأمر في S2A الشكل. يتم تلقائياً إنشاء ملفات ستة: mm10.1.bt2، mm10.2.bt2، mm10.3.bt2، mm10.4.bt2، mm10.rev.1.bt2، و mm10.rev.2.bt2.
- استخدم الأمر في الشكل S2B لتنفيذ المحاذاة وضبط المعلمة "-ف" إلى عدد أساسيات المعالجة وفقا لإعدادات النظام. في حالة تشغيل وضع نهاية الاقتران، معلمات "-1" و "-2" تشير إلى أسماء الملفات فستق المشذبة.
ملاحظة: يتم تنفيذ التعيين بشكل منفصل للعينات المعاملة والمدخلات، ويتم إنشاء ملفات السجل متري الإخراج لكل عينة. - تنزيل برامج لمعالجة الملفات في تنسيق سام13 وتثبيته في النظام. تحويل ملف سام تمت محاذاته إلى أم ملف باستخدام الأمر في S2C الشكل.
- الحصول على مقاييس مراقبة الجودة للقراءات المعينة قبل ذروة يدعو كلا إقران نهاية العلاج ومراقبة العينات.
- واحدة من أهم مقاييس الجودة لعنوان هو عمق التسلسل. فتح ملفات "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" و "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" في الدليل bowtie.output وتأكد من أن عدد أزواج قراءة فريد تم تعيينه في كل عينة أكبر من 10 مليون.
- الانتقال إلى الدليل "homer.output".
- تنزيل برامج لاكتشاف الحافز والجيل التالي تسلسل تحليل14 وتثبيته في النظام.
- قم بإنشاء دليل يسمى "تاجدير".
- للتحقق من كلوناليتي العلامة، استخدم الأمر مبين في الشكل S3A. الأمر "ماكيتاجديريكتوري" سيقوم بإنشاء أربعة مراقبة جودة الإخراج files:tagAutocorrelation.txt، tagCountDistribution.txt، tagInfo.txt، و tagLengthDistribution.txt.
- الانتقال إلى الدليل "تاجدير".
- نسخ الملف "tagCountDistribution.txt" في الدليل "تقارير".
- الانتقال إلى الدليل "تقارير".
- افتح الملف tagCountDistribution.txt باستخدام برنامج جدول بيانات وإنشاء شريط الأرض عدد من العلامات كل موقف الجينوم. تخزين ملف الرسم البياني باسم "tag.clonality.xlsx".
- تثبيت R برمجة اللغة15 في النظام.
- في المحطة الطرفية، اكتب 'R' واضغط على ENTER للوصول إلى بيئة البرمجة R.
- تحميل حزمة R لتجهيز seq رقاقة البيانات16 وتثبيته باستخدام الأمر مبين في الشكل S3B.
- استخدام البرنامج النصي R في الشكل S3C مؤامرة الصليب حبلا-العلاقة المتبادلة.
- الكشف الذري باستخدام مخطط ذروته.
- الانتقال إلى الدليل "macs2.output". تنزيل وتثبيت مخطط ذروة17 في النظام الخاص بك.
- استخدم الدالة "كالبيك" مع العلاج والسيطرة على سوق بكارا للأسلحة الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.4.6.
ملاحظة: معلمات أخرى تشمل "-و" لتنسيق ملف الإدخال، "-ز" لحجم الجينوم، "-اسم" لتشير إلى الاسم الأساسي لكافة ملفات الإخراج، و "-ب" لتخزين تصادم الشظايا في تنسيق بيدجراف. يتم تضمين الذروة إكمال استدعاء الأمر في S4A الشكل. استخدام بدب للعينات المزدوجة الغرض. - تأكد من أن مخطط الذروة ولدت ستة ملفات: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls، PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak، PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed، PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r، PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg، و PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
- فتح ملف PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls لعرض قمم تسمى، الموقع وطول، وموقف مؤتمر القمة، وتصادم والمقاييس تخصيب الذروة:-log10(pvalue)، أمثال تخصيب اليورانيوم، و-log10(q-value).
- تصفية وتعليم قمم تسمى.
- باستخدام الملف الذي فتحه في الخطوة السابقة، تصفية قمم الناتجة وفقا لإثراء إضعاف، قيمة p و/أو q-القيمة. لتحديد عتبات التصفية المناسبة، جعل مؤامرة الرسم بياني لتحديد الكثافة من كل متري. تصفية قيم العتبة محددة للحصول على قمم كبيرة.
- تحميل القائمة السوداء mm10 (مناطق معروفة بإشارة ارتفاع مصطنع) وتصفية الرقاقة-seq القمم التي تكون داخل أي من تلك المناطق قطعة أثرية.
- قم بإنشاء ملف سرير مع قمم المصفاة التي تحتوي على الأعمدة التالية: كروموسوم، بداية ونهاية، بيكيد، موك وحبلا. ملء العمود وهمية مع نقطة "." نظراً لأنه لا يستخدم. في العمود ستراند، تعيين كافة القيم إلى "+". احفظ الملف سرير ك "filtered.peakData2.bed".
- نسخ الملف "filtered.peakData2.bed" في الدليل "تقارير".
- الانتقال إلى الدليل "تقارير".
- لإضافة تعليق توضيحي القمم التي تمت تصفيتها إلى منطقة جين معين، استخدم الدالة "أنوتاتيبيكس" مع ملف سرير بإنشائه في الخطوة السابقة. ويبين الشكل S5Aالأمر المستخدم.
- افتح الملف "filtered.annotatedPeaks.txt" باستخدام برمجيات إحصائية.
- تصفية قمم الناتجة عن الكذب في منطقة إينتيرجينيك على مسافة أكبر من 5 كيلو من خدمات الدعم التقني مشروح. استخدام العمود "المسافة إلى خدمات الدعم التقني" في الملف كالمسافة للتصفية. تخزين على قمم المصفاة في ملف excel المسمى "5kbup.geneBody.peakData.txt".
- تخزين الناتج عن تصفية قمم في ملف بيدجراف مع الأعمدة: كروموسوم، بداية، نهاية، و-log10(q-value). اسم الملف "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
- إنشاء ملفات نتأمل للتصور المستعرض.
- تحميل وتثبيت برنامج حاسوبي للجينوم الحسابية18.
- تحميل أداة لتحويل بيدجراف لنتأمل وتثبيتها في النظام. تحميل الملف 'mm10.chrom.sizes'.
- استخدم الأمر في الشكل S6A لإنشاء ملف نتأمل.
- تنزيل وتثبيت مستعرض جينوم19 في النظام.
- افتح مستعرض الجينوم وتحميل الملف "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" لتصور قمم الهامة التي تمت تصفيتها ومواقعها فيما يتعلق بالجينات المعروفة.
- فكرة البحث.
- الانتقال إلى الدليل "motif.analysis".
- تحميل عزر نوفو دي المسح والحافز لتخصيب وتثبيته في النظام الخاص بك20.
- تحميل قاعدة بيانات فكرة شاملة تتضمن زخارف Olig2.
- الحصول على تسلسل الجينوم من 500 bp مناطق تركزت في مؤتمرات قمة هامة. تخزن في التسلسل ك peak.sequences.txt. استخدم الأمر في الشكل S7 للبحث عن زخارف Olig2 داخل كل منطقة من مناطق ذروة bp 500.
- تصفية زخارف الناتجة باستخدام قيمة ه كافية (الافتراضي = 0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
منخفض-خلية رقاقة-seq أنجز وأجريت تحليلات بيوينفورماتيك للتحقيق في التفاعلات المحتملة من عامل النسخي Olig2 مع الحمض النووي في الدماغ تنقية حادة المعاونة. ويبين الشكل 1 سير عمل عامة التجريبية وإجراءات تحليل البيانات. في هذا البروتوكول، وتم فصل أدمغة الفئران بعد الولادة إلى تعليق خلية واحدة. وبعد تفكك النسيج، أجرى إيمونوبانينج لتنقية المعاونة باستخدام الأجسام المضادة PDGFRα. ويبين الشكل 2 في إثراء كبيرا PDGFRα، التعبير القليل من العصبية علامة Tuj1 (الفئة الخاصة بالخلايا العصبية الثالث بيتا-tubulin)، أستروسيتي ماركر توصيني (الدبقية فيبريلاري الحمضية البروتين)، محول ربط الكالسيوم المتأين علامة microglia جزيء 1 (Iba1)، ميليناتينج ناضجة oligodendrocytes ماركر المايلين البروتين الأساسية (Mbp) وبروتين سكري oligodendrocyte المايلين (موج) من المعاونة المنقي بتقييمه بواسطة RT-قبكر. بالإضافة إلى ذلك، يشير النتيجة immunostaining غالبيتهم من الخلايا NG2 إيجابية كما هو مبين في الشكل 2. بعد ذلك، كانت ثابتة المعاونة المنقي 20 ألف كل رد فعل من فورمالدهايد وكان المنفصمة الكروماتين باستخدام نظام سونيكيشن. أنجز رقاقة الخلية منخفض Olig2 وشيد في المكتبة. بعد إعداد مكتبة شرائح، تم التحقق من نوعية المنتج الذي تم إنشاؤه بجهاز التفريد الشعرية رقاقة موائع جزيئية. ويبين الشكل 3 اليكتروفيروجرام مثال مكتبة شرائح منخفضة-خلية Olig2. منتج مكتبة ذروة Oligo2 واضحة تتراوح ما بين 250 إلى 500 bp يجب أن تكون مرئية بعد تحديد حجم المكتبة بكر المنتج. تعرض المكتبات seq رقاقة من العينة التي أعدت مع جسم عامل النسخ Olig2 ونموذج عنصر تحكم التسلسل الفائق لإنتاج 50 إقران في نهاية دورة ما يلي التسلسل. سوف تحسين معدلات تعيين أطوال قراءة وتقليل احتمال رسم خرائط متعددة، على حساب تكاليف التسلسل. مع 50 شركة بريتيش بتروليوم seq رقاقة إقران نهاية تسلسل المكتبات، عادة ما يتم تحقيق نتائج طيبة.
وبعد تقييم مراقبة الجودة الأولية الخام على ما يلي والتشذيب من محولات وزائدة زوج قاعدي منخفض الجودة، يصور المؤامرات مراقبة الجودة في الشكل 4. ينبغي أن يقرأ قلصت نوعية قاعدة أكبر من 30، لا تسلسل محول، ويكون معدل تكرار منخفض (الشكل 4 باء-د). يقرأ نوعية جيدة قلص سيتم زيادة المعدل الإجمالي للمحاذاة. معلمات أخرى مثل محتوى GC هي أيضا مهمة وينبغي النظر للتشذيب.
حالما يتم محاذاة العينات التسلسل، من الضروري التحقق من عمق التسلسل. ومن المعروف أن عدد القمم يسمى سيزداد مع عمق تسلسل أعلى حيث ستصبح مواقع ضعيفة إحصائيا أكثر من21. إجراء تحليل تشبع مطلوب لتحديد عمق تسلسل كافية لكل عامل النسخ المحددة المستخدمة، على حساب الوقت والميزانية. وقد اقترح الكونسورتيوم ترميز فيما يتعلق بعينات الثدييات عمق تسلسل إلى توافق في آراء لربط عامل النسخ: تعيين الحد أدنى من 10 مليون فريد ما يلي: لكل واحد من اثنين على الأقل البيولوجية يتطابق22. بمخطط قراءة حساب عدد القراءات فريد تم تعيينه والمعدل العام للمحاذاة. ويرد مثال لمقاييس رسم الخرائط جيدة في الشكل 5A. الانحياز ما يلي: ينبغي أن يتم تعيينها إلى مواقع الجينوم متميزة، مما يدل تعقيد مكتبة كافية، كما يشار إلى العلامة كلوناليتي. اتحاد ترميز تشير إلى أن 80 في المائة على الأقل من 10 مليون من الانحياز ما يلي: ينبغي أن يتم تعيينها إلى مختلف مناطق الجينوم22. ويبين الشكل 5B كلوناليتي علامة كافية فيه أكثر من 90% من ما يلي يتم تعيينها إلى موقع جينومي واحد فقط. عموما تحدث مكتبات قليلة التعقيد عندما يتم الحصول على الحمض النووي لا يكفي، وال [بكر] تضخيم أجزاء هي متسلسلة مرارا وتكرارا. مكتبة تعقد منخفضة سوف تحقق معدل الكشف عن ذروة عالية كاذبة.
عند استخدام البيانات seq رقاقة نهاية الاقتران، ربط الأجزاء حول عامل النسخ مع مسافة معينة من الانفصال. إقران نهاية تسلسل سيسمح بإجراء تقدير أكثر دقة لطول يعني جزء مما أسفر عن إجراء تقدير أفضل للمناطق الجينية التي وقعت فيها أكثر إلزاماً. وارسم العلاقة حبلا يصور ذروة تخصيب المقابلة على طول جزء الغالبة. وكما لاحظت في الشكل 5، طول الجزء المحسوب هو 130 bp بينما طول القراءة هو 50 بي بي. رقاقة seq dataset أطول من طول القراءة فيها طول جزء يدل على جودة عالية16.
إخراج الدعوة الذروة قائمة بالجينوم المناطق المحتمل أن تكون ملزمة بأن عامل النسخ (أو في المجمع). يتم تضمين قائمة مناطق الجينوم أو قمم في ملف "سرير" التي يمكن عرضها في مستعرض جينوم. لكل ذروة، يحتوي هذا الملف على معرفاً ذروة، موقع جينومي قمة الذروة، والجبهة الديمقراطية الثورية ك-log10 (q-القيمة). على قمم المخصب بدرجة كبيرة تلك مع أعلى إضعاف-الإثراء وأهمية القياسات. ويرد مثال لملف الإخراج الذروة في الشكل 6A. بعد تحديد كبير قمم قمم استخدام العتبات المخصصة وتصفية قمم ضمن القائمة السوداء لترميز23، وتحديد داخل منطقة المروج الجينات (5 كيلو بايت الجينات المنبع وكامل الجسم)، ملف "نتأمل" مفيد لعرض قمم في الجينوم المستعرض. معظم المناطق ذروة المخصب لديها احتمال أعلى لربط عامل النسخ. من المهم أن تؤكد وجود ذروة في المناطق التنظيمية عامل النسخ المعروفة وكذلك غياب الذروة في المناطق التي لا يحتمل فيها النسخ عامل ملزم. الشكل 6B -E يعرض أمثلة من مناطق الجينات مع أو بدون تخصيب الذروة، فضلا عن مواقعها فيما يتعلق بمناطق المروج ترميز.
في السيليكون أساليب مكملة لتجربة رقاقة seq هي فكرة إثراء التحليل و حيثياته فكرة البحث. إذ لم تدرس ربط Olig2 في المعاونة قبل، Olig2 رقاقة-seq المستمدة قمم في الخلايا العصبية الحركية السلف واستخدمت الخلايا الجذعية الجنينية حيثياته فكرة تحديد4،24. Olig2 دي نوفو حددت زخارف أضيفت إلى قاعدة البيانات من فكرة ترميز شامل25 وأجرى التحليل تخصيب عزر. حددت التخصيب العالي حيثياته زخارف OLIG2 وتم العثور على عامل النسخ المعروفة (HDAC2 و SP1، FOXP1، NR3C1، NFKB2/4، SMAD2/3، PAX5 و ASCL1) زخارف في قمم رقاقة seq PDGFRα تنقية الخلايا. إثراء من زخارف حيثياته حددت 30 مع قيمة ه اكتشفت < 0.05. يبين الشكل 7 زخارف حيثياته التعرف على اثنين من كبار من Olig2. تم العثور على هذه الزخارف Olig2 دي نوفو حددت اثنين في > الحصول على 60% قمم seq رقاقة من الخلايا PDGFRα تنقيته، وبالإضافة إلى ذلك للزخارف المعروفة.
رقم 1: نظرة عامة على سير عمل البروتوكول. PDGFRα إيجابية المعاونة كانت معزولة من العقول الماوس بعد الولادة وتعرضوا لرقاقة Olig2 التجربة. واستخدمت في سرع شظايا من الحمض النووي لإعداد مكتبة شرائح. وبعد تقييم لنوعية المكتبة، استخدمت عينات للتسلسل. تم تحليل مجموعات البيانات، وحددت ذروات، والتي تشير إلى مواقع الربط Olig2 المحتملة في حزب مؤتمر اودوا الشعبي تنقية الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تقييم نقاء إيمونوبانيد المعاونة قبكر وإيمونوستينينج- كانت تبذر (A) PDGFRα جسم إيمونوبانيد الخلايا وإيمونوستينينج أجرى باستخدام النسب OPC العلامة في NG2 جسم. الأزرق: DAPI، الأخضر و: NG2. شريط المقياس = 10 ميكرون. (ب) تم تقييم مستوى التعبير النسبية العصبية علامة Tuj1 في المعاونة المنقي (PDGFRα +)، وفي خلايا الدماغ منفصلان (ميكس). وكان تعيين التعبير Tuj1 في خلايا الدماغ ينتابها إلى 1. وتم تقييم العلامة (ج) مستوى التعبير النسبي astrocyte توصيني في المعاونة المنقي (PDGFRα +)، وفي خلايا الدماغ منفصلان (ميكس). وكان تعيين التعبير توصيني في خلايا الدماغ منفصلان إلى 1. وتم تقييم (د) مستوى التعبير النسبي OPC العلامة PDGFRα في المعاونة المنقي (PDGFRα +)، وفي خلايا الدماغ منفصلان (ميكس). وكان تعيين التعبير PDGFRα في خلايا الدماغ ينتابها إلى 1. وتم تقييم موج (ه) مستوى التعبير النسبي ميليناتينج ماركر oligodendrocytes ناضجة في المعاونة المنقي (PDGFRα +)، وفي خلايا الدماغ منفصلان (ميكس). وكان تعيين التعبير موج في خلايا الدماغ منفصلان إلى 1. وجرى تقييم Mbp (و) مستوى التعبير النسبي ميليناتينج ماركر oligodendrocytes ناضجة في المعاونة المنقي (PDGFRα +)، وفي خلايا الدماغ منفصلان (ميكس). وكان تعيين التعبير Mbp في خلايا الدماغ منفصلان إلى 1. وتم تقييم الخلايا (ز) مستوى التعبير النسبي microglia علامة Iba1 في المعاونة المنقي (PDGFRα +) وفي الدماغ منفصلان (ميكس). وكان تعيين التعبير Iba1 في خلايا الدماغ ينتابها إلى 1. وتمثل البيانات في ز ب ثلاث تجارب وأشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ القياسي. T-اختبار تحليل * P < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: اليكتروفيروجرام مثال مكتبة من شرائح منخفضة-خلية Olig2. بعد اختيار حجم مزدوجة، وقد تم تحليل نوعية مكتبة شرائح Olig2 بجهاز التفريد الشعرية رقاقة موائع جزيئية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: نتائج مراقبة الجودة ممثلة لعينة seq رقاقة خلية منخفض طول قراءة bp 50- (أ) جدول موجز يصور العدد الإجمالي لما يلي، وعدد ما يلي: نوعية رديئة وطول التسلسل، وعموما GC المحتوى. (ب) المؤامرة التي تشير إلى توزيع النقاط النوعية الأساسية في مواقع مختلفة في على ما يلي. (ج) ارسم عرض المحتوى المحول المحتملة في المواقف المختلفة في على ما يلي. (د) خط المؤامرة التي تشير إلى النسبة المئوية لتكرار تسلسل. غالبية ما يلي: تنشأ من تسلسلات التي تحدث فقط مرة واحدة داخل المكتبة، ويبين ذلك معدل تكرار منخفض أو مكتبة عالية التعقيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: مقاييس الجودة التي تم الحصول عليها قبل ذروة الاتصال: bowtie2 محاذاة المقاييس، حبلا عبر الارتباط، والوسم كلوناليتي. (أ) الحصول على قياسات المحاذاة من مخطط القراءة. أهم مقاييس هي عدد أزواج قراءة فريد تم تعيينه، وأشارت إلى "محاذاة مرة كونكوردانتلي بالضبط 1"، ومعدل الاتساق العام. (ب) الرسم البياني عرض كلوناليتي العلامة. أشرطة تشير إلى النسبة المئوية من المناصب الجينوم حيث تم العثور على العلامات. (ج) مثال على مؤامرة عبر الارتباط يشير إلى بيانات ذات نوعية جيدة. الخطوط الحمراء تصور طول قراءة 50 بت في الثانية وطول الجزء الغالب 130 بت في الثانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: المناطق ذروة seq رقاقة وآراء مستعرض الجينوم قمم seq شريحة كبيرة في مواقع مختلفة الجينوم. مثال (A) المناطق الذروة المحددة مع المتصل الذروة. (ب) كبير رقاقة-seq قمم وجدت في جثة جين Cspg4، جين علامة OPC معروفة. (ب) تم العثور على قمم رقاقة seq لا يوجد في مناطق المروج أو داخل هيئات الجينات الجينات Mbp، علامة ل oligodendrocytes ناضجة، Tubb3 (ج)، علامة خلية العصبية، أو (د) توصيني، علامة خلية من أستروسيتيس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7: التخصيب زخارف حيثياته وحدد من Olig2 الموجودة في قمم رقاقة-seq PDGFRα-Olig2- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
S1 الشكل: إعداد مجموعات البيانات رقاقة seq. (أ) تعريف بنية الدليل. (ب) حساب الخام قراءة مقاييس مراقبة الجودة. (ج) اقتطاع من يقرأ. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
S2 الشكل: المواءمة بين ما يلي للجينوم مرجع. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
S3 الرقم: مراقبة الجودة من القراءات المنحازة، إلى عنوان حبلا عبر الارتباط وتحديد العلامة كلوناليتي. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
S4 الشكل: استدعاء الذروة. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
S5 الشكل: شرح قمم كبيرة- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
S6 الشكل: تحويل تنسيق الملف بيدجراف لنتأمل للتصور الذروة في المتصفح المجين. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
S7 الشكل: حيثياته فكرة البحث، وفكرة تخصيب اليورانيوم- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
S8 الرقم: فلووتشارت وصف تحليل seq رقاقة البيانات المعلوماتية الحيوية- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
شبكات تنظيم الجينات الثدييات معقدة جداً. رقاقة-seq وسيلة قوية للتحقيق في تفاعلات البروتين على نطاق الجينوم الحمض النووي. ويشمل هذا البروتوكول كيفية أداء رقاقة-seq Olig2 باستخدام عدد قليل من المعاونة المنقي من العقول الماوس (منخفضة كخلايا 20 ألف كل رد فعل). الخطوة الرئيسية الأولى لهذا البروتوكول هو تنقية المعاونة من الماوس العقول التي إيمونوبانينج مع الأجسام المضادة PDGFRα. للتحديد الإيجابي للمعاونة مع لوحات PDGFRα المغلفة، المغلفة المعاونة ربط ضعيفة في كثير من الأحيان إلى PDGFRα لوحات. وحتى بعد يغسل عدة، لا تزال هناك بعض الخلايا غير ملتصقة اليسار. من المهم التحقق من الخلايا غير ملتصقة بعد كل د-برنامج تلفزيوني تغسل تحت مجهر. إذا كان أكثر د-برنامج تلفزيوني الغسيل لا يساعد على الحد من عدد الخلايا غير ملتصقة، حان الوقت لجمع الخلايا المحددة، حيث يغسل الزائد قد إزاحة المعاونة المرفقة وتقليل عائد الخلايا المنقي. ومع ذلك، قد يؤدي يغسل غير كافية التلوث لأنواع أخرى من خلايا الدماغ. لذلك، كل مرة بعد عزلة، من الضروري تقييم نقاء المعاونة معزولة عن طريق إيمونوستينينج مع qPCR NG2 ماركر المعاونة للتعبير عن الجينات المعروفة من نوع الخلية المحددة مثل Tuj1 للخلايا العصبية، توصيني أستروسيتيس، PDGFRα للمعاونة، Iba1 microglia، و موج و MBP ل oligodendrocytes ميليناتينج ناضجة. كما هو مبين في الشكل 2، نتيجة إيمونوستينينج يشير إلى أن غالبية الخلايا المنقي إيجابية لتلطيخ في NG2. وبالإضافة إلى ذلك، بعض علامات الكلاسيكية من نوع الخلية المحددة للخلايا العصبية، أستروسيتيس، ميكروجليا، وميليناتينج ناضجة oligodendrocytes المعرض لا يمكن الكشف عنها أو الغاية وتدني مستويات التعبير في المنقي المعاونة بالمقارنة مع الخليط خلية الدماغ أونبوريفيد. PDGFRα يسلك التعبير عالية المستوى في المنقي المعاونة بالمقارنة إلى خليط خلايا المخ أونبوريفيد. باستخدام أسلوب إيمونوبانينج، microglia، تقلص إلى حد كبير في المعاونة المنقي بالمقارنة إلى خليط خلايا المخ أونبوريفيد، ولكن توجد كمية صغيرة من التلوث. هذه الملاحظة ويتسق مع المنشورات السابقة قبل الآخرين7،،من826. بالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع التقارير المنشورة سابقا، يتم استخدام مجموعة متاحة تجارياً في هذا البروتوكول للانفصال موحدة وفعالة وملائمة لانسجة المخ في تعليق خلية واحدة.
بعد العابرة للربط للمعاونة المنقي، يجب غسلها الخلايا cross-linked مع المثلج حبس الحل وأن تنفذ الخطوات رقاقة المتبقية في 4 درجات مئوية، خلاف ذلك الجسم لا يمكن أن يعجل الحمض النووي بشكل صحيح.
الخطوة الرئيسية التالية في هذا البروتوكول إعداد المكتبة. [بكر] تضخيم رقاقة مواد استخدمت لبناء مكتبة. عدد دورات PCR لإعداد مكتبة يعتمد على مقدار ابتداء من الحمض النووي. ويتطلب إعداد مكتبة جيدة دقيقة التحديد الكمي لإدخال كمية الحمض النووي. دورات بكر كثيرة جداً أو قليلة جداً يمكن أن تؤثر تركيز المكتبة فضلا عن التعقيد، مما يؤدي إلى التحف PCR.
فإنه يمثل تحديا لبناء مكتبة شرائح seq عند استخدام عدد محدود من الخلايا إيمونوبريسيبيتيشن27. يتطلب بروتوكول رقاقة القياسية المستخدمة سابقا 10 نانوغرام إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي لرقاقة seq المكتبة إعداد1،28. ومع ذلك، ينشئ البروتوكول الموصوفة هنا عادة 2 نانوغرام إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي بجسم Olig2 من 20,000 المعاونة. الحمض النووي يستخدم لإعداد المكتبة seq شريحة باستخدام أسلوب إضافة محول خطوة واحدة، الذي يتيح زيادة حساسية السماح بيكوغرامات إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي تضخيم. من خلال الجمع بين مجموعات تجارية، يوفر هذا البروتوكول حلاً عمليا لأداء رقاقة seq لعوامل النسخي استناداً إلى عدد صغير من الخلايا.
الأهم من ذلك، الخلية منخفض seq رقاقة بروتوكول وصف ينطبق على رقاقة-Seq لعوامل النسخ الأخرى في الخلايا الأولية أو خلية نادرة السكان، فضلا عن. الأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول بحاجة إلى التحقق من صحتها تجريبيا لتكون محددة بالتجربة الملكية الفكرية أولاً. الخاصة بعدم ربط الأجسام المضادة سيؤدي إلى نتائج سيئة. بالإضافة إلى ذلك، فمن الأفضل القيام بهذه التجربة خلية منخفض رقاقة seq في الخلايا التي تحتوي على مستوى عال تعبير عامل النسخ للفائدة.
لتحليل البيانات، وقد يكون تحديا للبت فيها القيم لاستخدامها كتصفية انقطاع بعد استدعاء الذروة. حسب أهداف التحليل، يمكن استخدام معلمات صرامة أو أكثر استرخاء. عموما، يتم استخدام مزيج من حظيرة لتخصيب وقيمة p أو فرانكلين روزفلت. إذا كانت معروفة سابقا في بعض مواقع الربط عامل النسخ قيد الدراسة، وهذا قد يساعد في تحديد عتبات التصفية. النسخ عامل ربط قواعد بيانات الموقع المستمدة من تجارب seq رقاقة متاحة للجمهور في خطوط الخلايا المختلفة وظروف المترجمة29،30. يمكن للمرء البحث عن جينات والتحقق إذا تم العثور على مواقع الربط عامل النسخ سابقا. ومع ذلك، من المهم أن تكون على علم أن مواقع الربط عامل النسخ تختلف باختلاف أنواع الخلايا والظروف.
في السيليكون أساليب مكملة لتجربة رقاقة seq هي فكرة إثراء التحليل و حيثياته فكرة البحث باستخدام رقاقة ميمي20 أو برامج مماثلة. يتطلب البحث عن فكرة شاملة معروفة و حيثياته المستمدة عزر قاعدة البيانات مثل الزخارف ترميز25 أو قاعدة بيانات هوكوموكو31. هوكوموكو قاعدة زخارف اكتشفت من تجارب الماوس seq رقاقة والبشرية المتاحة للجمهور. إذا زخارف للبروتين أسيد غير معروفة، يمكن أن تكشف عن أنماط تسلسل المتكررة في جزء كبير من القمم البحث الحافز حيثياته كزخارف جديدة. قد يكون الإجراء اندماجي المحتملة لعوامل النسخ كشف النقاب عنها عندما يتم أيضا العثور على زخارف عوامل النسخ الأخرى إثراء في قمم الناتجة.
مناطق ذروة المخصب قد يكون تجريبيا التحقق من صحة باستخدام لونين خلايا متحولة أو الضربة القاضية كعناصر تحكم. أداء رقاقة seq استخدام الخلايا عدم التعبير عن عامل النسخ المستخدمة لتحديد قمم إيجابية كاذبة، كما تتم الإشارة إليها "قمم الوهمية"32. وينبغي أن تخرج المغلوطة.
من المثير أيضا مقارنة قمم seq رقاقة الناتجة مع البيانات ترانسكريبتوميك. وقورنت قمم رقاقة PDGFRα-Olig2-seq مع التعبير عن الجينات في المعاونة من منشور سابق18. هذه الاستراتيجية قد تكون محدودة حيث يمكن التحكم في الجينات المعرب عنها في المعاونة بآليات خلاف Olig2 النسخ عامل ملزم. بالإضافة إلى ذلك، قد ربط عامل النسخ Olig2 للمنطقة التنظيمية للجينات ولكن الجينات قد يكون مستوى التعبير الجيني منخفضة بسبب الآليات المحتملة المثبطة أو عدم المشاركة العوامل اللازمة للنسخ الجيني.
رقاقة-seq أسلوب يستخدم لتحديد مواقع ربط الحمض النووي على نطاق الجينوم عوامل النسخ وغيرها من البروتينات. ومع ذلك، من خلال تحليل للتواجد المشترك لعوامل النسخ، وجد الباحثون أن عوامل النسخ تميل إلى ربط مع غيرها من البروتينات التي تشكل وحدات كوريجولاتوري33. وهذا يعني بعض الروابط بين العوامل النسخي وكشفت عنها seq رقاقة الحمض النووي غير المباشرة والموصولة بالبروتينات الأخرى. ولذلك، لتحقيق نتائج ذات مغزى أكثر الباحثين أن تنظر دراسة عامل النسخ أكثر من واحد في وقت واحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
جقو XD، ركد و YY كانت تدعمها المنح المقدمة من المعاهد الوطنية من NS088353 R01 على الصحة؛ منح المعهد الوطني للصحة 1R21AR071583-01؛ مؤسسة هيرمان اوغيلفي الصندوق-النصب التذكاري ستمان؛ مبادرة المخ أوثيالث وكتسا UL1 TR000371؛ ومنحة من جامعة تكساس نظام علم الأعصاب، ومعهد بحوث الأعصاب (منحة #362469).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
- Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669 (2015).
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562 (2007).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
- Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
- Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
- Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
- Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
- Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
- Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).
