Summary
여기에 우리가 현재 낮은 셀 chromatin immunoprecipitation (칩)를 수행 하 여 분석 하는 게놈 넓은의 바인딩을 oligodendrocyte 녹음 방송 요인 2 (Olig2) 심하게 정화 뇌 oligodendrocyte 선구자 세포 (OPCs) 하도록 설계 된 프로토콜 도서관 준비, 높은 처리량 시퀀싱 및 bioinformatic 데이터 분석.
Abstract
포유류 세포에서 유전자 전사 genomic dna transcriptional 요인의 상호 작용에 의해 세포 유형 특정 방식으로 통제 된다. 계보 특정 녹음 방송 요인은 셀 사양 및 분화 개발 과정에 필수적인 역할을 간주 됩니다. 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq)와 결합 하는 칩은 genomic dna 녹음 방송 요인 (또는 그것의 관련 된 복잡 한)의 게놈 넓은 바인딩 사이트를 분석 하 널리 이용 된다. 그러나, 많은 세포는 하나의 표준 칩 반응, 어려운 고립 된 1 차 셀 또는 희귀 세포 인구 제한 수를 공부 하는 필요 합니다. Oligodendrocyte 계보 관련 전사의 규제 메커니즘을 이해 하기 위해서는 요소 Olig2 심하게 순화 마우스 OPCs Olig2 (또는 Olig2 복잡 한)의 게놈 넓은 바인딩 사이트 식별 칩 seq를 사용 하 여 상세한 방법에에서 표시 됩니다. 프로토콜 혈소판 파생 된 성장 인자 수용 체 알파 (PDGFRα)를 정화 하는 방법을 설명 하는 첫째, 긍정적인 OPCs 마우스 두뇌에서. 다음, Olig2 항 체 칩을 중재 하 고 도서관 건설 수행 됩니다. 마지막 부분 bioinformatic 소프트웨어 및 Olig2 칩 seq 분석에 사용 되는 절차에 설명 합니다. 요약 하자면,이 종이 심하게 정화 뇌 OPCs transcriptional 요소 Olig2의 게놈 넓은 바인딩 분석 하는 방법을 보고 합니다.
Introduction
단백질 (또는 복잡 한 단백질)을 공부 하는 것이 중요 하다 DNA 바인딩 및 후 성적인 부호 다양 한 생물학 과정에서 포함 된 transcriptional 규제 네트워크 구축. 특히, 게놈 dna 녹음 방송 요인의 바인딩 유전자 규칙, 세포 분화와 조직 개발에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 공부는 transcriptional 규칙 및 epigenetic 메커니즘에 대 한 강력한 도구 chromatin immunoprecipitation (칩)입니다. 차세대 시퀀싱 기술에 있는 급속 한 전진 때문 칩 (칩 seq) 연속 높 처리량 DNA와 결합 하 여 단백질-DNA 바인딩 및 epigenetic 마크1의 분석에 사용 됩니다. 그러나, 표준 칩 seq 프로토콜 셀 수는 고립 된 1 차 셀 등 희귀 세포 인구 제한 때이 기술의 응용 프로그램 어려운 반응 당 약 20 백만 셀을 필요 합니다.
Oligodendrocyte 계보 세포 oligodendrocyte 선구자 세포 (OPCs)와 oligodendrocytes를 포함 하 여 두뇌를 통해 널리 배포 하 고 개발 및 뇌의 기능에 필수적인. 선구자 세포의 유형으로 OPCs 자체 갱신와 차별화 할 수 있다. OPCs는 창시자 oligodendrocytes에 대 한 역할 뿐만 아니라 또한 뇌 세포2의 다른 종류와 통신 함으로써 신경 신호의 전파에 중요 한 역할. 이전 연구는 oligodendrocyte 개발 Olig2와 Sox103,4같은 계보 특정 녹음 방송 요인에 의해 통제 된다 제안 했다. 이 녹음 방송 요인 oligodendrocyte 사양과 차별화 하는 동안 그들의 표정에 영향을 몇 가지 중요 한 유전자의 발기인 또는 증강 인자 영역에 바인딩할 발견 됐다. 그러나, DNA 바인딩 단백질 (또는 복잡 한 단백질) 심하게 정화 기본 OPCs 셀의 매우 제한 된 수의 식별 하는 도전입니다.
이 프로토콜 Olig2 순화 마우스 OPCs 칩 seq 기술을 사용 하 여 게놈 넓은 규모에 의해 게놈 DNA immunoprecipitated를 체계적으로 조사 하는 방법을 설명 합니다. 마우스 두뇌에서 OPCs 심하게 immunopanning에 의해 정화 되었고 확산 체 외없이 칩 실험에 사용. 제한 된 수의 OPCs immunopanning에 의해 얻어질 수 있다 그리고 표준 칩 seq 실험에 대 한 충분 하지 않습니다. 여기, 낮은 셀 칩 seq 프로토콜은 낮은 녹음 방송 요인에 대 한 칩 반응 당 20 천 셀으로 설명 되어 있습니다. 간단히, 교차 연결 된 셀 lysed 되었고 sonicated 쥡니다 장치는 chromatin를 전단 하 여. 깎인된 chromatin Olig2 바인딩된 항 체 게놈 DNA를 침전 하는 코팅 구슬 Olig2 항 체와 단백질 incubated 했다. 단백질 A 코팅 구슬 및 역방향 cross-linking에서 차입, 후 genomic DNA Olig2 항 체에 의해 시 켰 던 페 놀-클로 프롬 적 출에 의해 순화 되었다. 결과 제품 계량은 T-미행을 복종, 뇌관 어 닐 링 템플릿 전환 및 확장, 어댑터 및 증폭, 라이브러리 크기 선택 및 정화의 추가 칩 seq 도서관 건축을 위한 단계.
시퀀싱, 후 샘플 Olig2 전사 인자 항 체와 준비와 컨트롤 샘플에서 원시 읽기의 품질 분석 했다. 낮은 품질의 기본적인 쌍 어댑터 포함 된 읽기 조각 손질 했다. 다음, 트림 읽기 마우스 참조 게놈에 정렬 했다. 컨트롤 샘플에 비해 칩 읽기 봉우리로 검색을 위한 농축 크게 했다 게놈 영역입니다. 중요 한 봉우리, 대표 하는 잠재적인 전사 인자 바인딩 사이트 필터링 되었고 게놈 브라우저에 시각.
특히,이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 모든 셀 종류 제한 된 숫자의 다른 녹음 방송 요인의 칩 seq에 광범위 하 게 사용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 사용 및 실험 프로토콜 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드를 따라 수행 되었고 기관 Biosafety 위원회에서 건강 과학 센터 택 사스 대학에서 동물 복지 위원회에 의해 승인 휴스턴입니다.
1. 쥐의 뇌 (앞에서 설명한 immunopanning 프로토콜5,,67에서 수정)에서 PDGFRα 긍정적인 Oligodendrocyte 계보 세포의 정화
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PDGFRα 긍정적인 셀 선택 및 microglia 및 내 피 세포의 고갈에 대 한 2 접시는 immunopanning 접시의 준비.
참고: 제발 note 접시 하지만 하지 셀 문화 요리 immunopanning 실험;에 대 한 작업 순화 된 세포 배양을 위해 사용 될 경우 immunopanning 단계 biosafety 내각에서 실시 해야 합니다.- 10 cm 30 µ L 염소 반대로 쥐 IgG pH 9.5, 4 ° c.에서 하룻밤 50 mM Tris HCl의 10 mL에 페 트리 접시 코트 플레이트 플레이트의 표면은 균등 하 게 그리고 완전히 코팅 솔루션에 의해 보호 되도록 교 반 하십시오.
- PDGFRα 항 체 솔루션 diluting 40 µ L 쥐 안티-PDGFRα 항 체의 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 포함 하는 0.2 %BSA 12 mL로 하 여 준비 합니다.
- 10 mL와 IgG 코팅 판의 3 세척 후 각, 1 x DPBS IgG 코팅 접시 4 h에 대 한 실 온에서 PDGFRα 항 체 솔루션을 품 어.
- 쥐 안티-PDGFRα 항 체 코팅 접시 3 번 10 mL와 함께 1 x DPBS 세척. 부드럽게 접시의 측면 벽을 따라 DPBS 솔루션을 추가 하 고 코팅된 표면을 방해 하지 마십시오.
- 2 새로운 15 cm 페 트리 접시 2 h Banderiaea simplicifolia lectin 1 (BSL-1)의 2.3 µ g/mL를 포함 하는 DPBS의 20 mL와 microglia 및 내 피 세포의 고갈 코트.
- BSL-1 코팅 세척 접시 3 번 20 mL로 1 x DPBS. 부드럽게 플레이트의 측면 벽을 따라 DPBS 솔루션을 추가 하 고 코팅된 표면을 방해 하지 마십시오.
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이전에 게시 방법6 에서 정화의 PDGFRα 긍정적인 oligodendrocyte 계보 셀 수정 , 7 , 8.
- 부 산 후 2에서 대뇌 피 질의 조직 하루 7 (P7) 마우스 머리 이전에 따라 게시 프로토콜5,6.
- 자세한 제조 업체의 지침에 따라 신경 조직 분리 키트 (P)와 단일 세포 현 탁 액을 생성 하 조직 분리
- 간단히, 해 부 대뇌 피 질의 조직 메스와 조각으로 잘라 하 고 37 ° c.에 효소 소화에 그들을 주제합니다 소화 후 수동으로 화재 광택 유리 단일 셀 서 스 펜 션으로 파스퇴르 펫 조각 해리.
- 실 온에서 10 분 동안 300 x g에서 단일 세포 현 탁 액을 원심 및 셀 펠 릿 immunopanning 버퍼의 15 mL를 사용 하 여 일시 중단 (immunopanning 버퍼는 0.02 %BSA 5 µ g/mL 인슐린 DPBS).
- Microglia 및 내 피 세포의 더 나은 고갈 되도록 2 BSL-1 코팅 접시 접시 마다 5 분의 부드러운 동요와 함께 실 온에서 15 분 동안에 순차적으로 2 마우스 두뇌에서 단일 세포 현 탁 액을 품 어.
- 부드럽게 세포 현 탁 액에는 비 부착 한 세포를 수집 하 여 실 온에서 45 분에 대 한 쥐-PDGFRα 항 체-코팅 접시에 그들을 품 어 접시를 소용돌이 친다.
- 쥐-PDGFRα 항 체-코팅 접시에 세포 현 탁 액의 부 화 후 부드럽게 소용돌이 격판덮개 세포 현 탁 액을 수집 하 고 8 번 비 부착 한 세포를 제거 하는 DPBS와 접시를 헹 굴. 부드럽게 세척 접시의 측면 벽을 따라 솔루션을 추가 하 고 여러 번 비 부착 한 세포를 제거 하는 접시를 선동.
- 37 ° c.에서 10 분 동안 세포 분리 솔루션 치료의 4 mL를 사용 하 여 쥐-PDGFRα 항 체 코팅 접시에서 세포를 분리 부착 세포를 꺼내 접시를 흔들어.
- 실 온에서 300 x g에서 원심 분리 하 여 정제 OPCs 수집, 2 mL OPC 세포 배양 매체와 셀 펠 릿을 일시 중단 하 고 trypan 블루는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 (500 mL 세포 배양 매체 DMEM/F12 매체 5 mL를 포함 하는 페니실린-스 솔루션 (P/S), N2 5 mL, 10 mL B27, 5 µ g/mL 인슐린, 0.1 %BSA, 20 ng/mL bFGF 그리고 10 ng/mL PDGFRα).
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Immunopanning 후 OPCs의 순수성의 유효성 검사입니다.
- Immunopanning 후 OPCs의 농축을 평가, guanidium 안산으로 RNA 추출 정화 OPCs 중 일부를 사용 하려면 제조업체의 지침에 따라 추출을 기반으로 합니다.
- 4이전 발표 한 자료 따르면 해리 뇌 세포에 비해 순화 OPCs에 PDGFRα 식의 농축에 대 한 확인을 형광 녹색 염료 마스터 믹스를 사용 하 여 qRT-PCR을 수행 합니다.
- 또한, 씨앗 일부 순화 OPCs는 폴 리-D-리 코팅으로 24 잘 플레이트 안티 NG2 콘 proteoglycan (NG2) 항 체로 immunostaining 이전 출판 자료9.
2. 낮은 셀 칩 준비 및 높은 처리량 시퀀싱 칩 도서관 건축
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상용 쥡니다 시스템 및 상용 낮은 휴대폰 번호 칩 Olig2 낮은 셀 칩 준비 키트 (재료의 표 참조) 제조 업체의 지침에서 자세한 표준 절차에 따라.
- 쥐 안티-PDGFRα에서 분리 후 항 체-코팅 판과 trypan 블루와는 hemocytometer 계산 셀 1 mL OPC 세포 배양 매체 각 칩 반응에에서 20000 순화 OPCs을 넣어.
- 실 온에서 10 분 동안 세포 현 탁 액을 해결 하기 위해 36.5% 포름알데히드의 27 µ L를 추가 합니다.
주의: 제발 note는 포 름 알 데히드 화학 증기 두건에서 안전 상의 이유로 사용 해야 합니다. - 실 온에서 5 분 동안 50 µ L 2.5 M 글리신과 DNA-단백질 cross-linking 중지 합니다.
참고: 모든 단계 얼음에 또는이 시점에서 4 ° C 차가운 방에서 밖으로 실행 되어야 한다. - 칵테일 1 mL의 얼음 처럼 차가운 행 크 스 균형 소금 솔루션 (HBSS) protease 억제제와 함께 상호 연결 된 셀 펠 릿을 세척 하 고 세포에 4 ° c.에 300 x g 사전 냉각된 분리기에 의해 일지도
- 25에서 셀 펠 릿을 lyse µ L 얼음에 5 분에 대 한 세포의 용 해 버퍼를 완료.
참고: 튜브 세포 세포의 용 해 버퍼에서 일시 중지를 교 반 하십시오. - 75 µ L을 포함 하는 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 전단 HBSS 세포 lysate 의해 chromatin 사전 냉각 쥡니다 시스템과 5 주기 30 s 및 30 s OFF 프로그램의 얼음으로 lysate 셀을 보충 한다. 항상 함께 6 튜브를 sonicate 고 균형 튜브 100 µ L 물 포함을 확인 합니다.
- 전단, 후 14000 x g 10 분 4 ° C에서 원심와 원심 분리 후 상쾌한 새로운 튜브에서를 수집 합니다.
- 얼음 처럼 차가운 완벽 한 칩 버퍼 protease 억제제와의 동등한 양으로 깎인된 chromatin의 100 µ L를 희석.
- 입력 컨트롤 샘플으로 희석된 깎인된 chromatin의 20 µ L를 저장 합니다.
참고: 입력 컨트롤 샘플 Olig2 immunoprecipitated 샘플 Olig2 항 체 immunoprecipitated DNA를 식별 하는 비교로 필요 이기도 합니다. - 토끼 반 olig2 항 체는 희석의 180 µ L의 1 µ L chromatin 전단 및 4 ° c.에 16 h 40 rpm에 회전 바퀴에 반응 관을 품 어 추가
참고: 차가운 방에이 단계를 수행 합니다. - 각 칩 반응에 대 한 세척 11 µ L 자기 단백질 A 코팅 구슬 55 µ L와 구슬 워시 버퍼와 넣어 구슬 2 세척 후 비드 워시 버퍼의 11 µ L에 작은.
참고: 차가운 방에이 단계를 수행 합니다. - 각 칩 반응에 대 한 칩 반응 관에 미리 씻어 단백질 A 코팅 구슬의 10 µ L를 추가 합니다. 콜드 룸에서이 단계를 수행 합니다.
- 칩 반응 관 회전 바퀴에 다른 2 h 4 ° C에서 품 어.
- 칩 반응 관 1 분에 대 한 자석 선반에 넣어.
참고: 차가운 방에이 단계를 수행 합니다. - 제거는 상쾌한 고 비드 펠 릿을 꺼내 하지 마십시오.
- 4 ° c.에 회전 바퀴에 4 분 동안 각각 4 워시 버퍼의 각 100 µ L로 비드 펠 릿을 세척
- 세척, 후 비드 펠 렛을 차입 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 상호 연결 단백질-DNA를 4 h 65 ° C에서 칩 반응 관을 품 어.
- 또한, 20 µ L 입력 컨트롤 샘플을 차입 버퍼의 180 µ L을 추가 하 고 상호 연결 단백질-DNA 뿐만 아니라 반대로 4 h 65 ° C에서 품 어.
- 각 칩 반응 관에 페 놀, 클로 프롬, 및 isoamyl 알콜의 200 µ L 25:24:1 (v/v) 혼합을 추가 합니다.
- 1 분을 실 온에서 15 분 13000 x g에서 원심 분리기 적극적으로 소용돌이. 새로운 튜브를 이동 위 단계입니다.
- 40 µ L 3 M 나트륨 아세테이트 솔루션, 100% 에탄올의 1000 µ L, 2 µ L glycogen precipitant의 covalently 하룻밤-20 ° c.에 각 칩 반응 관에 파란 염료에 연결 추가
- 4 ° c.에 20 분 13000 x g에서 원심 분리기
- 삭제는 상쾌한, 500 µ L 찬 70% 에탄올으로 씻어 및 4 ° c.에 20 분 13000 x g에서 원심
- 삭제는 상쾌한, 펠 릿 공기를 10 분 동안 건조 유지 하 고 50 µ L 물 펠 릿을 녹.
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높은 처리량 시퀀싱 칩 도서관 건축
- 깨끗 하 고 제조업체의 지침에 따라 청소 키트 칩 DNA를 집중.
- 제조업체의 지침에 따라 피코 그린 칩 샘플을 계량.
- 칩 seq 키트를 사용 하 여 T-미행, 복제와 미행, 템플릿 전환 및 확장, 어댑터 및 증폭, 라이브러리 크기 선택 및 제조업체의 지침에 따라 정화의 추가.
- DsDNA의 변성, 후 새우 알칼리 성 인산 가수분해 효소에 의해 ssDNA의 3' 끝을 dephosphorylate 하 고 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소에 의해 폴 리 (T) 꼬리는 ssDNA를 추가 합니다.
- DNA 복제 및 템플릿 전환 ssDNA 서식 파일 DNA 폴 리 (다) 뇌관 anneal
- 서식 파일 전환, 후 인덱싱에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관으로 PCR에 의해 칩 seq 라이브러리를 증폭.
- PCR 증폭 칩 seq 도서관 파편 250에서 500까지 선택 옵션 2 두 배 크기 선택 하 여 상자성 구슬에 의해 혈압.
- 미세 칩-모 세관 전기 영동 장치를 사용 하 여 선택한 칩 seq 라이브러리의 품질을 검사 합니다.
3. 데이터 분석
- 디렉터리 구조를 준비 합니다.
- 칩 seq 데이터 분석을 수행 하기 위한 디렉터리를 만듭니다. 새로 만든 디렉터리 다음 이름으로 6 개의 하위 디렉터리 만들기: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis, 및 보고서.
- 데이터를 준비 하 고 원시 시퀀스 데이터의 품질 관리 분석을 수행.
- "Raw.files" 디렉터리에 이동한 칩 seq 데이터 파일을 다운로드 합니다.
- 파일 이름을 확인 합니다. 시퀀싱 쌍 간 경우, 비슷한 기본 이름 가진 4 개의 파일 (치료를 위해 2)와 두 개의 입력에 대 한 될 것입니다: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq, 및 PDGFRα_input.read2.fastq. 파일 이름이 서로 다른 경우, "mv" 명령을 사용 하 여 그들의 이름을 바꿉니다.
- "Fastqc.output" 디렉토리를 이동 합니다.
- Fastq 파일 품질 관리 소프트웨어10를 사용 하 여 원시 읽기에서 품질 관리 통계를 가져옵니다. 그림 S1A 에서 명령을 사용 하 여 별도로 각 fastq 파일에 대 한 품질 관리 프로세스를 실행. 소프트웨어는 html 파일에서 여러 품질 관리 통계를 표시 합니다.
- Html 품질 관리 파일을 열고 읽기, 수 확인 기준 시퀀스 품질, 시퀀스 품질 평가 점수, 시퀀스 GC 내용, 시퀀스 중복 수준, 어댑터 콘텐츠 및 kmer 콘텐츠 당 당 길이 읽기.
- 후행 고품질 읽기 및 어댑터 콘텐츠 트림.
- "당 기준 시퀀스 품질"과 "어댑터 콘텐츠" 플롯을 관찰 합니다. 머리와 꼬리 각 읽기의 트리밍 길이 결정 합니다. 트리밍에 대 한 적절 한 길이 기본 품질 30 미만으로 떨어지면 어댑터 콘텐츠의 증거가 있다.
- "Raw.files" 디렉토리를 이동 합니다.
- 다운로드 및 트리밍 읽기11용 소프트웨어 설치. 그림 S1B 명령을 사용 하 여 별도로 치료와 입력을 트리밍에 대 한. 트리밍 끝에서 기지 고 읽기의 시작에서 제거 되어야 하는 기지의 수를 지정 하는 'HEADCROP' 매개 변수 '자르기' 나머지 읽기 길이 나타냅니다.
- 트리밍 명령을 읽기 'MINLEN' 매개 변수에서 필터링 후 허용 길이 최소 포함 됩니다. 읽기는 적어도 50 경우 읽기 길이 임계값으로 사용 35 bp, bp.
- "Fastqc.output" 디렉토리를 이동 합니다.
- 읽기 트리밍 후 fastq 파일 품질 관리 분석을 수행 합니다. 품질 관리 문제가 해결 되었는지 확인 합니다. 그림 S1C 명령을 사용 하 여 품질 관리 삼습니다.
- 마우스 참조 게놈을 단일 엔드 또는 쌍-엔드 칩 seq 읽기를 맞춥니다.
- 매핑에 대 한 "bowtie.output" 디렉토리를 이동 합니다.
- 다운로드 GENCODE mm10 마우스 참조 게놈. "Mm10.fa"로 mm10 마우스 참조 게놈을 이름을 바꿉니다.
- 읽기 매퍼12 다운로드 하 고 시스템에 설치 합니다.
- 그림 S2A에 명령을 사용 하 여 다운로드 참조 게놈의 인덱스 파일을 만듭니다. 6 개의 파일이 자동으로 만들어집니다: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2, 및 mm10.rev.2.bt2.
- 명령을 사용 하 여 그림 S2B 에 맞춤을 실행 하 고 매개 변수 조정 "-p" 시스템 설정에 따라 프로세싱 코어의 수를. 짝-엔드 모드를 실행 하는 경우 매개 변수 "-1"과 "-2" 트림된 fastq 파일의 이름을 나타냅니다.
참고: 매핑을 수행 되 별도로 치료 및 입력 샘플에 대 한 고 출력 통계 로그 파일은 각 샘플에 대 한 만들어집니다. - 샘 형식13 파일을 조작 하기 위한 소프트웨어를 다운로드 하 고 시스템에 설치 합니다. 그림 S2C명령을 사용 하 여 BAM 파일에 정렬된 하는 SAM 파일을 변환 합니다.
- 최대 두 쌍-엔드 치료 및 제어 샘플에 대 한 호출 전에 매핑된 읽기의 품질 관리 통계를 가져옵니다.
- 주소에 가장 중요 한 품질 관리 통계 중 하나 시퀀싱 깊이입니다. 파일 "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" 및 "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" bowtie.output 디렉터리에서 열고 각 샘플에서 고유 하 게 매핑된 읽기 쌍 수 10 백만 이상 인지 확인 합니다.
- "Homer.output" 디렉토리를 이동 합니다.
- 주제 발견과 차세대 시퀀싱 분석14 에 대 한 소프트웨어를 다운로드 하 고 시스템에 설치 합니다.
- "TagDir" 라는 디렉터리를 만듭니다.
- 태그 clonality를 확인 하려면 그림 S3A에 묘사 된 명령을 사용 합니다. 4 품질 관리 출력 files:tagAutocorrelation.txt, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt, 및 tagLengthDistribution.txt "makeTagDirectory" 명령을 생성 합니다.
- "TagDir" 디렉토리를 이동 합니다.
- "보고서" 디렉토리에 "tagCountDistribution.txt" 파일을 복사 합니다.
- "보고서" 디렉터리로 이동 합니다.
- 스프레드시트 프로그램을 사용 하 여 tagCountDistribution.txt 파일을 열고 바 만들 genomic 위치 당 태그의 수 작. 히스토그램 파일 이름 "tag.clonality.xlsx"로 저장 합니다.
- R 프로그래밍 언어15 시스템을 설치 합니다.
- 터미널에서 'R'을 입력 하 고 enter 키를 눌러 R 프로그래밍 환경에 액세스 합니다.
- 칩 seq 데이터16 을 처리 하기 위한 R 패키지를 다운로드 하 고 그림 S3B표시 명령을 사용 하 여 그것을 설치.
- 스트랜드 간 상관 관계를 그림 S3C 에서 R 스크립트를 사용 합니다.
- 봉우리는 피크 매퍼를 사용 하 여 탐지 합니다.
- "Macs2.output" 디렉토리를 이동 합니다. 다운로드 하 고 당신의 시스템에서 피크 매퍼17 를 설치.
- 치료와 기능 "callpeak"를 사용 하 고 단계 3.4.6에서에서 생성 된 BAM 파일 제어.
참고: 다른 매개 변수를 포함 "-f" 입력된 파일 형식에 대 한 "-g" 게놈 크기에 대 한 "-이름" 나타내는 모든 출력 파일의 기본 이름 및 "-B" 조각 탑 쌓기 bedgraph 형식으로 저장 하기 위한. 명령을 호출 하는 완전 한 피크 그림 S4A에 포함 됩니다. BEDPE를 사용 하 여 쌍 간 샘플에 대 한. - 피크 매퍼 6 파일 생성 확인 합니다: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg, 그리고 PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg입니다.
- 파일 열기 라는 봉우리, 위치, 길이, 정상 위치, 탑 쌓기, 그리고 피크 농축 통계를 볼 수 PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls:-log10(pvalue), 배 농축, 그리고-log10(q-value).
- 필터 및 주석을 라는 봉우리.
- 이전 단계에서 열린 파일을 사용 하 여, 배 농축, p-값 및 q 값에 따라 결과 봉우리 필터링. 적절 한 필터링 임계값 결정, 각 통계의 밀도 결정 하기 위해 히스토그램 플롯을 확인 합니다. 중요 한 봉우리를 선택한 임계값 값을 필터링.
- (영역을 인위적으로 높은 신호를가지고 알려져 있습니다) mm10 블랙 리스트를 다운로드 하 고 칩 seq 밖으로 필터는 그 유물 지역의 내부는 봉우리.
- 다음 열을 포함 하는 필터링 된 봉우리 침대 파일 만들기: 염색체, 시작, 끝, peakID, 모의 그리고 물가. 점이 모의 열 채우기 "." 때문에 사용 되지 않습니다. 스트랜드 열에서 모든 값을 설정 "+". "Filtered.peakData2.bed"로 침대 파일을 저장 합니다.
- "보고서" 디렉토리에 "filtered.peakData2.bed" 파일을 복사 합니다.
- "보고서" 디렉터리로 이동 합니다.
- 특정 유전자 영역에 필터링 된 봉우리 주석을 이전 단계에서 만든 침대 파일 "annotatePeaks" 함수를 사용 합니다. 사용 되는 명령어는 그림 S5A에 표시 됩니다.
- 통계 소프트웨어를 사용 하 여 "filtered.annotatedPeaks.txt" 파일을 엽니다.
- 필터링 결과 봉우리는 주석된 TSS에서 5 kb 보다 큰 거리에 intergenic 지역에 누워. 필터링 때 파일 "TSS에 거리" 열 거리로 사용 합니다. 필터링 된 봉우리 "5kbup.geneBody.peakData.txt" 라는 excel 파일에 저장 합니다.
- 그 결과 저장소 필터링 열 bedGraph 파일에서 봉우리: 염색체, 시작, 끝, 및-log10(q-value). "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph" 파일을 이름을 지정 합니다.
- 브라우저 시각화에 대 한 중요 파일을 생성 합니다.
- 다운로드 및 게놈 산술18에 대 한 소프트웨어를 설치.
- 중요 bedgraph 변환 도구를 다운로드 하 고 시스템에 설치. 'Mm10.chrom.sizes' 파일을 다운로드 합니다.
- 그림 S6A 명령을 사용 하 여 중요 파일을 생성.
- 다운로드 하 고 설치는 게놈 브라우저19 시스템.
- 게놈 브라우저를 열고 필터링 된 중요 한 봉우리와 알려진된 유전자에 관하여 그들의 위치를 시각화 하기 위해 "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" 파일을 로드 합니다.
- 주제 검색입니다.
- "Motif.analysis" 디렉토리를 이동 합니다.
- 스캔 드 노 보 모티프와 모티브 농축 프로그램을 다운로드 하 고 당신의 시스템20에 그것을 설치.
- Olig2의 모티프를 포함 하는 포괄적인 모티프 데이터베이스를 다운로드 합니다.
- 500 bp 지역 상당한 피크 정상에서 중심으로의 게놈 시퀀스를 가져옵니다. Peak.sequences.txt으로 시퀀스를 저장 합니다. 그림 S7 명령을 사용 하 여 각 500 bp 피크 영역의 Olig2 모티프에 대 한 검색.
- 적절 한 전자-값을 사용 하 여 결과 모티브 필터링 (기본값 = 0.05).
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Representative Results
낮은 셀 칩 seq 수행한 고 bioinformatic 분석 심하게 정화 뇌 OPCs genomic dna Olig2 transcriptional 요소의 잠재적인 상호 작용을 조사 했다. 그림 1 실험 및 데이터 분석 절차의 일반적인 워크플로 보여 줍니다. 이 프로토콜에서 출생 후 쥐 두뇌 했다 단일 세포 현 탁 액에 해리 했다. 조직 분리 후 immunopanning PDGFRα 항 체를 사용 하 여 OPCs 정화 수행 되었다. 그림 2 는 PDGFRα, 신경 마커 Tuj1의 작은 식의 중요 한 농축 (신경 관련 클래스 III 베타-tubulin), 사이토 마커 GFAP (폐해 fibrillary 산 성 단백질), microglia 마커 이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 1 (Iba1), myelinating 성숙 oligodendrocytes 마커 myelin 기본적인 단백질 (Mbp) 및 순화 OPCs에서 myelin oligodendrocyte 당단백질 (Mog) 실시간 정량 평가. 또한, immunostaining 결과 세포의 대부분은 그림 2와 같이 긍정적인 NG2 나타냅니다. 그 후, 반응 당 20 천 정화 OPCs 포 름 알 데히드에 의해 해결 되었습니다 하 고 chromatin 쥡니다 시스템을 사용 하 여 전단 했다. Olig2 낮은 셀 칩 수행 하 고 도서관 건립 되었다. 칩 라이브러리 준비 후 생성 된 제품의 품질 미세 칩-모 세관 전기 영동 장치에 의해 확인 되었다. 그림 3 Olig2 낮은 셀 칩 라이브러리의 예제 electropherogram를 보여 줍니다. 명확한 피크 Oligo2 라이브러리 제품 250에서 500까지 bp는 라이브러리 PCR 제품의 크기 선택 후 표시 되어야 합니다. 칩 seq 라이브러리 Olig2 전사 인자 항 체와 컨트롤 샘플 준비 두 샘플의 복종 되었다 쌍 간 50 생산 높은 처리량 시퀀싱을 주기 연속 읽기. 더 이상 읽기 길이 매핑 속도 향상 하 고 멀티 매핑, 시퀀싱 비용의 비용의 확률을 줄일 것입니다. 50 bp 칩 seq 쌍-엔드 시퀀싱 라이브러리, 좋은 결과 보통 달성 된다.
원시 읽기 및 어댑터의 트리밍 및 낮은 품질의 기본적인 쌍을 후행의 초기 품질 관리 평가 후 품질 관리 플롯은 그림 4에 묘사 된다. 트림 된 읽기 기본 품질 30, 아니 어댑터 시퀀스 보다 큰 있고 낮은 복제 속도 (그림 4B-D) 한다. 좋은 품질 손질 읽고 전체 정렬 속도 증가 합니다. GC 등 다른 매개 변수 또한 중요 하며 트리밍을 위해 고려 되어야 한다.
시퀀싱 샘플 정렬 됩니다 일단 시퀀싱 깊이 확인할 필요가 있다. 그것 때문에 약한 사이트 더 통계적21될 것입니다 높은 시퀀싱 깊이 라는 봉우리의 수 증가 알려져 있다. 채도 분석 시간 및 예산 비용으로 사용 각 특정 전사 인자에 대 한 충분 한 시퀀싱 깊이 결정 해야 합니다. 녹음 방송 요인 바인딩 위한 합의 시퀀싱 깊이 포유류 샘플에 대 한 인코딩 컨소시엄에 의해 제안 되었습니다: 10 백만의 최소 고유 하 게 매핑된 읽기22를 복제 하는 두 개 이상의 생물의 각각에 대 한. 고유 하 게 매핑된 읽기 및 전체 정렬 속도의 수 읽기 매퍼에 의해 계산 했다. 좋은 매핑 통계의 예는 그림 5A에 표시 됩니다. 정렬 된 읽기 태그 clonality 라고도 하는 적절 한 라이브러리 복잡성을 나타내는 고유한 게놈 위치에 매핑할 수 합니다. 인코딩 컨소시엄 제안 정렬된 읽기의 10 백만의 80% 이상 다른 genomic 지구22에 매핑해야 합니다. 그림 5B 는 읽기의 90% 이상 한 genomic 위치에 매핑되는 적절 한 태그 clonality를 보여 줍니다. 낮은 복잡성 라이브러리 일반적으로 조각을 반복 시퀀스는 충분 하지 않은 DNA를 얻은 PCR 증폭 때 발생 합니다. 낮은 복잡성 라이브러리 높은 거짓 피크 탐지 비율을 얻을 것입니다.
짝-엔드 칩 seq 데이터를 사용 하 여 조각을 분리의 특정 거리 녹음 방송 요인의 주위 바인딩합니다. 짝-엔드 시퀀싱 게놈 지역 더 많은 바인딩 발생의 더 나은 평가 양보 의미 조각 길이의 더 정확한 견적에 대 한 수 있습니다. 스트랜드 상관 관계 음모 주된 조각 길이에 해당 하는 농축의 피크를 보여준다. 그림 5C에 관측 된, 계산 된 조각 길이 130 bp 읽기 길이 50 bp. 조각 길이 길이 보다 긴 경우 읽기 칩 seq dataset은 고품질16의 지표입니다.
최대 호출의 출력 게놈 영역 녹음 방송 요인 (또는 그것의 복잡 한)을 준수할 것 것의 목록입니다. Genomic 지구 또는 봉우리의 목록 게놈 브라우저에서 볼 수 있는 "침대" 파일에 포함 됩니다. 각 피크에 대 한이 파일에 포함 되어는 피크, 피크 정상의 genomic 위치 계정과-루즈벨트 log10 (q 값). 크게 농축된 봉우리는 높은 배 농축 및 중요성 통계. 출력 피크 파일의 예는 그림 6A에 표시 됩니다. 사용자 지정 임계값을 사용 하 여 인코딩의 블랙 리스트23, 이내 봉우리를 필터링 하 고 식별 봉우리는 유전자의 발기인 지구 (5 kb 업스트림 및 전체 유전자 몸) 내에서 중요 한 봉우리를 선택한 후 "중요" 파일은 게놈에 봉우리를 볼 때 유용 브라우저. 가장 풍부한 피크 지구 있다 녹음 방송 요인 바인딩의 높은 확률. 그것은 알려진된 전사 인자 규제 지역에서 피크 존재 뿐만 아니라 녹음 방송 요인 바인딩 가능성이 없는 지역에서 최대 부재를 확인 하는 것이 중요. 그림 6B -E 와 인코딩 발기인 지구에 관하여 그들의 위치 뿐만 아니라 피크 농축 하지 않고 유전자 영역의 예를 보여줍니다.
칩 seq 실험 보완 방법 실리콘에 는 모티프 농축 분석 및 드 노 보 주제 검색. OPCs Olig2 바인딩을 앞에 공부 하지 않은 이후 Olig2 칩 seq 파생 모터 신경 조상 세포에서 봉우리 그리고 미 발달 줄기 세포 드 노 보 모티브 식별4,24사용 되었다. Olig2 드 노 보 식별 모티브 포괄적인 인코딩 모티프 데이터베이스25 에 추가 된와 모티브 농축 분석 수행 했다. 드 노 보 의 높은 농축 OLIG2 모티프를 식별 하 고 알려진된 전사 인자 (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5, 및 ASCL1) 모티브 PDGFRα 정화 셀 칩 seq 봉우리에서 발견 됐다. 농축 E-값 30 드 노 보 식별 모티프의 < 0.05 발견 되었다. 그림 7 Olig2의 상위 2 드 노 보 식별 모티프를 보여준다. 이 두 드 노 보 식별 Olig2 모티브에서 발견 > 칩 seq 봉우리의 60% 정화 PDGFRα 세포에서 또한 알려진된 모티프를 얻은.
그림 1: 프로토콜 워크플로 개요. PDGFRα 긍정적인 OPCs 출생 후 마우스 두뇌에서 고립 됐다 고 Olig2 칩 테스트를 실험. 침전 된 DNA 조각 칩 라이브러리를 준비 하기 위해 사용 되었다. 라이브러리 품질의 평가, 후 샘플 시퀀싱을 위해 사용 되었다. 데이터 세트 분석 되었다, 그리고 봉우리 발견 했다, 세포 정화 OPC에 잠재적인 Olig2 바인딩 사이트를 나타내는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: immunopanned OPCs 정량 및 immunostaining의 순수성의 평가. (A) PDGFRα 항 체 immunopanned 셀은 시드와 immunostaining OPC 혈통 마커 NG2 항 체를 사용 하 여 수행 되었다. 블루: DAPI, 녹색: NG2. 눈금 막대 = 10 µ m. (B) 신경 마커 Tuj1 정화 OPCs (PDGFRα +)에서 해리 뇌 세포 (혼합)에 상대 식 수준 평가 했다. 해리 뇌 세포에 Tuj1 식 1로 설정 했다. (C) 사이토의 상대 식 수준 마커 GFAP 순화 OPCs (PDGFRα +)와 해리 뇌 세포 (믹스) 평가 했다. 해리 뇌 세포에 GFAP 식 1로 설정 했다. (D) OPC의 상대 식 수준 마커 PDGFRα 정화 OPCs (PDGFRα +)와 해리 뇌 세포 (믹스) 평가 했다. 해리 뇌 세포에 PDGFRα 식 1로 설정 했다. (E) myelinating 성숙 oligodendrocytes 마커의 상대 식 수준 Mog 순화 OPCs (PDGFRα +)와 해리 뇌 세포 (믹스) 평가 했다. 집 고 양이 식 천연된 뇌 세포에는 1로 설정 됩니다. (F) myelinating 성숙 oligodendrocytes 마커의 상대 식 수준 Mbp 순화 OPCs (PDGFRα +)와 해리 뇌 세포 (믹스) 평가 했다. Mbp 식 천연된 뇌 세포에는 1로 설정 했다. (G) 상대 식 수준 microglia 마커 Iba1 정화 OPCs (PDGFRα +)와 해리 뇌 세포 (믹스) 평가 했다. 해리 뇌 세포에 Iba1 식 1로 설정 했다. B g에서 데이터 triplicate 실험 나타내고 오차 막대 표준 오류를 나타냅니다. T-테스트 분석 * P < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Olig2 낮은 셀 칩에서 라이브러리의 예제 electropherogram. 더블 사이즈 선택 후 Olig2 칩 라이브러리의 품질 미세 칩-모 세관 전기 영동 장치에 의해 분석 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 50 bp 읽고 길이 낮은 셀 칩 seq 샘플에 대 한 대표적인 품질 관리 결과. (A) 요약 테이블 읽기의 총 수, 수 저질 읽기, 시퀀스 길이 및 전반적인 GC 내용 묘사. (B) 줄거리 읽기에 다른 위치에 기본 품질 점수 분포를 나타내는. (C) 줄거리 읽기에 다른 위치에서 잠재적인 어댑터 콘텐츠를 보여주는. (D) 선 플롯의 %를 나타내는 시퀀스를 중복. 라이브러리 내에서 나타내는 따라서 낮은 복제 속도 또는 높은 라이브러리 복잡 한 번만 발생 하는 순서에서 발생 한 읽기의 대부분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 품질 관리 통계 피크 호출 하기 전에 얻은: bowtie2 맞춤 통계, 교차 상관, 물가 및 태그 clonality. (A) 맞춤 통계 읽기 매퍼에서 얻은. 가장 중요 한 통계 "정렬 concordantly 정확 하 게 1 시간", 그리고 전반적인 정렬으로 고유 하 게 매핑된 읽기 쌍의 수 있습니다. (B) 히스토그램 표시 태그 clonality. 막대 태그 발견 되었다 genomic 위치의 비율을 나타냅니다. (C) 좋은 품질 데이터를 나타내는 교차 상관 플롯의 예. 레드 라인 50 bps에서 읽기 길이 130로 주된 조각 길이 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 칩 seq 피크 지역 및 다른 genomic 위치의 중요 한 칩 seq 봉우리의 게놈 브라우저 보기. 의 피크 호출자 식별 피크 영역 (A) 예. (B) 중요 한 칩 seq 봉우리 Cspg4, 알려진된 OPC 표식 유전자의 유전자 본문에서 발견. (B) 칩 seq 봉우리 발기인 지구 또는 Mbp 유전자, 성숙한 oligodendrocytes, (C) Tubb3, 신경 세포 표식에 대 한 표시 또는 (D) GFAP, 이다의 셀 표식 유전자 시체에서 발견 됐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 높은 농축 Olig2 PDGFRα Olig2 칩 seq 봉우리에서 발견의 드 노 보 식별 모티브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 S1: 칩 seq 데이터 세트의 준비. (A) 디렉터리 아키텍처 정의. (B) 계산 원시 읽기 품질 관리 통계. 읽기의 (C) 트리밍입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 S2: 참조 게놈에. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 S3: 품질 관리 주소로 정렬된 읽기의 교차 상관 물가 태그 clonality 결정. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 S4: 최대 전화. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 S5: 중요 한 봉우리의 주석. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 S6: 게놈 브라우저에서 피크 시각화에 대 한 중요 bedGraph 파일 포맷의 변환. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 S7: 드 노 보 모티브 검색 및 주제 농축. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 S8: 칩 seq 데이터의 생물 정보학 분석 설명 Flow-chart. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
포유류 유전자 조절 네트워크는 매우 복잡 합니다. 칩 seq 게놈 넓은 단백질 DNA 상호 작용을 조사 하는 강력한 방법입니다. 이 프로토콜 Olig2 칩 seq (반응 당 20 천 셀 낮은) 마우스 두뇌에서 순화 OPCs의 낮은 수를 사용 하 여 수행 하는 방법을 포함 합니다. 이 프로토콜에 대 한 첫 번째 주요 단계에서 PDGFRα 항 체와 immunopanning에 의해 마우스 두뇌 OPCs의 정화 이다. PDGFRα 코팅 접시 OPCs의 긍정적인 선택 OPCs는 PDGFRα에 수시로 약하게 바인딩 코팅 판. 여러 세척 후에 여전히 일부 비 부착 한 세포 왼쪽 있습니다. 그것은 현미경으로 세척 후 각 D-PBS는 비 부착 한 세포를 확인 하는 것이 중요입니다. 더 D-PBS 세척 비 부착 한 세포의 수를 줄이기 위해 도움이 되지 않습니다, 그것은 초과 세척 수 첨부 OPCs 꺼내 고 정화 세포의 수확량 감소 이후 선택한 셀을 수집 하는 시간. 그러나, 부족 한 세척 다른 뇌 세포 종류의 오염 될 수 있습니다. 따라서, 모든 시간 후에 격리, 그것은 OPCs 마커 NG2 정량 GFAP 이다, 뉴런에 대 한 Tuj1 와 같은 알려진된 셀 형 특정 유전자의 표정 가진 immunostaining에 의해 격리 OPCs의 순도 평가 하는 데 필요한 PDGFRα OPCs, Iba1 , microglia 및 집 고 양이 MBP myelinating 성숙 oligodendrocytes 그림 2에서 같이, immunostaining 결과 순화 된 세포의 대부분은 NG2 얼룩에 대 한 긍정적인 나타냅니다. 또한, 신경, 이다, microglia 및 myelinating에 대 한 일부 고전적인 셀 형 특정 마커 성숙 oligodendrocytes 전시 탐지 또는 식 수준 순화 OPCs unpurified 뇌 세포 혼합물에 비해 매우 낮은. PDGFRα 전시 unpurified 뇌 세포 혼합물에 비해 순화 OPCs에 높은 식 수준. Immunopanning 메서드를 사용 하 여 microglia unpurified 뇌 세포 혼합물에 비해 순화 OPCs에서 크게 감소 하지만 작은 양의 오염 존재. 이 관측은 다른 사람에 의해 이전 간행물 일치7,,826. 또한, 이전 게시 된 보고서와 비교할 때 상용 키트는이 프로토콜에서 단일 셀 정지로 뇌 조직의 표준화, 효율적이 고 편리한 분리에 대 한 사용 됩니다.
순화 OPCs의 cross-linking 복사해올된 셀 세척 되어야 한다 얼음 HBSS 솔루션 후 나머지 칩 단계 4 ° C에서 실행 되어야 한다, 그렇지 않으면 항 체 수 없다 침전 genomic DNA 제대로.
이 프로토콜에는 다음 핵심 단계는 라이브러리 준비 합니다. PCR 증폭 칩 물자의 도서관 건축을 위해 사용 되었다. 라이브러리 준비에 대 한 PCR 주기 수 시작 하는 DNA의 크기에 따라 달라 집니다. 좋은 라이브러리 준비 필요 입력 DNA의 정확한 정량화를 합니다. 너무 많거나 너무 적은 PCR 주기 PCR 유물으로 이어지는 복잡성 뿐 아니라 도서관 농도 좌우할 수 있다.
그것은 때 immunoprecipitation27에 대 한 제한 된 수의 셀을 사용 하 여 칩 seq 라이브러리를 생성 하 도전 이다. 이전에 사용 된 표준 칩 프로토콜 필요 10 immunoprecipitated DNA 칩 seq 라이브러리 준비1,28의 ng. 그러나 일반적으로 여기에 설명 된 프로토콜 2를 생성 하는, immunoprecipitated에서 20000 OPCs Olig2 항 체에 의해 DNA의 ng. DNA 칩 seq 라이브러리를 준비 하는 수 있습니다 향상 된 감도 immunoprecipitated 증폭 될 DNA의 picograms 허용 단일 단계 어댑터 추가 방법으로 사용 됩니다. 상업 키트를 결합해 서,이 프로토콜 세포의 작은 수에 기반 하는 transcriptional 요인에 대 한 칩 seq를 수행 하는 실용적인 솔루션을 제공 합니다.
중요 한 것은, 낮은 셀 칩 seq 프로토콜 설명 1 차 셀 또는 희귀 세포 인구 또한 다른 녹음 방송 요인의 칩 Seq 적용 됩니다. 이 프로토콜에 사용 되는 항 체 먼저 IP 실험에 의해 구체적으로 실험적으로 검증 될 필요가 있다. 항 체의 비 특정 바인딩 가난한 결과 이어질 것입니다. 또한, 그건 관심의 녹음 방송 요인의 높은 식 수준에 포함 된 셀에이 낮은 셀 칩 seq 실험을 수행 하는 것이 좋습니다.
데이터 분석, 컷-오프 피크 전화 필터링으로 사용할 값을 결정 하는 도전 수 있습니다. 분석의 목표에 따라 엄격한 또는 더 편안 하 게 매개 변수를 사용할 수 있습니다. 일반적으로, 배 농축 및 p-값 또는 루즈벨트의 조합이 사용 됩니다. 연구에서 녹음 방송 요인의 일부 바인딩 사이트 이전 알려졌다, 필터링 임계값 결정에 도움이 될 수 있습니다이. 전사 인자 바인딩 사이트 데이터베이스 다른 세포 라인에 공개적으로 사용 가능한 칩 seq 실험에서 파생 하 고 조건 컴파일된29,30되었습니다. 하나는 유전자에 대 한 검색 하 고 전사 인자 바인딩 사이트 이전 발견 되었습니다 경우 확인 수 있습니다. 그러나, 그것은 전사 인자 바인딩 사이트 세포 유형 및 조건에 따라 다르다는 점에 유의 하는 것이 중요입니다.
칩 seq 실험 하 철에서 보완 메서드는 모티브 농축 분석 및 드 노 보 모티브 검색 MEME 칩20 또는 유사한 프로그램을 사용 하 여. 주제 검색 알려진 종합을 요구 하 고 드 노 보 파생 인코딩 모티브25 또는 Hocomoco 데이터베이스31같은 모티프 데이터베이스. Hocomoco 공개 인간과 마우스 칩 seq 실험에서 발견 하는 모티프 데이터베이스입니다. 모티프 assayed 단백질에 대 한 알려지지 않은, 드 노 보 모티브 검색 새로운 모티프로 중요 한 봉우리에 반복 시퀀스 패턴을 공개 수 있습니다. 녹음 방송 요인의 잠재적인 조합 행동 수 있습니다 공개 때 다른 녹음 방송 요인의 모티브 또한 결과 봉우리에 농축 될 찾을 수 있습니다.
풍부한 피크 영역 컨트롤로 돌연변이 또는 녹아웃 세포의 염색 질을 사용 하 여 실험적으로 검증 수 있습니다. 수행 하는 칩 seq 거짓 긍정적인 봉우리를 식별 하는 데 사용 됩니다 하지 전사 요소를 표현 하는 셀을 사용 하 여, 또한 "유령 봉우리"32로 표시 됩니다. 가양성 필터링 되어야 한다.
그것은 또한 결과 칩 seq 봉우리 transcriptomic 데이터와 비교 하는 흥미로운입니다. PDGFRα-Olig2 칩 seq 봉우리 이전 게시18OPCs에 유전자의 표정을 비교 되었다. OPCs 표현한 유전자 이외의 Olig2 녹음 방송 요인 바인딩 메커니즘에 의해 제어할 수 있습니다이 전략 제한 수 있습니다. 또한, Olig2 녹음 방송 요인 유전자의 규제 지역에 바인딩할 수 있습니다 하지만 유전자 수 수준이 낮은 유전자 표현 가능한 억제 메커니즘으로 인해 또는 부족의 공동 유전자 녹음 방송에 필요한 요인.
칩 seq 전사 인자와 다른 단백질의 게놈 전체 DNA 바인딩 사이트를 식별 하는 데 사용 되는 방법입니다. 그러나, 녹음 방송 요인의 동시 발생의 분석을 통해 연구팀은 녹음 방송 요인 co-regulatory 모듈33를 형성 하는 다른 단백질에 연결 하는 경향이 발견. 즉 transcriptional 요인 간의 일부 바인딩 그리고 genomic DNA 칩 seq 하 여 계시는 간접 적이 고 및 다른 단백질에 의해 브리지. 따라서, 더 의미 있는 결과 달성 하기 위해 연구원 이상의 전사 요소를 동시에 공부 고려해 야 합니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
JQW, XD, RCDD, 그리고 YY는 국립 연구소의 건강 R01 NS088353;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 NIH 그랜트 1R21AR071583-01; Staman Ogilvie 기금-기념 헤르만 재단; UTHealth 뇌 이니셔티브와 CTSA UL1 TR000371; 그리고 텍사스 시스템 신경 과학 대학 Neurotechnology 연구소 (부여 #362469)에서 부여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
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