Summary
Burada genom çapında bağlamasında oligodendrocyte transkripsiyon faktörü 2 (Olig2) Akut arıtılmış beyin oligodendrocyte öncü hücreleri (OPCs) düşük-hücre Kromatin immunoprecipitation (ChIP) gerçekleştirerek analiz etmek için tasarlanmış bir protokol mevcut , Kütüphane hazırlık, yüksek işlem hacmi sıralama ve bioinformatic veri analizi.
Abstract
Memeli hücrelerinde gen transkripsiyonu genomik DNA transkripsiyon faktörlerin etkileşim tarafından bir hücre türü belirli şekilde düzenlenir. Lineage özgü transkripsiyon faktörleri hücre özellikleri ve farklılaşma geliştirme sırasında önemli rollerde oynamak için kabul edilir. Küçük parça ile yüksek-den geçerek DNA sıralama (ChIP-seq) birleştiğinde transkripsiyon faktörleri (veya onun ilişkili kompleks) genom çapında bağlayıcı siteleri için genomik DNA analiz için yaygın olarak kullanılır. Ancak, çok sayıda hücreleri izole Primer hücre veya nadir hücre popülasyonlarının sınırlı sayıda çalışmaya zorlaştırır bir standart çip tepki için gereklidir. Oligodendrocyte soy özgü transkripsiyon düzenleyici mekanizma anlamak için faktör akut arıtılmış fare OPCs, Olig2 (veya Olig2 karmaşık) genom çapında bağlayıcı siteleri tanımlamak için ChIP-seq kullanarak ayrıntılı bir yöntem Olig2 gösterilir. İlk olarak, protokol trombosit-türevi büyüme faktörü reseptör alfa (PDGFRα) arındırmak açıklar fare beyni gelen olumlu OPCs. Daha sonra ChIP Olig2 antikor aracılı ve Kütüphane inşaat yapılmaktadır. Son kısmı bioinformatic yazılım ve Olig2 ChIP-seq çözümlemesi için kullanılan yordamları açıklar. Özet olarak, bu kağıt transkripsiyon faktörü Olig2 akut arıtılmış beyin OPCs genom geniş bağlantıları analiz etmek için bir yöntem bildirir.
Introduction
Protein (ya da protein kompleksi) eğitim önemlidir DNA bağlama ve epigenetik işaretleri transkripsiyon düzenleyici ağlar çeşitli biyolojik süreçlerinde yer alan oluşturmak için. Özellikle, genomik DNA transkripsiyon faktörleri bağlamaları gen düzenlemesi, hücre farklılaşma ve doku gelişiminde önemli bir rol oynayabilir. Transkripsiyon yönetmelik ve epigenetik mekanizmalar çalışmak için güçlü bir araç Kromatin immunoprecipitation (ChIP) olduğunu. Yeni nesil sıralama teknolojisi hızlı gelişmeler sayesinde, küçük parça ile yüksek-den geçerek DNA sıralama (ChIP-seq) birleştiğinde protein-DNA bağlama ve epigenetik işaretleri1analizleri için kullanılır. Ancak, standart bir çip seq protokol cep numarası, izole Primer hücre ve nadir hücre popülasyonlarının gibi sınırlı olduğunda bu tekniğin uygulanması zor yapar reaksiyon, başına yaklaşık 20 milyon hücre gerektirir.
Oligodendrocyte soy hücreleri oligodendrocyte öncü hücreleri (OPCs) ve oligodendrocytes de dahil olmak üzere yaygın beyin dağıtılır ve geliştirme ve beyin fonksiyonu için gereklidir. Öncül hücreleri bir türü olarak OPCs kendini yenileme ve farklılaşma yeteneğine sahiptirler. OPCs sadece oligodendrocytes için ataları olarak hizmet ama nöronal beyin hücreleri2diğer türleri ile iletişim kurarak sinyal yayma de önemli bir rol oynamaktadır. Önceki çalışmalarda oligodendrocyte geliştirme Olig2 ve Sox103,4gibi soy özgü transkripsiyon faktörleri tarafından düzenlenmiştir düşündürmektedir. Bu transkripsiyon faktörleri oligodendrocyte özellikleri ve farklılaşma sırasında onların ifade etkilemek için çok önemli bazı genler organizatörü veya artırıcı bölgelerinde bağlamak için bulunamadı. Ancak, DNA bağlayıcı protein (veya protein kompleksi) Akut arıtılmış birincil OPCs çok sınırlı sayıda hücre ile ilgi tanımlamak için meydan okuyor.
Bu iletişim kuralı, sistematik olarak saflaştırılmış fare OPCs ChIP-seq tekniği kullanarak genom geniş ölçekte Olig2 tarafından genomik DNA immunoprecipitated araştırmak açıklar. OPCs fare beyni gelen akut immunopanning tarafından saflaştırılmış ve nükleer silahların yayılmasına karşı içinde vitroolmadan bir çip deneyinde kullanılan. OPCs sınırlı sayıda immunopanning tarafından elde edilebilir ve standart ChIP-seq deneyler için yeterli değil. Burada, bir düşük hücreli yonga-seq iletişim kuralı ile düşük çip tepki transkripsiyon faktörleri için başına 20 bin hücre olarak tanımlanır. Kısacası, çapraz bağlı hücreler lysed ve Kromatin yamultmak için sonication aygıt tarafından sonicated. Yamultulmuş Kromatin Olig2 antikor yanı sıra protein A kaplı boncuk Olig2 bağlı antikor genomik DNA çökelti inkübe. Protein A kaplı boncuk ve ters cross-linking elüsyon sonra genomik DNA Olig2 antikor tarafından çöktürülmüş fenol kloroform çıkarma tarafından saflaştırıldı. Çarpım sayılabilir ve T-takip için tabi, astar şablon anahtarlama ve uzantısı, ayrıca bağdaştırıcıları ve güçlendirme, Kütüphane boyutu seçimi ve arıtma tavlama ChIP-seq Kütüphane inşaat için adımlar.
Sonra sıralama, Olig2 transkripsiyon faktörü antikor ile hazırlanan örnek ve denetimi örneğini ham okuma kalitesini analiz edildi. Düşük kaliteli baz çifti ve bağdaştırıcısı içeren parçaları kesilmiş okuyun. Sonraki, kesilmiş okuma fare başvuru genom için uyumlu. Çip okuma denetimi örneğini için karşılaştırıldığında, tepeler algılanan için önemli ölçüde zenginleştirilmiş genomik bölgeleri. Potansiyel transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri, temsil eden önemli dorukları filtre ve genom tarayıcıda görüntülenir.
Özellikle, bu protokol için açıklanan yöntemi ChIP-seq sınırlı sayıda herhangi bir hücre türü ile diğer transkripsiyon faktörlerin genel olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan kullanımı ve deneysel protokoller uyarınca Kılavuzu bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için ve kurumsal Biyogüvenlik kurulu ve Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi hayvan refahı Komitesi tarafından onaylanmış Houston.
1. PDGFRα olumlu Oligodendrocyte Lineage hücrelerden fare (yukarıda açıklanan immunopanning protokolleri5,6,7' den değiştirilmiş) beyin saflaştırılması
-
PDGFRα pozitif hücre seçimi ve endotel hücreleri ve microglia tükenmesi için 2 tabak için bir immunopanning plaka hazırlanması.
Not: Lütfen Petri yemekler ama değil hücre kültür yemekleri immunopanning deneme için çalışmak arıtılmış hücre kültürü çalışmalarının için kullanılacaksa, immunopanning adımları Biyogüvenlik kabini yapılmalıdır- 10 cm Petri tabağı 30 µL keçi Anti-IgG içinde sıçan pH 9,5, 50 mM Tris-HCl gecede 4 ° C'de 10 mL ile kat Tabakları yüzeylerinin eşit ve tamamen kaplama çözüm tarafından tutulduğundan emin ol için plaka kışkırtmak.
- PDGFRα antikor çözüm sulandrarak 40 µL fare anti-PDGFRα antikor, 12 mL % 0,2 BSA içeren Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) ile hazırlayın.
- 1 x DPBS her, kaplı IgG plaka 10 mL ile 3 yıkamadan sonra IgG kaplı plakalı PDGFRα antikor çözüm, oda sıcaklığında 4 h için kuluçkaya.
- Yıkama fare anti-PDGFRα antikor kaplı levha 3 kez ile 10 mL 1 x DPBS. Yavaşça DPBS çözüm plaka yan duvar boyunca ekleyin ve kaplamalı yüzeyler rahatsız etmeyin.
- Endotel hücreleri ve microglia tükenmesi ile DPBS Banderiaea simplicifolia lektin 1 (BSL-1) 2 h için 2,3 µg/mL içeren 20 mL 2 yeni 15 cm Petri tabak kat.
- Yıkama BSL-1 kaplı 3 kez ile 20 mL 1 x DPBS tabaklar. Yavaşça DPBS çözüm plakaların yan duvar boyunca ekleyin ve kaplamalı yüzeyler rahatsız etmeyin.
-
PDGFRα arıtma olumlu oligodendrocyte lineage hücreleri daha önce yayımlanmış yöntemleri6 ' dan değiştirilme tarihi , 7 , 8.
- 2 Doğum sonrası kortikal dokulardan gün 7 (P7) teşrih fare beyinliler göre daha önce yayımlanmış protokolleri5,6.
- Bir tek hücre süspansiyon sinir dokusu ayrılma Kit (P) ile detaylı üreticinin talimatlarına göre oluşturmak için doku ayırmak.
- Kısaca, disseke kortikal dokular bir neşter ile parçalar halinde kesilmiş ve onları 37 ° C'de Enzimatik sindirim için tabi Sindirim sonra el ile Pasteur bir tek hücre süspansiyon Pipetler yangın cilalı cam parçaları ayırmak.
- Tek hücreli süspansiyon vasıl 300 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi ve 15 mL immunopanning arabellek kullanarak hücre Pelet askıya alma (immunopanning arabellek ise %0,02 BSA ve 5 µg/mL insülin ile DPBS).
- 2 fare beyni sırayla 15 dakika plaka her 5 dk nazik ajitasyon ile oda sıcaklığında 2 BSL-1 kaplı plakalar üzerinde gelen tek hücre süspansiyon microglia ve endotel hücreleri daha iyi tükenmesi sağlamak için kuluçkaya.
- Yavaşça hücre süspansiyon yapışık olmayan hücrelerde toplamak ve onları oda sıcaklığında 45 dk için fare-PDGFRα antikor kaplı levha üzerinde kuluçkaya plaka girdap.
- Fare-PDGFRα antikor kaplı plaka üzerinde hücre süspansiyon kuluçka sonra yavaşça hücre süspansiyon toplamak için plaka girdap ve yapışık olmayan hücrelerden kurtulmak için 8 kere DPBS plakalı durulayın. Yavaşça plaka yan duvar boyunca yıkama çözüm ekleyin ve plaka yapışık olmayan hücrelerden kurtulmak için birkaç kez tahrik.
- 37 ° C'de 10 dakika 4 mL hücre dekolmanı çözüm tedavi kullanarak fare-PDGFRα antikor kaplı plaka hücrelerden ayırmak Yapışık hücreleri çıkarmak için plaka sallamak.
- Santrifüjü 300 x g oda sıcaklığında de tarafından arıtılmış OPCs toplamak, hücre Pelet 2 mL OPC hücre kültür orta ile askıya alma ve trypan mavi ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak (500 mL hücre kültür ortamıdır 5 mL içeren DMEM/F12 orta penisilin-streptomisin çözüm (P/S), 5 mL N2, 10 mL B27, 5 µg/mL insülin, % 0,1 BSA, 20 ng/mL bFGF ve 10 ng/mL PDGFRα).
-
İmmunopanning sonra doğrulama OPCs saflık.
- OPCs zenginleştirme immunopanning sonra değerlendirmek için bazı saf OPCs RNA çıkarılması ile üreticinin yönergelerine uygun bir guanidium göre thiocyanate çekimi için kullanır.
- QRT-PCR ile karşılaştırıldığında Disosiye beyin hücreleri daha önce yayımlanmış malzemeler4göre saf OPCs PDGFRα ifadede zenginleştirme denetlemek için ana floresan yeşil boya karışımı kullanarak gerçekleştirin.
- Ayrıca, bazı saf OPCs Poli-D-kaplı lizin tohum 24 de immunostaining anti-NG2 kondroitin sülfat proteoglikan (NG2) antikor ile daha önce malzemeler9Yayınlanan tabaklar.
2. düşük hücreli yonga hazırlık ve çip Kütüphane inşaat yüksek üretilen iş sıralama için
-
Olig2 düşük hücreli yonga hazırlık bir piyasada bulunan sonication sistemi ve ticari olarak mevcut düşük cep numarasını çip kit (tablo malzemeleri görmek) ayrıntılı standart yordamlar üreticisinin yönergeleri takip ederek.
- Fare anti-PDGFRα ayırma sonra antikor kaplı plaka ve trypan mavi ve bir hemasitometre ile sayma hücre 20.000 arıtılmış OPCs 1 mL OPC hücre kültür orta her çip tepki için koymak.
- Oda sıcaklığında 10 dakika için hücre süspansiyon düzeltmeye %36,5 formaldehit 27 µL ekleyin.
Dikkat: Lütfen formaldehit kimyasal duman mahallede güvenlik nedeniyle kullanılması gerektiğini unutmayın. - Oda sıcaklığında 5 min için 50 µL 2.5 M glisin ile DNA-protein cross-linking durdurmak.
Not: Tüm adımları buz üzerinde veya bu noktadan itibaren 4 ° C soğuk odada yapılmalıdır. - 1 mL, buz gibi Hanks dengeli tuz çözüm (HBSS) ile proteaz inhibitörü ile çapraz bağlı hücre topakları kokteyl yıkama ve 300 x g 4 ° C'de de önceden soğutmalı santrifüj tarafından pelleted hücreleri almak
- Hücre Pelet 25 lyse µL on Ice 5 min için lizis arabellek tamamlamak.
Not: lizis arabellek hücrelerde askıya almak için tüp kışkırtmak. - Ek hücre 75 µL proteaz inhibitörü kokteyl ve kayma içeren HBSS hücre lysate tarafından Kromatin 30 s ON ve OFF programı 30 s sonication sistemi 5 çevrimleri ile önceden soğutmalı buz gibi lysate. Her zaman birlikte 6 tüpler solüsyon içeren temizleyicide ve denge tüpler 100 µL su içeren emin olun.
- Kesme sonra 14.000 x g 10 dk 4 ° C de santrifüj kapasitesi ve yeni bir tüp süpernatant Santrifüjü sonra toplamak.
- Yamultulmuş Kromatin 100 µL proteaz inhibitörü ile buz gibi tam çip tampon eşit hacmi ile sulandırmak.
- Seyreltilmiş yamultulmuş Kromatin 20 µL giriş denetimi örnek kaydedin.
Not: Giriş denetimi örneğini de karşılaştırma için Olig2 immunoprecipitated örnek Olig2 antikor immunoprecipitated DNA tanımlamak için gereklidir. - Tavşan anti-olig2 antikor, seyreltilmiş 180 µL için 1 µL Kromatin sheared ve tepki tüp 16 h 4 ° C'de 40 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde kuluçkaya ekleyin
Not: soğuk bir odada bu adımı gerçekleştirin. - Her küçük parça tepki için 11 µL manyetik protein A kaplı boncuk 55 µL ile yıkayın boncuk yıkama tamponu ve yerine boncuk boncuk yıkama arabellek 11 µL içinde 2 yıkamadan sonra cips.
Not: soğuk bir odada bu adımı gerçekleştirin. - Her küçük parça tepki için önceden yıkanmış Protein A kaplı boncuk 10 µL çip tepki tüp için ekleyin. Soğuk bir odada bu adımı gerçekleştirin.
- ChIP tepki tüp dönen bir tekerlek başka bir 2 h için 4 ° C'de kuluçkaya.
- ChIP tepki tüp 1 dk. için manyetik raf koymak.
Not: soğuk bir odada bu adımı gerçekleştirin. - Süpernatant kaldırmak ve boncuk Pelet çıkarmak yok.
- Her biri 4 yıkama arabelleklerini sırasıyla 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde 4 dk için boncuk Pelet 100 µL ile yıkayın
- Yıkar sonra 200 µL elüsyon arabelleği boncuk Pelet ekleyin ve çip tepki tüp kullandığında protein-DNA tersine çevirmek 4 h için 65 ° C'de kuluçkaya.
- Ayrıca, elüsyon arabelleği 180 µL 20 µL giriş denetimi örnek için ekleyin ve hibrid protein-DNA de tersine çevirmek 4 h için 65 ° C'de kuluçkaya.
- 200 µL 25:24:1 (v/v) fenol, kloroform ve izoamil alkol karışımı her çip tepki tüp ekleyin.
- 1 dk ve 15 dakika oda sıcaklığında 13.000 x g, santrifüj için şiddetle girdap. Üst aşaması için yeni bir tüp aktarın.
- 40 µL 3 M sodyum asetat çözüm, 1.000 µL % 100 etanol ve mavi boya her çip tepki Tube-20 ° C'de gecede kovalent bağlı 2 µL olan glikojen precipitant ekleyin
- 4 ° C'de 20 dk için 13.000 x g, santrifüj
- Süpernatant atmak, 500 µL soğuk % 70 etanol ile yıkayın ve 13.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de santrifüj kapasitesi
- Süpernatant atmak, pelet hava 10 dakikadır kuru tutun ve Pelet 50 µL su ile çözülür.
-
Çip Kütüphane inşaat yüksek üretilen iş sıralama için
- Temiz ve üreticilerin talimatlara göre bir temizlik kiti ile çip DNA konsantre.
- ChIP örnek bir pico-yeşil üreticinin yönergelerine uygun olarak ölçmek.
- T-takip, çoğaltma ve takip, şablon anahtarlama ve uzantısı, ayrıca bağdaştırıcıları ve güçlendirme, Kütüphane boyutu seçimi ve arıtma üreticinin talimatlarına göre bir çip seq seti kullanın.
- DsDNA denatürasyon sonra ssDNA 3' sonu karides alkalen fosfataz tarafından dephosphorylate ve Poli (T) kuyruğu için ssDNA tarafından terminal deoksinükleotidil transferaz ekleyin.
- DNA ikileşmesi ve şablon anahtarlama için ssDNA şablon DNA Poli (dA) astar tavlamak.
- Şablon anahtarlama sonra dizin oluşturma için ileriye ve geriye doğru astar tarafından PCR ChIP-seq kitaplıkla yükseltmek.
- PCR 250 500'e değişen parçaları ile ChIP-seq Kütüphane güçlendirilmiş seçin bp tarafından seçenek 2 çift boyutu seçimi için tarafından paramagnetic boncuk.
- Bir mikrosıvısal çip-kılcal Elektroforez cihazı kullanarak seçili ChIP-seq kitaplığı kalitesini inceleyin.
3. veri analizi
- Dizin yapısını hazırlamak.
- ChIP-seq veri analizi gerçekleştirmek için bir dizin oluşturun. Yeni oluşturulan dizini içinde aşağıdaki adlarla altı alt dizinler oluşturabilirsiniz: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis ve raporlar.
- Verileri hazırlamak ve ham sıralı veri kalite kontrol analizi gerçekleştirin.
- "Raw.files" dizinine taşıyın ve ChIP-seq veri dosyalarını yükleyin.
- Dosya adlarını doğrulayın. Nasıl yapılacağını eşleştirilmiş uç olsaydı, benzer temel adlara sahip 4 dosyaları (iki tedavi için) ve iki giriş için olacak: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq ve PDGFRα_input.read2.fastq. Dosya adları farklıysa, onları "mv" komutunu kullanarak yeniden adlandırın.
- "Fastqc.output" dizinine taşıyın.
- Kalite kontrol ölçümleri kullanarak fastq dosyasını kalite kontrol yazılım10ham okuma elde edilir. Her fastq dosya için ayrı ayrı kalite kontrol süreci çalıştırmak için Şekil S1A içinde komutunu kullanın. Yazılım bir html dosyasında birkaç kalite kontrol ölçülerini görüntüler.
- Html kalite kontrol dosyasını açın ve okuma, numarasının doğru olup olmadığına okumak uzunluğu, temel sıra kalite, sıra Kalite Puanları, sıra GC içeriği, sıra çoğaltma düzeyleri, bağdaştırıcı içerik ve kmer içerik başına ücret.
- Sondaki düşük kaliteli okuma ve bağdaştırıcı içeriği kırpın.
- "Başına temel sıra kalitesi" ve "Bağdaştırıcısı içerik" araziler gözlemlemek. Baş ve kuyruk her okuma kesme uzunluğunu belirleyin. Bir yeterli için kırpma nerede 30 altında temel kalite düşer ve bağdaştırıcı içerik kanıtı olabilir.
- "Raw.files" dizinine taşıyın.
- Download ve install a bilgisayar yazılımı için kırpma okunma11. Şekil S1B içinde ayrı ayrı tedavi ve giriş için kırpma komutunu seçin. Parametre 'Ürün' düzeltme sondan üsleri ve 'HEADCROP' okuyun başından itibaren ortadan üslerinin belirtir sonra kalan okuma uzunluğunu gösterir.
- Düzeltme komutu da okuma parametresi 'MINLEN' süzme sonra kabul edilmesi için uzunluğu en az içerir. Eğer okuma en az 50 bp, kullanım 35 bp okuma uzunluğu eşik olarak.
- "Fastqc.output" dizinine taşıyın.
- Okuma kırparak sonra fastq dosya kalite kontrol çözümlemesi gerçekleştirin. Kalite kontrol sorunların çözüldüğünü doğrulayın. Kalite kontrol ölçümleri elde etmek için Şekil S1C içinde komutunu kullanın.
- Tek taraflı kenar hizalama veya eşleştirilmiş uç ChIP-seq fare başvuru genom okur.
- "Bowtie.output" dizinine eşleme için taşıyın.
- GENCODE mm10 fare başvuru genom indirin. Mm10 fare başvuru genom "mm10.fa" yeniden adlandırın.
- Bir okuma Eşleştiricisi12 download ve install o içinde belgili tanımlık sistem.
- Şekil S2Aiçinde komutuyla indirilen başvuru genom bir dizin oluşturulur. Altı dosyaları otomatik olarak oluşturulur: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 ve mm10.rev.2.bt2.
- Şekil S2B içinde hizalamayı çalıştırmak ve değerin ayarlanmasını komutunu "-p" sistem ayarlarınıza göre işlemci çekirdek sayısı. Eşleştirilmiş uç modunda çalışıyorsa, parametreleri "-1" ve "-2" kesilmiş fastq dosyaların adlarını belirtir.
Not: Eşleme tedavi ve giriş örnekleri için ayrı ayrı gerçekleştirilir ve çıkış metrik günlük dosyaları her örnek için oluşturulur. - Download SAM biçimi13 dosyaları değiştirmek için a bilgisayar yazılımı ve install o içinde belgili tanımlık sistem. Hizalanmış SAM eğe istimal belgili tanımlık buyurmak Şekil S2Ciçinde bir BAM dosyasına dönüştürün.
- Kalite kontrol ölçümleri eşlenen okur her iki eşleştirilmiş uç tedavi ve kontrol örnekleri için arama zirve önce edinin.
- Bir adres için en önemli kalite kontrol ölçütleri sıralama derinliğidir. Dosya "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" ve "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" bowtie.output dizininde açın ve her örnek benzersiz olarak eşlenen okuma çiftlerinin sayısı 10 milyon büyük olduğundan emin olun.
- "Homer.output" dizinine taşıyın.
- Motif bulma ve yeni nesil sıralama analizi14 için a bilgisayar yazılımı download ve install o içinde belgili tanımlık sistem.
- "TagDir" adlı bir dizin oluşturun.
- Etiket clonality doğrulamak için Şekil S3Aiçinde tasvir komutunu kullanın. "MakeTagDirectory" komutu dört kalite kontrol çıkış files:tagAutocorrelation.txt, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt ve tagLengthDistribution.txt oluşturur.
- "TagDir" dizinine taşıyın.
- "TagCountDistribution.txt" dosya "raporlar" dizinine kopyalar.
- "Raporlar" dizinine taşıyın.
- Bir elektronik tablo programı kullanarak tagCountDistribution.txt dosyasını açın ve bir çubuğu oluşturmak arsa etiket genomik pozisyon başına sayısı. "Tag.clonality.xlsx" adı ile çubuk grafik dosyasını depolamak.
- R dil15 içinde belgili tanımlık sistem programlama yükleyin.
- Terminal, 'R' yazın ve R programlama ortamına erişmek için ENTER tuşuna basın.
- ChIP-seq veri16 işlemek için bir R paketini karşıdan yükle ve Şekil S3Biçinde tasvir komutunu kullanarak yükleyin.
- R komut dosyası Şekil S3C içinde strand çapraz korelasyon çizmek için kullanın.
- Tepe mapper kullanarak tepeler olarak algılanması.
- "Macs2.output" dizinine taşıyın. Karşıdan yükleyip bir tepe Eşleştiricisi17 içinde senin sistem.
- 3.4.6. adımda oluşturulan BAM dosyaları kontrol ve işlevi "callpeak" ile tedavi kullanın.
Not: Diğer parametreler yer "-f" giriş dosya biçimi için "-g" genom büyüklüğündeki için "-adı" için tüm çıkış dosyalarının temel adını gösteren ve "-B" parçası zincirleme kaza bedgraph biçiminde depolamak için. Komutu çağırmadan tam tepe Şekil S4Aiçinde bulunur. Eşleştirilmiş uç örnekler için BEDPE kullanın. - Tepe Eşleştiricisi altı dosyaları oluşturulan doğrulayın: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg ve PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
- Açık dosya denilen tepeler, konum, uzunluk, zirve pozisyon, zincirleme kaza ve tepe zenginleştirme ölçümleri görüntülemek için PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls:-log10(pvalue), zenginleştirme ve - log10(q-value) kat.
- Filtre ve aranan tepeler ek açıklama ekleyebilirsiniz.
- Önceki adımda açık dosyası kullanarak, elde edilen doruklarına kat zenginleştirme, p-değeri ve/veya q değeri göre filtre uygulayın. Yeterli filtreleme eşikleri karar her metrik yoğunluğunu belirlemek için bir çubuk grafik çizim yapın. Değerleri önemli dorukları elde etmek için seçilen bir eşiğin altına filtre.
- (Bölgeler yapay olarak yüksek sinyal olduğu bilinmektedir) mm10 kara indirmek ve herhangi bir objeyi bölgelere iç olan çip seq filtre doruklarına.
- Aşağıdaki sütunları içeren filtre uygulanmış zirveleri ile bir yatak oluşturarak: kromozom, başlangıç, bitiş, peakID, sahte ve strand. Doldurmak belgili tanımlık alay etmek sütun ile bir nokta "." değil kullanılır beri. Strand sütun, tüm değerleri ayarlamak "+". Yatak dosyayı "filtered.peakData2.bed" kaydedin.
- "Filtered.peakData2.bed" dosyasını "raporlar" dizine kopyalayın.
- "Raporlar" dizinine taşıyın.
- Filtre uygulanmış tepeler için belirli bir gen bölgesi ek açıklama eklemek için "önceki adımda oluşturduğunuz annotatePeaks" yatak dosyayla işlevini kullanın. Kullanılan komut içinde Şekil S5Agösterilmiştir.
- İstatistiksel bir yazılım kullanarak "filtered.annotatedPeaks.txt" dosyasını açın.
- Elde edilen tepeler bir ek açıklama eklenen TSS üzerinden 5 kb daha büyük bir mesafeden bir intergenic bölgesinde yalan filtre. "Mesafeyi-TDH" sütun dosyanın içinde mesafe olarak filtre uygulamak için kullanın. Filtre uygulanmış tepeler "5kbup.geneBody.peakData.txt" isimli excel dosyasında depolar.
- Sonuç deposu doruklarına sütunlarla bir bedGraph dosyasında filtre: kromozom, başlangıç, bitiş ve - log10(q-value). "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph" dosya adı.
- Tarayıcı görselleştirme için önemli dosyaları üretir.
- Download ve install a bilgisayar yazılımı için genom aritmetik18.
- Bedgraph önemli için dönüştürmek için bir araç karşıdan yükleyip içinde belgili tanımlık sistem. 'Mm10.chrom.sizes' dosyasını indirin.
- Bir önemli dosyası oluşturmak için Şekil S6A içinde komutunu kullanın.
- Karşıdan yükleyip bir genom tarayıcı19 içinde belgili tanımlık sistem.
- Genom tarayıcı açın ve filtre uygulanmış önemli dorukları ve konumlarını ilgili olarak bilinen genlerin görselleştirmek için "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" dosyasını yükleyin.
- Motif arama.
- "Motif.analysis" dizinine taşıyın.
- Bir de novo motif tarama ve motif zenginleştirme programını download ve install o senin sistem20.
- Olig2 motifleri içerir bir kapsamlı motifi veritabanı indirin.
- Önemli zirve zirve merkezli 500 bp bölgeleri genom dizileri elde edilir. Dizileri peak.sequences.txt depolar. Belgili tanımlık buyurmak Şekil S7 içinde Olig2 motifleri her 500 kan basıncı en yüksek bölgede içinde aramak için kullanın.
- Yeterli bir E değeri kullanarak elde edilen motifleri filtre (varsayılan = 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Düşük-hücre ChIP-seq gerçekleştirilmiş ve transkripsiyon faktörü Olig2 potansiyel etkileşimleri ile genomik DNA'akut arıtılmış beyin OPCs araştırmaya bioinformatic analizleri yapıldı. Şekil 1 deneysel ve veri analiz prosedürleri genel bir iş akışı gösterilmektedir. Bu protokol için doğum sonrası fareler beyin bir tek hücre süspansiyon ayrışmış. Sonra doku ayrılma, immunopanning OPCs PDGFRα antikor kullanarak arındırmak için gerçekleştirildi. Şekil 2 gösterir PDGFRα, nöron işaretleyicinin Tuj1 küçük ifade (nöron özgü sınıf III beta-tübülin) önemli zenginlik, astrocyte marker GFAP'nin (gliyal fibrillary asidik protein), microglia işaretçisi iyonize kalsiyum bağlama adaptörü molekül 1 (Iba1), myelinating olgun oligodendrocytes işaretçisi miyelin temel protein (Mbp) ve miyelin oligodendrocyte glikoprotein (Mog) saf OPCs dan gibi RT-qPCR tarafından değerlendirildi. Ayrıca, immunostaining sonuç NG2 Şekil 2' de gösterildiği gibi pozitif hücreleri çoğu gösterir. Daha sonra reaksiyon başına 20 bin saf OPCs formaldehit tarafından tespit edildi ve Kromatin sonication sistemi kullanılarak güdülmesini. Olig2 düşük hücreli yonga gerçekleştirilmiş ve Kütüphane inşa edilmiştir. ChIP Kütüphane hazırlık sonra oluşturulan ürün kalitesini bir mikrosıvısal çip-kılcal Elektroforez aygıt tarafından doğrulandı. Şekil 3 Olig2 düşük hücreli yonga kitaplığının bir örnek electropherogram gösterir. 250 500'e kadar açık en yüksek Oligo2 Kütüphane ürün bp Kütüphane PCR ürün boyutu seçimden sonra görünür olmalı. Her iki örnek Olig2 transkripsiyon faktörü antikor ve denetimi örneğini ile hazırlanan ChIP-seq kütüphanelerin tabi tutuldu eşleştirilmiş uç 50 üretmek için yüksek üretilen iş sıralama sıralama okuma döngüsü. Uzun okuma uzunlukları eşleme oranlarını artırmak ve sıralama maliyeti pahasına çok eşleme olasılığını azaltır. 50 bp ChIP-seq eşleştirilmiş uç sıralama kitaplıklarıyla genellikle iyi sonuçlar elde edilir.
Ham okuma ve adaptörler kırparak ve düşük kaliteli baz çifti izleyen ilk kalite kontrol değerlendirme sonra kalite kontrol araziler şekil 4' te tasvir edilmektedir. Kesilmiş okuma temel kalite 30'dan, hayır bağdaştırıcısı ard arda geliş, büyük ve düşük çoğaltma oranına (şekil 4B-D) sahip olmalıdır. Kaliteli kesilmiş okur Genel hizalama oranı artacak. GC içerik gibi diğer parametreleri de önemlidir ve kırpma için düşünülmelidir.
Bir kez sıralama örnekleri hizalanır, sıralama derinlik doğrulamak gereklidir. Bu zayıf siteleri istatistiksel olarak daha anlamlı21olacak beri aranan tepeler sayısını ile daha yüksek bir sıralama derinliği artıracak bilinmektedir. Bir doygunluk analiz için kullanılan, zaman ve bütçe pahasına her belirli transkripsiyon faktörü yeterli bir sıralama derinliği belirlemek için gereklidir. Transkripsiyon faktörü bağlama için bir fikir birliği sıralama derinliği memeli örnekleri ile ilgili KODLA Konsorsiyumu tarafından önerilen: en az 10 milyon benzersiz olarak eşlenen okuma için her biri en az iki biyolojik22çoğaltır. Genel hizalama oranı ve benzersiz olarak eşlenen okur sayısı okuma Eşleştiricisi tarafından hesaplanır. İyi eşleştirme ölçütleri örneği şekil 5A' gösterilir. Etiketi clonality da bir yeterli kitaplığı karmaşıklık gösteren farklı genomik konumlara hizalanmış okuma eşlenmiş olması gereken. KODLA Konsorsiyumu hizalanmış okuma sayısı 10 milyon en az % 80'i farklı genomik bölge22' ye eşlenmiş olması gereken öneriyor. Şekil 5B okuma fazla % 90 tek genomik konuma eşlenen bir yeterli etiketi clonality gösterir. Düşük karmaşıklık kütüphaneleri genellikle yeterli DNA elde edilir ve PCR güçlendirilmiş parçaları art arda sıralı meydana gelir. Düşük karmaşıklık kitaplığa yüksek yanlış en yüksek algılama hızını ortaya çıkarır.
Eşleştirilmiş uç ChIP-seq veri kullanırken, transkripsiyon faktörü belli bir mesafe ayrılması ile çevresinde parçaları bağlayın. Eşleştirilmiş uç sıralama daha fazla bağlama oluştuğu genomik bölgeler daha iyi bir tahmini verimli kötü parçası uzunluğu daha doğru bir tahmin için izin verir. Strand korelasyon arsa zenginleştirme baskın parçası uzunluğu için karşılık gelen bir zirve gösteriyor. Şekil 5Ciçinde gözlenen hesaplanan parça uzunluğu 130 olduğu bp okuma uzunluğu 50 ise kan basıncı. Bir çip seq dataset parçası uzunluğu okuma uzunluktan daha uzun nerede kaliteli16göstergesidir.
Tepe arama genomik bölgeleri transkripsiyon faktörü (veya onun karmaşık) bağlı muhtemeldir listesi çıktı. Genomik bölgeler veya doruklarına listesi, genom tarayıcıda görüntülenebilir bir "yatak" dosyasında bulunur. Her zirve için bu dosyayı içeren bir tepe kimliği, en yüksek zirvesi genomik konumunu ve FDR olarak - log10 (q-değer). Önemli ölçüde zenginleştirilmiş zirveleri daha yüksek kat-zenginleştirme ve önemi ölçümleri ile bunlar. Çıkış tepe dosyası örneği şekil 6Aiçinde gösterilir. Önemli dorukları özel eşikleri kullanarak, zirveleri KODLA'ın kara23içinde filtreleme ve tanımlayan bir genin organizatörü bölge (5 kb ters yönde ve bütün gen vücut) içinde doruklarına seçtikten sonra bir "önemli" dosya tepeler bir genom görüntülemek için yararlıdır Tarayıcı. En zengin en yüksek bölgeler transkripsiyon faktörü bağlama daha yüksek bir olasılık var. Tepe varlığı bilinen transkripsiyon faktörü yasal bölgelerde yanı sıra tepe devamsızlık transkripsiyon faktörü bağlama olası nerede bölgelerde onaylamak önemlidir. Şekil 6B -E gen bölgeleri ve tepe zenginleştirme yanı sıra konumlarına KODLA organizatörü bölgeleri ile ilgili olmayan örnekler gösterir.
Silico tamamlayıcı ChIP-seq Experiment yöntemlerdir motifi zenginleştirme analizi ve de novo motifi arama. OPCs bağlamasında Olig2 önce araştırılmamıştır Olig2 ChIP-seq motor nöron progenitör hücre Peaks'e türetilen ve embriyonik kök hücre için de novo motifi kimlik4,24kullanılmıştır. Olig2 tespit de novo motifleri kapsamlı KODLA motifi veritabanı25 için eklenen ve motif zenginleştirme analiz gerçekleştirildi. Yüksek zenginlik de novo OLIG2 motifleri tespit ve bilinen transkripsiyon faktörü (HDAC2, SP1'i, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5 ve ASCL1) motifleri saf PDGFRα hücreleri ChIP-seq doruklarına bulundu. Bir zenginlik < 0,05 E-değeri olan 30 tespit de novo motifleri keşfedilmiştir. Şekil 7 Olig2 ilk iki tespit de novo motifleri gösterir. Bu iki tespit de novo Olig2 motifler bulunan > ChIP-seq doruklarına % 60'ı elde edilen saf PDGFRα hücrelerden Ayrıca bilinen motifler için.
Şekil 1: Protokolü iş akışı genel bakış. PDGFRα pozitif OPCs doğum sonrası fare beyni izole edildi ve Olig2 çipi tabi tutuldu deneme. Çöktürülmüş DNA parçalarının çip Kütüphane hazırlamak için kullanıldı. Kütüphane kalite değerlendirmesi sonra örnekleri sıralama için kullanılmıştır. Veri kümeleri analiz edildi ve tepeler tespit edilmiştir, OPC potansiyel Olig2 bağlayıcı siteleri gösteren hücreleri saf. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: immunopanned OPCs qPCR ve immunostaining tarafından saflığı değerlendirilmesi. (A) PDGFRα antikor immunopanned hücreleri tohumlari ve immunostaining gerçekleştirilen OPC lineage marker NG2 antikor kullanarak. Mavi: DAPI, yeşil: NG2. Ölçek çubuğu 10 µm nöron işaret Tuj1 saf OPCs (PDGFRα +) ve Disosiye beyin hücreleri (mix) göreli ifade düzeyi değerlendirildi. (B) =. Disosiye beyin hücreleri Tuj1 ifadede 1 olarak ayarlandı. (C) astrocyte göreli ifade düzeyini işaret GFAP'nin saf OPCs (PDGFRα +) ve Disosiye beyin hücreleri (mix) değerlendirilmiştir. Disosiye beyin hücreleri GFAP'nin ifadede 1 olarak ayarlandı. (D) OPC göreli ifade düzeyini işaret PDGFRα saf OPCs (PDGFRα +) ve Disosiye beyin hücreleri (mix) değerlendirilmiştir. Disosiye beyin hücreleri PDGFRα ifadede 1 olarak ayarlandı. (E) myelinating olgun oligodendrocytes işaretçisi göreli ifade düzeyini Mog saf OPCs (PDGFRα +) ve Disosiye beyin hücreleri (mix) değerlendirilmiştir. Disosiye beyin hücreleri Mog ifadede 1 olarak ayarlandı. (F) myelinating olgun oligodendrocytes işaretçisi göreli ifade düzeyini Mbp saf OPCs (PDGFRα +) ve Disosiye beyin hücreleri (mix) değerlendirilmiştir. Disosiye beyin hücreleri MBP ifadede 1 olarak ayarlandı. (G) göreli ifade düzey microglia işaretleyicinin Iba1 saf OPCs (PDGFRα +) ve Disosiye beyin hücreleri (mix) değerlendirildi. Disosiye beyin hücreleri Iba1 ifadede 1 olarak ayarlandı. B-G verilerde onaylatılacak deneyler temsil ve hata çubukları standart hata gösterir. T-test çözümleme * P < 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Olig2 düşük hücreli yonga kitaplıktan bir örnek electropherogram. Çift boyut seçimden sonra Olig2 çip Kütüphane kalitesini bir mikrosıvısal çip-kılcal Elektroforez aygıt tarafından analiz edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: 50 bp okuma uzunluğu düşük hücreli yonga-seq örnek için temsilci kalite kontrol sonuçları. (A)Özet Tablo okuma toplam sayısını, kalitesiz okur, sıra uzunluğu ve genel GC içeriği gösteren. (B) arsa okuma farklı pozisyonlarda temel kalite derecelerin dağılımını gösteren. (C) arsa potansiyel bağdaştırıcısı içerik okunma içinde farklı pozisyonlarda gösterilen. (D) satır yüzdesini gösteren arsa dizileri çoğaltılamaz. Okur çoğunluğu sadece kütüphane içinde bu nedenle düşük çoğaltma oranı veya yüksek Kütüphane karmaşıklık gösteren bir kez ortaya çıkan diziler kaynaklanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: kalite kontrol ölçümleri elde edilen en yüksek aramadan önce: bowtie2 hizalama ölçümleri, çapraz korelasyon strand ve tag clonality. (A)hizalama ölçümler elde edilen okuma eşleştiricisinden. En önemli ölçütleri "önemlisi tam olarak 1 kez Hizala" ve genel hizalama oranı belirtilen benzersiz olarak eşlenen okuma çiftleri vardır. (B) çubuk grafik etiket clonality gösterilen. Çubuklar genomik pozisyonlar Etiketler bulunduğu yüzde gösterir. (C) kaliteli verileri gösteren bir çapraz korelasyon arsa örneği. Kırmızı çizgiler okuma uzunluğu 50 bps ve baskın parçası uzunluğu 130 bps tasvir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: ChIP-seq en yüksek bölgeler ve genom tarayıcı sayısı farklı genomik yerlerde önemli ChIP-seq zirvesinin. (A)örnek tepe arayan ile tanımlanan en yüksek bölgeler. (B) önemli ChIP-seq doruklarına Cspg4, bilinen bir OPC marker gen gen vücudunda bulundu. (B) hiçbir ChIP-seq doruklarına organizatörü bölgelerde veya Mbp gen, olgun oligodendrocytes, (C) Tubb3, nöronal hücre marker, avans veya (D) GFAP'nin, astrocytes, bir hücre marker gen organlarının içinde bulunamadı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: son derece zenginleştirilmiş tespit de novo motifleri Olig2 PDGFRα-Olig2 ChIP-seq Peaks'e bulundu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil S1: ChIP-seq veri kümeleri hazırlanması. (A)dizin mimarisi tanımı. (B) hesaplama ham kalite kontrol ölçümleri okuyun. (C) düzeltme okur. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Şekil S2: okuma için başvuru genom hizalamasını. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Şekil S3: kalite kontrol adresine hizalanmış okur çapraz korelasyon strand ve etiket clonality belirlemek. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Şekil S4: zirve çağrı. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Şekil S5: önemli zirvesinin ek açıklama. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Şekil S6: önemli tepe görselleştirme genom tarayıcı için bedGraph dosya biçimi dönüştürme. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Şekil S7: De novo motifi arama ve motif zenginleştirme. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Şekil S8: ChIP-seq veri Biyoinformatik analizi açıklayan Flow-chart. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Memeli gen düzenleme ağları çok karmaşıktır. Çip seq genom çapında protein-DNA etkileşimleri araştırmak için güçlü bir yöntemdir. Bu protokolü nasıl fare beyni (gibi düşük tepki başına 20 bin hücre) saf OPCs düşük bir dizi kullanarak Olig2 ChIP-seq gerçekleştirileceği içerir. Bu iletişim kuralı için önemli bir ilk adım OPCs fare beyni PDGFRα antikor ile immunopanning tarafından gelen arıtma olduğunu. OPCs kaplı PDGFRα plakalı pozitif seçim için PDGFRα OPCs kez zayıf bağlama plakaları kaplı. Birkaç yıkamadan sonra bile, hala bazı yapışık olmayan hücreler sol vardır. Yapışık olmayan hücreleri her D PBS sonra mikroskop altında yıkayın kontrol etmek önemlidir. Daha fazla D-PBS yıkama yapışık olmayan hücre sayısını azaltmak için yardımcı olmazsa, fazla yıkama ekli OPCs çıkarmak ve arıtılmış hücre verim azaltmak olabilir beri Seçili hücreleri toplamak için zamanı. Ancak, yetersiz yıkama diğer beyin hücreleri türleri kontaminasyon oluşabilir. Bu nedenle, yalıtım sonra her zaman immunostaining OPCs işaretçisi NG2 qPCR nöronlar, Tuj1 gibi genler belirli bilinen hücre tipi GFAP'nin astrocytes için ifade ile tarafından izole OPCs saflığı değerlendirmek gereklidir, PDGFRα OPCs, Iba1 microglia, ve MOG ve MBP myelinating olgun oligodendrocytes için için. Şekil 2' de gösterildiði gibi immunostaining sonuç saf hücreleri çoğunluğu NG2 boyama için olumlu olduğunu gösterir. Buna ek olarak, bazı klasik hücre tipi özel işaretler nöronlar, astrocytes, microglia ve myelinating için oligodendrocytes sergi belirlenemeyen olgun veya unpurified beyin hücre karışıma karşılaştırıldığında arıtılmış OPCs seviyelerinde ifade son derece düşük. PDGFRα unpurified beyin hücre karışıma karşılaştırıldığında arıtılmış OPCs kademede yüksek ifade sergiler. İmmunopanning yöntemini kullanarak, microglia büyük ölçüde unpurified beyin hücre karışıma göre arıtılmış OPCs içinde azalır, ancak kirlenme az miktarda bulunmaktadır. Bu gözlem başkaları tarafından önceki yayınları ile tutarlıdır7,8,26. Ayrıca, daha önce yayımlanmış raporları ile karşılaştırıldığında, piyasada bulunan bir kit bu protokol için beyin dokuları standart, verimli ve kullanışlı ayrılma içine tek hücreli süspansiyonlar için kullanılır.
Sonra saf OPCs cross-linking, çapraz bağlı hücreler buz gibi HBSS çözüm ile yıkanmalıdır ve kalan çip adımları 4 ° C'de gerçekleştirilmesi gerektiğini, aksi takdirde antikor genomik DNA düzgün çökelti olamaz.
Bu iletişim kuralı anahtar sonraki adımda Kütüphane hazırlıktır. PCR güçlendirme çip malzeme Kütüphane yapımı için kullanıldı. Kütüphane hazırlık ÇSYİ devredir DNA başlayan miktarına bağlıdır. Bir iyi kütüphane hazırlık giriş DNA tutarının doğru miktar gerektirir. Çok fazla veya çok az PCR döngüleri yanı sıra PCR eserler için önde gelen karmaşıklığı, Kütüphane konsantrasyon etkisi altına alabiliyor.
Bu hücreler sınırlı sayıda immunoprecipitation27için kullanırken ChIP-seq kütüphane oluşturmak için meydan okuyor. Daha önce kullanılan standart çip protokol 10 gerektirir immunoprecipitated DNA çip seq Kütüphane hazırlık1,28ng. Ancak, normalde burada açıklanan protokol 2 oluşturur immunoprecipitated DNA Olig2 antikor 20.000 OPCs dan tarafından ng. DNA çip seq Kütüphane hazırlamak için EAG'yi immunoprecipitated DNA kuvvetlendirilmesine izin duyarlılık gelişmiş hangi etkinleştirir tek adım bağdaştırıcısı ekleme yöntemi tarafından kullanılır. Ticari kitleri birleştirerek, bu protokol küçük bir hücre sayısına göre transkripsiyon faktörleri için ChIP-seq gerçekleştirmek için pratik bir çözüm sağlar.
Önemlisi, düşük hücre açıklanan ChIP-seq protokolü, ChIP-Seq diğer transkripsiyon faktörleri Primer hücre veya nadir hücre popülasyonlarının de geçerlidir. Antikorlar bu protokol için kullanılan deneysel olarak ilk IP deneme tarafından özel olarak doğrulanması gerekir. Spesifik olmayan bağlama antikorların zavallı sonuçlara neden. Ayrıca, bu düşük hücre ChIP-seq deney ilgi transkripsiyon faktörü yüksek ifade düzeyi olan hücrelerdeki gerçekleştirmek için tercih edilir.
Veri analizi için kesintileri sonra tepe arama filtresi olarak kullanmak için hangi değerleri karar vermek zor olabilir. Analiz amaçlarına bağlı olarak, katı veya daha rahat parametreleri kullanılabilir. Genellikle, bir kat-zenginleştirme ve p-değeri veya FDR kullanılır. Transkripsiyon faktörünün altında eğitim bazı bağlayıcı siteleri önceden biliniyordu, bu filtreleme eşikleri belirlemede yardımcı olabilir. Transkripsiyon faktörü bağlama site veritabanlarını farklı hücre hatları kamuya ChIP-seq deneylerde türetilen ve koşullar derlenmiş29,30olmuştur. Bir gen için arama ve transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri önceden konumda olmadığını denetleyin. Ancak, transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri farklı hücre tipleri ve koşullara bağlı olarak farkında olmak önemlidir.
Silico tamamlayıcı ChIP-seq deney için MEME-ChIP20 veya benzer programlar kullanarak motifi zenginleştirme analizi ve de novo motifi arama yöntemlerdir. Motif arama bilinen kapsamlı gerektirir ve de novo motifi veritabanını KODLA motifleri25 veya Hocomoco veritabanı31gibi türetilmiş. Hocomoco halk için elde edilebilir insan ve fare ChIP-seq deneyler keşfetti motifleri bir veritabanıdır. Motifler bölümü protein için bilinmeyen iseniz, de novo motifi arama yeni motifleri art arda sıralı desenleri doruklarına önemli bir kısmını açığa olabilir. Motifler diğer transkripsiyon faktörlerin de elde edilen Peaks'e zenginleştirilmiş olduğu saptandığında transkripsiyon faktörleri potansiyel Kombinatorik eylem örtüsünü açmak olabilir.
Zenginleştirilmiş en yüksek bölgeler deneysel olarak denetimleri Kromatin mutasyona uğramış ya da nakavt hücre kullanarak geçerliliği. ChIP-seq yapmak transkripsiyon faktörü ifade değil yanlış pozitif doruklarına tanımlamak için kullanılan hücreler kullanarak, aynı zamanda "hayalet tepeler"32gösterilir. Yanlış pozitif filtre.
Elde edilen ChIP-seq doruklarına transcriptomic veri ile karşılaştırmak ilginçtir. PDGFRα-Olig2 ChIP-seq doruklarına OPCs genlerinde bir önceki yayın18ifade ile karşılaştırıldı. İfade OPCs genlerinde mekanizmaları dışında Olig2 transkripsiyon faktörü bağlayıcı tarafından kontrol edilebilir beri bu strateji sınırlı olabilir. Ayrıca, Olig2 transkripsiyon faktörü bir gen düzenleyici bölgeye bağlamak ama gene düşük gen ifade düzey mümkün inhibitör mekanizmaları nedeniyle olabilir veya eksikliği ortak gen transkripsiyonu için gerekli faktörler.
Çip seq genom çapında DNA bağlayıcı siteleri transkripsiyon faktörleri ve diğer proteinler tanımlamak için kullanılan bir yöntemdir. Ancak, ortak transkripsiyon faktörleri oluşumunu analizi ile araştırmacılar transkripsiyon faktörleri co-regulatory modülleri33oluşturan diğer proteinler ile ilişkilendirmek eğilimindedir bulundu. Bu transkripsiyon faktörleri arasındaki bazı bağları anlamına gelir ve genomik DNA çip-seq tarafından ortaya dolaylı ve diğer proteinler tarafından Köprülü. Bu nedenle, daha anlamlı sonuçlar elde etmek için araştırmacılar birden fazla transkripsiyon faktörü aynı anda eğitimi düşünmelisiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
JQW, XD, RCDD ve YY sağlık R01 NS088353 Ulusal kurumları gelen hibe tarafından desteklenen edildi; NIH grant 1R21AR071583-01; Staman Ogilvie Fonu-Memorial Hermann Vakfı; UTHealth beyin girişimi ve CTSA UL1 TR000371; ve University of Texas sistem Nörobilim ve NÖROTEKNOLOJİ Araştırma Enstitüsü (Grant #362469) bir hibe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
- Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669 (2015).
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562 (2007).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
- Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
- Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
- Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
- Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
- Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
- Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).
