Att identifiera transkription faktorn Olig2 genomisk bindningsställen i akut renat PDGFRα + celler av låg-cell kromatin Immunoprecipitation sekvensering analys
Summary
Här presenterar vi ett protokoll som syftar till att analysera genome-wide bindningen av oligodendrocyte Transkriptionfaktorn 2 (Olig2) i akut renat hjärnan oligodendrocyte föregångare celler (OPCs) genom att utföra låg-cell kromatin immunoprecipitation (ChIP) , bibliotek förberedelse, hög genomströmning sekvensering och bioinformatiska dataanalys.
Abstract
I däggdjursceller regleras gentranskription i en cell typ specifika sätt interaktioner transkriptionell faktorer med genomiskt DNA. Härstamning-specifika transkriptionsfaktorer anses spela avgörande roller i cell specifikation och differentiering under utveckling. ChIP tillsammans med hög genomströmning DNA-sekvensering (ChIP-seq) används ofta för att analysera genome-wide bindningsställen transkriptionsfaktorer (eller dess associerade komplex) genomisk DNA. Det krävs dock ett stort antal celler för en standard ChIP reaktion, vilket gör det svårt att studera det begränsade antalet isolerade primära celler eller ovanlig cellpopulationer. För att förstå den reglerande mekanismen av oligodendrocyte härstamning-specifika transkription faktorn Olig2 i akut renad mus OPCs, en detaljerad metod med ChIP-seq för att identifiera genome-wide bindande platser för Olig2 (eller Olig2 komplexa) visas. Det första protokollet förklarar hur att rena trombocyt-härrör tillväxtfaktor receptor alfa (PDGFRα) positiva OPCs från mus hjärnor. Nästa, Olig2 antikropp medierad ChIP och bibliotek konstruktion utförs. Den sista delen beskriver bioinformatisk programvara och förfaranden som används för Olig2 ChIP-seq analys. Sammanfattningsvis rapporterar detta papper en metod att analysera genome-wide bindningar av transkriptionell faktor Olig2 i akut renat hjärnan OPCs.
Introduction
Det är viktigt att studera protein (eller proteinkomplex) DNA bindningar och epigenetiska märken att bygga transkriptionell regleringsnät inblandade i olika biologiska processer. Särskilt, kan bindningarna av transkriptionsfaktorer i genomisk DNA spela en viktig roll i genreglering, celldifferentiering och vävnad utveckling. Ett kraftfullt verktyg för att studera Transkriptionsreglering och epigenetiska mekanismer är kromatin immunoprecipitation (ChIP). På grund av de snabba framstegen i den nästa generations sekvensering teknologin används ChIP tillsammans med hög genomströmning DNA-sekvensering (ChIP-seq) för analyser av protein-DNA bindningar och epigenetiska märken1. Ett standardprotokoll för ChIP-seq kräver dock cirka 20 miljoner celler per reaktion, vilket försvårar tillämpningen av denna teknik när cellen är begränsade, såsom isolerade primära celler och sällsynta cellpopulationer.
Oligodendrocyte härstamning celler inklusive oligodendrocyte föregångare celler (OPCs) och oligodendrocyter distribueras i hela hjärnan och är en förutsättning för utveckling och funktion av hjärnan. Som en typ av prekursorceller klarar OPCs av både självförnyelse och differentiering. OPCs inte bara fungera som stamfäder för oligodendrocyter men också en viktig roll i spridningen av nervcellernas signalering genom att kommunicera med andra typer av hjärnans celler2. Tidigare studier har föreslagit att oligodendrocyte utveckling är reglerat av härstamning-specifika transkriptionsfaktorer såsom Olig2 och Sox103,4. Dessa transkriptionsfaktorer konstaterades för att binda till promotorn eller enhancer regioner i vissa avgörande gener att påverka deras uttryck under oligodendrocyte specifikation och differentiering. Men är det utmanande att identifiera DNA-binding protein (eller proteinkomplex) intresset för akut renat primära OPCs med ett mycket begränsat antal celler.
Det här protokollet beskriver hur man systematiskt undersöka den genomiskt DNA-immunoprecipitated av Olig2 i renad mus OPCs genome-wide skala med ChIP-seq teknik. OPCs från mus hjärnor var akut renas genom immunopanning och används i ett ChIP experiment utan spridning in vitro. Ett begränsat antal OPCs kan erhållas genom immunopanning och är otillräcklig för standard ChIP-seq experiment. Häri, är en låg-cell ChIP-seq protokoll med så lågt som 20 tusen celler per ChIP reaktion för transkriptionsfaktorer beskriven. I korthet, var tvärbundna celler lyserat och sonicated av en ultraljudsbehandling enhet vill skeva kromatinet. Klippt kromatinet var inkuberas med Olig2 antikroppar samt protein A-belagd pärlor för att fällningen Olig2 antikropp bunden genomiskt DNA. Efter eluering från protein A-belagd pärlor och omvänd cross-linking renades genomiskt DNA fälls ut av Olig2 antikroppar av fenol-kloroform extraktion. Den resulterande produkten var kvantifieras och utsätts för T-tailing, primer glödgning mall växling och förlängning, tillägg av adaptrar och förstärkning, bibliotek storlek urval och rening steg för ChIP-seq bibliotek konstruktion.
Efter sekvensering analyserades kvaliteten på de raw-läsningar från både provet beredd med Olig2 transkription faktor antikropp och kontrollprovet. Låg kvalitet baspar och adapter som innehåller Läs fragment var putsade. Nästa, trimmade läsningar anpassades till mus referens genomet. Genomisk Regionkommittén som var avsevärt berikad för ChIP läsningar, jämfört med stickprovet, identifierades som toppar. Betydande toppar, som representerar potentiella transkription faktorn bindningsställen, var filtreras och visualiseras i en genomet webbläsare.
Särskilt kan den metod som beskrivs i detta protokoll användas i stort sett för ChIP-seq av andra transkriptionsfaktorer med vilken celltyp i begränsat antal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Däggdjur förordning nätverk är mycket komplex. ChIP-seq är en kraftfull metod att undersöka genome-wide protein-DNA interaktioner. Detta protokoll omfattar hur du utför Olig2 ChIP-seq med ett lågt antal renat OPCs från mus hjärnor (så lågt som 20 tusen celler per reaktion). Det första viktiga steget för detta protokoll är rening av OPCs från mus hjärnor av immunopanning med PDGFRα antikropp. För positiva urval av OPCs med PDGFRα belagda plattor belagda OPCs ofta svagt binder till PDGFRα plattor. Äve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, XD, RCDD och YY stöddes av bidrag från de nationella institut för hälsa NS088353 av R01; NIH bevilja 1R21AR071583-01; Staman Ogilvie fond-Memorial Hermann stiftelsen; UTHealth hjärnan initiativ och CTSA UL1 TR000371; och ett bidrag från University of Texas System neurovetenskap och Neurotechnology Research Institute (Grant nr 362469).
Materials
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
- Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669 (2015).
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562 (2007).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
- Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
- Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
- Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
- Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive ‘Phantom Peaks’ in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
- Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).
