Summary
Her presenterer vi en protokoll som er utformet for å analysere genomet hele binding av oligodendrocyte transkripsjon faktor 2 (Olig2) i akutt renset hjernen oligodendrocyte precursor celler (OPCs) ved å utføre lav-cellers chromatin immunoprecipitation (ChIP) , bibliotek forberedelse, høy gjennomstrømming sekvensering og bioinformatic dataanalyse.
Abstract
I pattedyrceller, er gene transkripsjon regulert i en celle type bestemt måte av transcriptional faktorer samhandling med genomisk DNA. Slektslinje kundespesifikk transkripsjonsfaktorer anses å spille viktige roller i cellen spesifikasjon og differensiering under utvikling. ChIP kombinert med høy gjennomstrømming DNA sekvensering (ChIP-seq) er mye brukt analysere genomet hele bindende områder transkripsjonsfaktorer (eller dets tilknyttede komplekse) genomisk DNA. Men kreves et stort antall celler for en standard ChIP reaksjon, som gjør det vanskelig å studere begrenset antall isolerte primære celler eller sjeldne celle populasjoner. For å forstå oligodendrocyte slektslinje kundespesifikk transkripsjon regulatoriske mekanisme faktor Olig2 i akutt renset musen OPCs, en detaljert metode med ChIP-seq for å identifisere webområdene genomet hele binding av Olig2 (eller Olig2 komplekse) vises. Først protokollen forklarer hvordan å rense blodplater-avledet vekst faktor reseptor alfa (PDGFRα) positive OPCs fra musen hjerner. Deretter Olig2 antistoff mediert ChIP og biblioteket konstruksjon utføres. Den siste delen beskriver bioinformatic programvare og prosedyrer brukes i Olig2 ChIP-seq analyser. I sammendraget rapporterer dette papiret en metode for å analysere genomet hele bindingene av transcriptional faktor Olig2 i akutt renset hjernen OPCs.
Introduction
Det er viktig å studere den protein (eller protein kompleks) DNA bindinger og epigenetic merkene for å bygge transcriptional regulatoriske nettverk involvert i ulike biologiske prosesser. Spesielt kan bindingene for transkripsjonsfaktorer til genomisk DNA spille en viktig rolle i genet regulering, celledifferensiering og vev-utvikling. Et kraftig verktøy for å studere transcriptional regulering og epigenetic mekanismer er chromatin immunoprecipitation (ChIP). På grunn av de raske fremskritt innen neste generasjons sekvensering teknologi brukes ChIP kombinert med høy gjennomstrømming DNA sekvensering (ChIP-seq) for analyser av protein-DNA bindinger og epigenetic merker1. En standardprotokoll for ChIP-seq krever imidlertid 20 millioner celler per reaksjon, som gjør bruk av denne teknikken vanskelig når cellen er begrenset, for eksempel isolert primære celler og sjeldne celle populasjoner.
Oligodendrocyte avstamning celler inkludert oligodendrocyte precursor celler (OPCs) og oligodendrocytes er vidt distribuert i hele hjernen og er avgjørende for utvikling og funksjon av hjernen. Som en forløper celler er OPCs dugelig av både selvtillit fornyelse og differensiering. OPCs ikke bare tjene som progenitors for oligodendrocytes men også spille en viktig rolle i utbredelsen av neuronal signalering ved å kommunisere med andre typer hjernen cellene2. Tidligere studier har antydet at oligodendrocyte utvikling er regulert av slektslinje kundespesifikk transkripsjonsfaktorer som Olig2 og Sox103,4. Disse transkripsjonsfaktorer fant binde til arrangøren eller enhancer regionene noen avgjørende gener å påvirke deres uttrykk under oligodendrocyte spesifikasjon og differensiering. Men er det utfordrende å identifisere DNA binding av protein eller protein kompleks interesse i akutt renset primære OPCs med et svært begrenset antall celler.
Denne protokollen beskriver hvordan systematisk undersøke genomisk DNA immunoprecipitated av Olig2 i renset musen OPCs på genomet-bred skala ved hjelp av ChIP-seq teknikk. OPCs fra musen hjernen var akutt renset ved immunopanning og brukes i en ChIP eksperiment uten spredning i vitro. Et begrenset antall OPCs kan fås ved immunopanning og er utilstrekkelig for standard ChIP-seq eksperimenter. Her, er en lav-celle ChIP-seq protokoll med så lite som 20 tusen celler per ChIP reaksjon for transkripsjonsfaktorer beskrevet. I korthet, var krysskoblet celler lysed og sonicated av en sonication-enhet for å skråstille chromatin. Skråstilte chromatin ble inkubert med Olig2 antistoffer som protein A-belagt perler for å utløse Olig2 antistoff bundet genomisk DNA. Etter elueringsrør fra protein A-belagt perler og omvendt cross-linking, var genomisk DNA påskyndet av Olig2 antistoff renset av fenol-kloroform utvinning. Det resulterende produktet var kvantifisert og utsatt for T tailing, primer annealing mal bytte og utvidelse, adaptere og forsterkning, biblioteket størrelse utvalg og rensing trinnene for ChIP-seq biblioteket konstruksjon.
Etter sekvensering, ble kvaliteten på den rå lest fra både prøven med Olig2 transkripsjon faktor antistoff og kontroll prøven analysert. Lav kvalitet base parene og kortet inneholder lese fragmenter var trimmet. Neste, trimmet leser ble justert til musen referanse genomet. Genomic regionene som var betydelig beriket for ChIP leser, sammenlignet med kontroll prøven, ble oppdaget som topper. Betydelig topper, representerer potensielle transkripsjon faktor bindende områder, filtrert og visualisert i en genome leser.
Spesielt kan metoden beskrevet i denne protokollen grovt brukes for ChIP-seq av andre transkripsjonsfaktorer med en celle type begrenset tall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr behandling og eksperimentelle protokoller ble utført i henhold til guiden og bruk av forsøksdyr og godkjent av institusjonelle Biosafety komiteen og dyr velferd komiteen ved University of Texas Health Science Center på Houston.
1. rensing av PDGFRα Positive Oligodendrocyte avstamning celler fra musen hjernen (endret fra tidligere beskrevet immunopanning protokoller5,6,7)
-
Utarbeidelse av en immunopanning plate for PDGFRα positive celleutvalget og 2 plater uttømming av endotelceller og microglia.
Merk: Vær oppmerksom på at Petri retter, men ikke cellen kultur retter fungerer for immunopanning eksperimentet. Hvis renset cellene vil bli brukt til dyrking, må immunopanning trinnene utføres i biosikkerhet skap- Coat en 10 cm Petri plate med 30 µL geit anti-rotte IgG i 10 mL av pH 9,5, 50 mM Tris-HCl overnatting på 4 ° C. Agitere plate å sikre at overflater av platene er jevnt og helt dekket av belegg løsningen.
- Klargjør PDGFRα antistoff løsning ved utvannende 40 µL rotte anti-PDGFRα antistoff med 12 mL Dulbeccos fosfat-bufret saltoppløsning (DPBS) som inneholder 0,2% BSA.
- Etter 3 vasker av IgG belagt plate med 10 mL ruge 1 x DPBS hver, IgG-belagt plate med PDGFRα antistoffer løsning ved romtemperatur 4 h.
- Vask rotte anti-PDGFRα antistoff belagt platen 3 ganger med 10 mL 1 x DPBS. Forsiktig legge DPBS løsning langs siden platen og ikke forstyrr belagt overflater.
- Coat 2 nye 15 cm Petri plater for uttømming av endotelceller og microglia med 20 mL DPBS som inneholder 2.3 µg/mL Banderiaea simplicifolia Lektiner 1 (BSL-1) for 2T.
- Vask av BSL-1 belagt plater 3 ganger med 20 mL 1 x DPBS. Forsiktig legge DPBS løsning langs siden platene og ikke forstyrr belagt overflater.
-
Rensing av PDGFRα positive oligodendrocyte avstamning cellene endres fra tidligere publiserte metoder6 , 7 , 8.
- Dissekere kortikale vev fra 2 postnatal dag 7 (P7) musen hjerner ifølge tidligere publiserte protokoller5,6.
- Distansere vev for å generere en enkeltcelle hjuloppheng med nevrale vev dissosiasjon Kit (P) etter detaljert produsentens instruksjoner.
- Kort, skjær dissekert kortikale vev i biter med en skalpell og gitt dem til enzymatisk fordøyelsen på 37 ° C. Etter fordøyelsen, manuelt distansere bitene med brann-polert glass Pasteur Pipetter i en enkeltcelle suspensjon.
- Sentrifuge encellede suspensjon på 300 x g i 10 min ved romtemperatur og suspendere celle pellets med 15 mL immunopanning buffer (immunopanning buffer er DPBS med 0,02% BSA og 5 µg/mL insulin).
- Inkuber encellede suspensjon fra 2 mus hjerner sekvensielt på 2 BSL-1 belagt plater i 15 min ved romtemperatur med mild agitasjon av platen hver 5 minutter for å sikre en bedre uttømming av microglia og endotelceller.
- Forsiktig swirl platen for å samle inn ikke-tilhenger cellene i cellen suspensjon og ruge dem på rotte-PDGFRα antistoff platen i 45 min ved romtemperatur.
- Etter inkubasjon av cellen suspensjon på rotte-PDGFRα antistoff plate, forsiktig snurr den å samle celle suspensjon, og skyll platen 8 ganger med DPBS å kvitte seg med ikke-tilhenger celler. Forsiktig legge vaskeløsning langs siden platen og agitere platen flere ganger for å kvitte seg med ikke-tilhenger celler.
- Koble cellene fra rotte-PDGFRα antistoff belagt platen med en 4 mL av cellen avdeling løsning behandling for 10 min på 37 ° C. Riste plate å dislodge tilhenger celler.
- Samle de renset OPCs med sentrifugering 300 x g ved romtemperatur, suspendere celle pellets med 2 mL OPC celle kultur medium og telle celler ved hjelp av trypan blå og en hemocytometer (500 mL celle kultur medium er DMEM/F12 medium som inneholder 5 mL penicillin-streptomycin løsning (P/S), 5 mL N2, 10 mL B27, 5 µg/mL insulin, 0,1% BSA, 20 ng/mL bFGF og 10 ng/mL PDGFRα).
-
Validering av renhet av OPCs etter immunopanning.
- For å vurdere anriking av OPCs etter immunopanning, bruk noen av de renset OPCs for RNA ekstraksjon med en guanidium thiocyanate basert utvinning i henhold til produsentens instruksjoner.
- Utfør qRT PCR med fluorescerende grønne fargestoff master mix etter anriking av PDGFRα uttrykk i renset OPCs mot dissosiert hjerneceller ifølge tidligere publisert materiale4.
- I tillegg frø noen renset OPCs i Poly-D-Lysine belagt 24 godt plater for immunostaining med anti-NG2 chondroitin sulfate proteoglycan (NG2) antistoff som tidligere publisert materiale9.
2. lav-cell ChIP forberedelse og ChIP biblioteket konstruksjon for høy gjennomstrømming sekvensering
-
Olig2 lav-cell ChIP forberedelse med et kommersielt tilgjengelig sonication system og en kommersielt tilgjengelig lav celle nummer ChIP kit (se tabell for materiale) ved å følge detaljerte standard prosedyrer fra produsentens instruksjoner.
- Etter frakobling fra rotte anti-PDGFRα sett antistoff plate og cellen teller med trypan blå og en hemocytometer 20.000 renset OPCs i 1 mL OPC celle kultur medium for hver brikke reaksjon.
- Legge til 27 µL av 36,5% formaldehyd å fikse celle suspensjon for 10 min ved romtemperatur.
Forsiktig: Vær oppmerksom på at formaldehyd må brukes i den kjemiske avtrekksvifte av sikkerhetsgrunner. - Stopp DNA-protein cross-linking med 50 µL 2.5 M glysin for 5 min ved romtemperatur.
Merk: Alle trinnene må utføres på isen eller i 4 ° C kjølerom fra dette punktet. - Vask krysskoblet celle pellets med 1 mL av iskalde Hanks' balansert Salt løsning (HBSS) med protease hemmer cocktail og få celler pelleted av en pre-avkjølt sentrifuge 300 x g på 4 ° C.
- Lyse celle pellet i 25 µL fullføre lyseringsbuffer for 5 min på is.
Merk: Agitere røret å suspendere cellene i lyseringsbuffer. - Supplere cellen lysate med 75 µL iskald HBSS med protease hemmer cocktail og skjær chromatin i celle lysate av pre avkjølt sonication system med 5 sykluser av 30 s på og 30 s av programmet. Alltid sonicate 6 rør sammen og sikre balanse rør inneholder 100 µL vann.
- Etter klipping, sentrifuge 14.000 x g i 10 min 4 ° C og samle nedbryting i et nytt rør etter sentrifugering.
- Fortynne 100 µL av skråstilte chromatin med lik volumet av iskalde komplett ChIP Buffer med den protease inhibitor.
- Lagre 20 µL av utvannet skråstilte chromatin som Input kontroll prøven.
Merk: Input kontroll prøven kreves også som sammenligning til Olig2 immunoprecipitated prøve å identifisere Olig2 antistoff immunoprecipitated DNA. - Legge til 1 µL av kanin anti-olig2 antistoff 180 µL av den utvannet skåret chromatin og ruge reaksjon røret på et roterende hjul på 40 rpm for 16 timer på 4 ° C.
Merk: Utføre dette trinnet i et kaldt rom. - For hver brikke reaksjon, vask 11 µL magnetiske protein A-belagt perler med 55 µL perler vaskebuffer og sette perlen pellets i 11 µL av perle vaskebuffer etter 2 vasker.
Merk: Utføre dette trinnet i et kaldt rom. - For hver brikke reaksjon, legge 10 µL av pre vasket Protein A-belagt perler til ChIP reaksjon tube. Utføre dette trinnet i et kaldt rom.
- Inkuber ChIP reaksjon røret ved 4 ° C i en annen 2 timer på et roterende hjul.
- Legge ChIP reaksjon røret på magnetiske stativet for 1 min.
Merk: Utføre dette trinnet i et kaldt rom. - Fjern nedbryting og ikke løsne perle pellets.
- Vask perle pellets med 100 µL for hver av 4 vaskebuffere for 4 min til et roterende hjul på 4 ° C.
- Etter vasker, legge til 200 µL av elueringsbufferen perle pellets og ruge ChIP reaksjon røret på 65 ° C 4 h å reversere krysskobling protein-DNA.
- Dessuten legge til 180 µL av elueringsbufferen 20 µL Input kontroll prøven og ruge på 65 ° C 4 h å reversere krysskobling protein-DNA også.
- Legg 200 µL 25:24:1 (v/v) blanding av fenol, kloroform og isoamyl alkohol hver ChIP reaksjon rør.
- Vortex kraftig for 1 min og sentrifuger 13.000 x g i 15 min ved romtemperatur. Overføre den øvre fasen til en ny tube.
- Legge til 40 µL 3 M natrium acetate løsning, 1000 µL av 100% etanol og 2 µL av glykogen precipitant covalently knyttet til en blå farge til hver ChIP reaksjon tube overnatting på 20 ° C.
- Sentrifuge 13.000 x g for 20 min på 4 ° C.
- Forkaste nedbryting, vask med 500 µL kaldt 70% etanol og sentrifuge 13.000 x g for 20 min på 4 ° C.
- Forkast nedbryting, holde pellets luften tørr på 10 min og oppløse pellets med 50 µL vann.
-
ChIP biblioteket konstruksjon for høy gjennomstrømming sekvensering
- Rengjør og konsentrere ChIP DNA med en opprydding kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Kvantifisere ChIP prøven av en pico-green i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bruke en ChIP-seq kit for T tailing, replikering og tailing, mal bytte og utvidelse, adaptere og forsterkning, biblioteket størrelse utvalg og rensing i henhold til produsentens instruksjoner.
- Etter denaturering av dsDNA, dephosphorylate 3 slutten av ssDNA av reker alkalisk fosfatase og legge en poly (T) hale å ssDNA av terminal deoxynucleotidyl transferase.
- Anneal DNA Poly (dA) Primer i malen ssDNA for utryddelse og mal bytte.
- Etter mal bytte, forsterke ChIP-seq biblioteket av PCR med revers primerne for indeksering.
- Velg PCR forsterket ChIP-seq bibliotek med fragmenter alt 250 til 500 bp av spinn perler av alternativ 2 for dobbel størrelse utvalg.
- Undersøke kvaliteten på valgte ChIP-seq biblioteket bruker en microfluidic chip-kapillære geleelektroforese enhet.
3. dataanalyse
- Forberede katalogstruktur.
- Opprette en mappe for å utføre ChIP-seq dataanalyse. I den nylig opprettede mappen, oppretter du seks undermapper med følgende navn: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis og rapporter.
- Klargjøre data og utføre kvalitetskontroll analyse av rå sekvens databehandling.
- Gå til mappen "raw.files" og nedlasting ChIP-seq datafilene.
- Kontroller filnavnene. Hvis sekvensering var sammen-end, det blir 4 filer (to for behandling) og to for inndata med lignende base navn: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq og PDGFRα_input.read2.fastq. Hvis filnavnene er forskjellige, gi dem ved hjelp av kommandoen "mv".
- Flytt mappen "fastqc.output".
- Få kvalitetskontroll beregninger fra den rå lest bruker en fastq fil kvalitetskontroll programvare10. Bruk kommandoen i Figur S1A kjøre kvalitetskontroll prosessen separat for hver fastq fil. Programvaren viser flere kvalitetskontroll beregninger i en html-fil.
- Åpne filen html kvalitetskontroll og kontrollere antall leser, lese lengde, per base sekvensen kvaliteten, per sekvens kvalitetspoeng, sekvens GC innhold, sekvens duplisering nivåer, kort innholdet og kmer innhold.
- Trim etterfølgende lav kvalitet leser og kortet innhold.
- Observere "Per base sekvensen kvaliteten" og "Kortet innhold" plott. Avgjøre trimmer for både hodet og halen av hver slik leseoperasjon. En tilstrekkelig lengde for trimming er der base kvaliteten faller under 30 og det er bevis på kortet innhold.
- Flytt mappen "raw.files".
- Dataoverføre og installere en programvare for trimming leser11. Bruk kommandoen i Figur S1B for trimming både behandling og innspill separat. Parameteren "CROP" angir gjenværende Les etter beskjæring baser fra slutten og 'HEADCROP' angir antall baser elimineres fra starten av lese.
- Kommandoen trimming inneholder også minimum lese lengde godkjennes etter filtrering i parameteren "MINLEN". Hvis leser er minst 50 bp, bruk 35 bp som Les lengden grensen.
- Flytt mappen "fastqc.output".
- Utføre fastq filen kvalitetskontroll analyse etter trimming lest. Kontroller at kvalitetskontroll problemene har blitt løst. Bruk kommandoen i Figur S1C for å få kvalitetskontroll beregningene.
- Justere én-slutten eller sammenkoblet-end ChIP-seq leser til musen referanse genomet.
- Gå til mappen "bowtie.output" for tilordning.
- Last ned GENCODE mm10 mus referanse genomet. Endre navn mm10 musen referanse genomet som "mm10.fa".
- Dataoverføre en lese tilordning12 og installere den i systemet.
- Opprette en indeksfil for nedlastede referanse genomet kommandoen i Figur S2A. Seks filer opprettes automatisk: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 og mm10.rev.2.bt2.
- Bruk kommandoen i Figur S2B kjøre justeringen og justere parameteren "-p" antall prosessorkjerner system innstillinger. Hvis kjører sammen sluttmodus, Angi parameterne "-1" og "-2" navnene trimmet fastq filer.
Merk: Kartlegging fremført separat for behandling og innspill prøvene og utgang metrisk loggfiler opprettes for hvert utvalg. - Dataoverføre en programvare for å manipulere filer i SAM format13 og installere den i systemet. Konvertere justert SAM filen i BAM fil ved hjelp av kommandoen i Figur S2C.
- Få kvalitetskontroll beregninger av tilordnede før toppen ringer for både sammen-end behandling og kontroll prøver.
- En av de viktigste kvalitetskontroll beregningene til adressen er sekvensering dybden. Åpne filene "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" og "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" i mappen bowtie.output, og kontroller at antall entydig tilordnet Les par i hver prøve er større enn 10 millioner.
- Flytt mappen "homer.output".
- Dataoverføre en programvare for motiv oppdagelsen og neste generasjons sekvensering analyse14 og installere den i systemet.
- Opprette en mappe kalt "tagDir".
- Bruk kommandoen avbildet i Figur S3Afor å kontrollere koden clonality. Kommandoen "makeTagDirectory" vil generere fire kvalitetskontroll utgang files:tagAutocorrelation.txt, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt og tagLengthDistribution.txt.
- Flytt mappen "tagDir".
- Kopier filen "tagCountDistribution.txt" til mappen "rapporter".
- Gå til mappen "rapporter".
- Åpne filen tagCountDistribution.txt bruke regnearkprogrammer og opprette en tomt på antall etiketter per genomisk stilling. Lagre filen histogram med navnet "tag.clonality.xlsx".
- Installere R programmering språk15 i systemet.
- I terminalen, skriv 'R' og trykk ENTER til R programmeringsmiljøet.
- Dataoverføre en R-pakke for behandling av ChIP-seq data16 og installere det ved hjelp av kommandoen avbildet i Figur S3B.
- Bruke skriptet R i Figur S3C tegne strand tvers-korrelasjon.
- Gjenkjenning av topper bruker en topp kartskisseprogram.
- Flytt mappen "macs2.output". Dataoverføre og installere en topp kartskisseprogram17 i systemet.
- Bruke funksjonen "callpeak" med behandling og kontrollere BAM filer generert i trinn 3.4.6.
Merk: Andre parametere inkluderer "-f" for inndatafilformatet, "-g" genom størrelse, "-navn" for å angi Basisnavnet alle filer, og "-B" for lagring fragment-pileup i bedgraph format. Komplett toppen kaller kommandoen er inkludert i Figur S4A. Bruk BEDPE for par-end prøver. - Kontroller at peak kartskisseprogram generert seks filer: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg og PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
- Åpne filen PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls å vise kalt toppene, sted, lengden, toppmøtet posisjon, pileup og topp berikelse beregningene:-log10(pvalue), kaste berikelse, og -log10(q-value).
- Filtrere og kommentere kalt topper.
- Bruke filen åpnet i forrige trinn, filtrere resulterende topper etter fold anriking, p-verdien og/eller q-verdien. For å avgjøre tilstrekkelig filtrering terskler, gjør et histogram plott å bestemme tettheten av hver beregning. Filtrere ut verdier under en valgt terskel å skaffe betydelig topper.
- Last ned mm10 svartelisten (regioner er kjent for å ha kunstig høye signal) og filtrere ut ChIP-seq topper som er i noen av disse gjenstand regionene.
- Opprette en seng fil med filtrerte toppene som inneholder følgende kolonner: kromosom, start, slutt, peakID, uekte og strand. Fylle narr kolonnen med en prikk "." siden den ikke brukes. I kolonnen strand setter alle verdiene til "+". Lagre filen seng som "filtered.peakData2.bed".
- Kopier filen "filtered.peakData2.bed" i mappen "rapporter".
- Gå til mappen "rapporter".
- For å kommentere filtrerte topper til en bestemt genet region, kan du bruke funksjonen "annotatePeaks" med filen seng opprettet i forrige trinn. Kommandoen som brukes er vist i Figur S5A.
- Åpne filen "filtered.annotatedPeaks.txt" bruke en statistisk programvare.
- Filtrere resulterende toppene ligger i et intergenisk område på en større avstand enn 5 kb fra en annotert TSS. Bruke kolonnen "Avstand til TSS" i filen som avstanden for filtrering. Lagre de filtrerte toppene i en excel-fil som heter "5kbup.geneBody.peakData.txt".
- Lagre den resulterende filtrert topper i en bedGraph-fil med kolonner: kromosom, start, slutt og -log10(q-value). Gi filen "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
- Generere bigwig filer for effekt i leseren.
- Dataoverføre og installere en programvare for genomet aritmetiske18.
- Laste ned et verktøy for å konvertere bedgraph til bigwig og installerer i systemet. Last ned filen 'mm10.chrom.sizes'.
- Bruk kommandoen i Figur S6A for å generere en bigwig fil.
- Dataoverføre og installere en genomet nettleser19 i systemet.
- Åpne genomet nettleseren og laste filen "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" å visualisere de filtrerte betydelige toppene og deres plassering i forhold kjent gener.
- Motiv søk.
- Flytt mappen "motif.analysis".
- Last ned en de novo motiv skanning og motiv berikelse program og installere den i din system20.
- Last ned en omfattende motiv database som inneholder motiver av Olig2.
- Få genomisk sekvenser av 500 bp regioner sentrert på betydelig peak toppmøtene. Lagre sekvensene som peak.sequences.txt. Bruk kommandoen i Figur S7 søke etter Olig2 motiver innenfor hver av de 500 bp peak regionene.
- Filtrere de resulterende motivene med en tilstrekkelig E-value (standard = 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lav-celle ChIP-seq ble utført og bioinformatic analyser ble gjort for å undersøke mulige samhandling transcriptional faktor Olig2 med genomisk DNA i akutt renset hjernen OPCs. Figur 1 viser en generell arbeidsflyt av både forsøksgruppen og data analyse prosedyrene. I denne protokollen, var postnatal mus hjernen avstand i en enkeltcelle suspensjon. Etter vev dissosiasjon, ble immunopanning utført for å rense OPCs ved hjelp av PDGFRα antistoff. Figur 2 viser betydelig anriking av PDGFRα, liten uttrykk for Nevron markør Tuj1 (Nevron-spesifikke klasse III beta-tubulin), astrocytter markør GFAP (glial fibrillary Sure protein), microglia markør ionisert kalsium bindende adapter molekylet 1 (Iba1), myelinating moden oligodendrocytes markør myelin basic protein (Mbp) og myelin-oligodendrocyte glykoprotein (Mog) fra renset OPCs som vurdert av RT-qPCR. I tillegg indikerer immunostai-resultater fleste cellene er NG2 positive som vist i figur 2. Deretter 20 tusen renset OPCs per reaksjon ble løst av formaldehyd og chromatin ble skåret ved hjelp av en sonication system. Olig2 lav-cell ChIP ble utført og biblioteket ble bygget. Etter ChIP biblioteket forberedelse, ble kvaliteten på det genererte produktet validert av en microfluidic chip-kapillære geleelektroforese enhet. Figur 3 viser en eksempel electropherogram Olig2 lav-celle ChIP bibliotek. Et klart toppen av Oligo2 biblioteket produkt alt 250 til 500 bp skal vises etter størrelse utvalg av biblioteket PCR produktet. ChIP-seq bibliotekene på begge utvalget utarbeidet med Olig2 transkripsjon faktor antistoff og kontroll prøven ble utsatt til høy gjennomstrømming sekvensering å produsere sammen-end 50 syklus sekvensering leser. Lengre Les lengder vil forbedre kartlegging priser og redusere sannsynligheten for flere kartlegging, på bekostning av sekvensering kostnader. Med 50 bp ChIP-seq sammen-end sekvensering biblioteker, er gode resultater vanligvis oppnås.
Etter innledende kvalitetskontroll lese rådata og trimming av kort og etterfølgende lav kvalitet base parene, er kvalitetskontroll tomter avbildet i Figur 4. Trimmet leser bør ha en base kvalitet større enn 30, ingen kort sekvenser, og har en lav duplisering rate (figur 4B-D). God kvalitet trimmet leser vil øke den totale justering hastigheten. Andre parametere som GC innhold er også viktig og bør vurderes for trimming.
Når sekvensering prøvene er justert, er det nødvendig å kontrollere sekvensering dybden. Det er kjent at antall kalt topper vil øke med en høyere sekvensering dybde siden svake områder blir statistisk mer betydelige21. En metning analyse må bestemme tilstrekkelig sekvensering dyp for hver bestemt transkripsjon faktor brukes, på bekostning av tiden og budsjettet. En konsensus sekvensering dybde for transkripsjon faktor bindingen har blitt foreslått av kode consortium om pattedyr eksempler: minst 10 millioner entydig tilordnet leser for hver av minst to biologiske replikerer22. Antall entydig tilordnet leser og den totale justering hastigheten ble beregnet ved Les-tilordning. Et eksempel på god kartlegging beregninger er vist i figur 5A. Justert leser skal tilordnes tydelige genomisk steder, som indikerer en tilstrekkelig biblioteket kompleksitet, også referert til som koden clonality. KODE konsortiet antyder at minst 80% av de 10 millioner av justert må tilordnes genomisk regioner22. Figur 5B viser en tilstrekkelig tag clonality der mer enn 90% av de er tilordnet til bare én genomisk plassering. Lite komplekse biblioteker oppstår vanligvis når ikke nok DNA er oppnådd, og PCR forsterket fragmenter er sekvensert gjentatte ganger. Et lite komplekse bibliotek vil gi en høy falske peak oppdagelsen rate.
Når du bruker sammen-end ChIP-seq data, binde fragmenter rundt transkripsjon faktoren med distanse av separasjon. Sammen-end sekvensering vil tillate et mer nøyaktig anslag av mener fragment lengden gir en bedre estimering av genomisk regionene der mer forpliktende oppstod. Strand korrelasjon handlingen viser en topp berikelse tilsvarer dominerende fragment lengden. Som observert i figur 5C, beregnet fragment er 130 bp mens Les er 50 bp. ChIP-seq dataset der hvor fragment er lengre enn Les er veiledende høykvalitets16.
Utdataene peak kall er en liste med genomisk områder vil være bundet av transkripsjon faktoren (eller sin komplekse). Liste over genomisk topper er inkludert i en "bed" fil som kan vises i en genome leser. For hver topp, denne filen inneholder en topp-ID genomisk plasseringen av toppmøtet i topp og FDR-log10 (q-verdi). Betydelig beriket toppene er de med høyere fold-berikelse og betydning beregninger. Et eksempel på topp utdatafilen er vist i figur 6A. Når du har valgt betydelig topper bruke egendefinerte terskler, filtrering topper innfor KODES svarteliste23og identifisere topper i et gen promoter region (5 kb oppstrøms og hele genet kroppen), er "bigwig" filen nyttig for å vise topper i en genome nettleser. Mest beriket peak regionene har en høyere sannsynlighet for transkripsjon faktor bindende. Det er viktig å bekrefte peak tilstedeværelse i kjente transkripsjon faktor regulatoriske regioner og topp fravær i regioner der transkripsjon faktor bindingen er usannsynlig. Figur 6B -E viser eksempler på genet regioner med og uten topp berikelse samt deres plassering når det gjelder kode promoter regioner.
I sili komplementære metoder ChIP-seq eksperimentet er motivet berikelse analyse og de novo motiv søk. Siden Olig2 binding i OPCs ikke har blitt studert før, Olig2 ChIP-seq avledet toppene i motor neuron stamfar celler og embryonale stamceller ble brukt for de novo motiv identifikasjon4,24. Olig2 de novo identifisert motiver ble lagt til omfattende kode motiv databasen25 og motiv berikelse analyse ble gjennomført. Høy anriking av de novo identifisert OLIG2 motiver og kjente transkripsjon faktor (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5 og ASCL1) motiver ble funnet i ChIP-seq topper PDGFRα renset celler. En berikelse av 30 de novo identifisert motiver med en E-value < 0,05 ble oppdaget. Figur 7 viser de to øverste de novo identifisert motivene av Olig2. Disse to de novo identifisert Olig2 motiver ble funnet i > 60% av ChIP-seq toppene Hentet fra PDGFRα renset celler, i tillegg til kjente motiver.
Figur 1: oversikt over protokollen arbeidsflyten. PDGFRα positive OPCs var isolert fra postnatal musen hjerner og ble utsatt for Olig2 ChIP eksperimentere. Utfelt DNA fragmenter ble brukt for å forberede ChIP bibliotek. Etter vurdering av biblioteket kvalitet, ble prøver brukt for sekvenser. Datasett ble analysert, og topper ble identifisert, indikerer potensiell Olig2 bindende områder i OPC renset celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: evaluering av renhet av immunopanned OPCs av qPCR og immunostai-. (A) PDGFRα antistoff immunopanned celler var frø og immunostaining ble utført ved hjelp av OPC avstamning markør NG2 antistoff. Blå: DAPI, grønn: NG2. Skala bar = 10 µm. (B) relative uttrykk nivået av Nevron markør Tuj1 renset OPCs (PDGFRα +) og dissosiert hjerneceller (mix) ble evaluert. Tuj1 uttrykk i dissosiert hjerneceller er satt til 1. (C) hvilket relative uttrykk astrocytter markør GFAP renset OPCs (PDGFRα +) og dissosiert hjerneceller (mix) ble evaluert. GFAP uttrykk i dissosiert hjerneceller er satt til 1. (D) relative uttrykk nivået av OPC markør PDGFRα renset OPCs (PDGFRα +) og dissosiert hjerneceller (mix) ble evaluert. PDGFRα uttrykk i dissosiert hjerneceller er satt til 1. (E) hvilket relative uttrykket myelinating eldre oligodendrocytes markør Mog renset OPCs (PDGFRα +) og dissosiert hjerneceller (mix) ble evaluert. Mog uttrykk i dissosiert hjerneceller er satt til 1. (F) hvilket relative uttrykket myelinating eldre oligodendrocytes markør Mbp renset OPCs (PDGFRα +) og dissosiert hjerneceller (mix) ble evaluert. MBP uttrykk i dissosiert hjerneceller er satt til 1. (G) relative uttrykk nivået på microglia markør Iba1 renset OPCs (PDGFRα +) og dissosiert hjernen cellene (mix) ble evaluert. Iba1 uttrykk i dissosiert hjerneceller er satt til 1. Data i B-G representerer tre eksemplarer eksperimenter og feilfelt angi standard feil. T-test analyse * P < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: et eksempel electropherogram av et bibliotek fra Olig2 lav-cell ChIP. Etter dobbel størrelse ble kvaliteten på Olig2 ChIP biblioteket analysert av en microfluidic chip-kapillære geleelektroforese enhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant kvalitetskontroll resultater for en 50 bp Les lengde lav-celle ChIP-seq eksempel. (A) tabellen viser totalt antall lesninger, antall dårlig kvalitet leser, sekvens lengde og samlede GC innhold. (B) plott som viser fordelingen av base kvalitetspoeng forskjellige posisjoner i lest. (C) Plot viser potensielle kortet innholdet til forskjellige posisjoner i lest. (D) linje plottet indikerer prosent av duplisert sekvenser. Fleste av stammer fra sekvenser som bare forekommer en gang i biblioteket, derfor indikerer en lav duplisering rate eller høy biblioteket kompleksitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: kvalitetskontroll beregninger innhentet før toppen ringer: bowtie2 justering beregninger, strand tvers sammenheng, og tag clonality. (A) justering beregninger hentes fra den lese tilordning. De viktigste beregningene er antall entydig tilordnet Les par, angitt som "justert concordantly nøyaktig 1 tid" og generell justering prisen. (B) Histogram viser koden clonality. Stolper angir prosent av genomisk posisjoner der koder ble funnet. (C) et eksempel på et kors-korrelasjon plott som viser gode data. Røde linjer skildrer Les lengden på 50 bps og dominerende fragment lengden på 130 bps. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: ChIP-seq peak regioner og genom nettleser utsikt over betydelig ChIP-seq topper på genomisk steder. (A) eksempel på topp regionene identifisert med topp oppringeren. (B) betydelig ChIP-seq topper funnet i genet kroppen av Cspg4, en kjent OPC markør genet. (B) ingen ChIP-seq toppene ble funnet i regionene arrangøren eller innen genet likene av Mbp genet, en markør for eldre oligodendrocytes, (C) Tubb3, merketråd neuronal cellen eller (D) GFAP, en celle markør av astrocyttene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: høyanriket de novo identifisert motiver av Olig2 i PDGFRα-Olig2 ChIP-seq topper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur S1: utarbeidelse av ChIP-seq datasett. (A) Directory arkitektur definisjon. (B) beregne rå lese kvalitetskontroll beregninger. (C) Trimming av lyder. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S2: justering av å referanse genomet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S3: kvalitetskontroll av justert lyder, adresse strand tvers sammenheng og finne koden clonality. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S4: Peak ringer. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S5: merknad av betydelig topper. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S6: konvertering av filformatet for bedGraph til bigwig for topp visualisering i genomet leseren. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S7: De novo motiv søk og motiv berikelse. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S8: Flow-chart beskriver bioinformatikk analyse av ChIP-seq data. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pattedyr genet regulering nettverk er svært komplekse. ChIP-seq er en kraftig metode å undersøke genomet hele protein-DNA interaksjoner. Denne protokollen omfatter hvordan du utfører Olig2 ChIP-seq med et lavt antall renset OPCs fra musen hjerner (idet lav idet 20 tusen celler per reaksjon). Det første viktige skrittet for denne protokollen er rensing av OPCs fra musen hjernen av immunopanning med PDGFRα antistoffer. For positive utvalg av OPCs med PDGFRα belagt plater belagt OPCs ofte svakt binder seg til PDGFRα plater. Selv etter flere vasker er det fortsatt noen ikke-tilhenger celler igjen. Det er viktig å sjekke ikke-tilhenger cellene etter hver D-PBS vask under et mikroskop. Hvis flere D-PBS vask ikke hjelper for å redusere antall celler som ikke-tilhenger, er det tid for å samle de merkede cellene, siden overflødig vasker kan dislodge tilknyttede OPCs og redusere avkastningen av renset celler. Utilstrekkelig vasker kan imidlertid føre forurensning av andre hjernen celler typer. Derfor er hver gang etter isolasjon, det nødvendig å vurdere renheten av de isolerte OPCs immunostaining med OPCs markør NG2 qPCR for uttrykket av kjente celle-type bestemte gener som Tuj1 for neurons, GFAP for astrocyttene, PDGFRα for OPCs, Iba1 microglia, og MOG og MBP for myelinating eldre oligodendrocytes. Som vist i figur 2, indikerer immunostai-resultatene at flertallet av renset cellene er positivt for NG2 flekker. I tillegg noen klassiske celle-type spesifikke indikatorer for nerveceller, astrocyttene, microglia og myelinating eldre oligodendrocytes utstillingen undetectable eller lave ekstremt uttrykk nivåer i renset OPCs sammenlignet med urenset hjerne celle blandingen. PDGFRα viser høy uttrykk nivå i renset OPCs sammenlignet med urenset hjerne celle blandingen. Bruker immunopanning metoden, microglia er sterkt redusert i de renset OPCs forhold til urenset hjerne celle blanding, men en liten mengde forurensning finnes. Denne observasjon er i samsvar med tidligere publikasjoner av andre7,8,26. I tillegg sammenliknet med tidligere publiserte rapporter, er en kommersielt tilgjengelig utstyr brukt i denne protokollen for standardisert, effektiv og praktisk dissosiasjon av hjernen vev i én celle suspensjoner.
Når cross-linking av renset OPCs, krysskoblet cellene skal vaskes med iskald HBSS løsning og ChIP trinnene bør utføres på 4 ° C, kan ikke ellers antistoffer utløse genomisk DNA riktig.
Neste viktige skritt i denne protokollen er biblioteket forberedelse. PCR forsterkning av ChIP materiale ble brukt for biblioteket konstruksjon. Antall PCR sykluser for biblioteket forberedelse avhenger av mengden starter DNA. En godt bibliotek forberedelse krever nøyaktig kvantifisering av input DNA. For mange eller for få PCR sykluser kan påvirke biblioteket konsentrasjon samt kompleksiteten, fører til PCR gjenstander.
Det er utfordrende for å konstruere ChIP-seq biblioteket når du bruker et begrenset antall celler for immunoprecipitation27. Tidligere brukte standard ChIP protokoll krever 10 ng av immunoprecipitated DNA for ChIP-seq biblioteket forberedelse1,28. Imidlertid protokollen beskrevet her normalt genererer 2 ng av immunoprecipitated DNA av Olig2 antistoff fra 20.000 OPCs. DNA brukes til å klargjøre ChIP-seq biblioteket av enkeltsteg kortet tillegg metode, som aktiverer utvidet følsomhet slik at picograms av immunoprecipitated DNA mikrofonfunksjon. Ved å kombinere kommersiell kits, gir denne protokollen en praktisk løsning for å utføre ChIP-seq for transcriptional faktorer basert på et lite antall celler.
Viktigere, gjelder lav cellen ChIP-seq-protokoll beskrevet for ChIP-Seq av andre transkripsjonsfaktorer i primære celler og sjeldne celle populasjoner også. Antistoffer i denne protokollen må valideres eksperimentelt for å være bestemt av IP eksperimentet først. Non-spesifikke binding av antistoffer vil føre til dårlige resultater. I tillegg er det best å gjennomføre dette lav celle ChIP-seq eksperimentet i celler med en høy uttrykk transkripsjon faktoren av interesse.
Det kan være utfordrende å bestemme hvilke verdier som skal brukes som filtrering avskjær etter topp for dataanalyse. Avhengig av målene på analyse, kan strenge eller mer avslappet brukes. Vanligvis brukes en kombinasjon av Brett-berikelse og p-verdien eller FDR. Hvis noen bindende områder av transkripsjon faktor under studien var tidligere kjent, kan dette hjelpe bestemme filtrering grensene. Transkripsjon faktor bindende områdedatabasene avledet fra offentlig tilgjengelige ChIP-seq eksperimenter i ulike linjer og har vært samlet29,30. En kunne søke etter et gen og sjekk hvis transkripsjon faktor bindende områder er tidligere funnet. Det er imidlertid viktig å være klar over at transkripsjon faktor bindende områder varierer avhengig av celletyper.
I sili er utfyllende ChIP-seq eksperimentet motivet berikelse analyse og de novo motiv søke med MEME-ChIP20 eller lignende programmer. Motiv søket krever en omfattende kjent og de novo avledet motiv databasen som kode motiver25 eller Hocomoco databasen31. Hocomoco er en database av motiver oppdaget offentlig tilgjengelige menneskelige og mus ChIP-seq eksperimenter. Hvis motiver for assayed protein er ukjent, kan de novo motiv søk avslører repeterende sekvens mønstre i en betydelig andel av toppene som nye motiver. Handlingen for potensielle kombinasjon av transkripsjonsfaktorer kan bli avduket når motiver av andre transkripsjonsfaktorer er også funnet å være beriket i de resulterende toppene.
Regionene beriket topp kan valideres eksperimentelt ved hjelp chromatin mutant eller knockout celleområde som kontroller. Utføre ChIP-seq bruker celler ikke uttrykke transkripsjon faktoren brukes til å identifisere falske positive topper, også merket som "phantom topper"32. Falske positiver skal filtreres.
Det er også interessant å sammenligne de resulterende ChIP-seq toppene med transcriptomic data. PDGFRα-Olig2 ChIP-seq toppene ble sammenlignet med uttrykket av gener i OPCs fra en tidligere publikasjon18. Denne strategien kan være begrenset siden uttrykt gener i OPCs kan kontrolleres av andre Olig2 transkripsjon faktor bindende midler. I tillegg Olig2 transkripsjon faktor kan binde til et gen regulatoriske regionen men genet kan ha lav gene expression nivå på grunn av mulig hemmende mekanismer eller mangel på co faktorer nødvendig for genet transkripsjon.
ChIP-seq er en metode som brukes til å identifisere genomet hele DNA bindende områder transkripsjonsfaktorer og andre proteiner. Men gjennom analyse av samtidig forekomst av transkripsjonsfaktorer fant forskere at transkripsjonsfaktorer pleier å knytte andre proteiner danner co-regulatory moduler33. Dette betyr at noen bindinger mellom transcriptional faktorer og genomisk DNA avslørt av ChIP-seq indirekte og forente med andre proteiner. Derfor, for å oppnå viktigere resultater forskere bør vurdere studere mer enn en transkripsjon faktor samtidig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
JQW, XD, RCDD og YY ble støttet av tilskudd fra den nasjonale institutter for helse R01 NS088353; NIH gi 1R21AR071583-01; Staman Ogilvie Fund-Memorial Hermann Foundation; UTHealth hjernen initiativ og CTSA UL1 TR000371; og stipend fra University of Texas System nevrovitenskap og Neurotechnology Research Institute (Grant #362469).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
- Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669 (2015).
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562 (2007).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
- Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
- Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
- Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
- Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
- Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
- Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).
