En familiær hyperkolesterolæmi menneskelige lever kimære musen Model ved hjælp af induceret pluripotente stamceller-afledt hepatocytter
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at generere en menneskelig lever kimære musemodel af familiær hyperkolesterolæmi ved hjælp af menneskelige inducerede pluripotente stamceller-afledt hepatocytter. Dette er en værdifuld model til at teste nye behandlinger for hyperkolesterolæmi.
Abstract
Familiær hyperkolesterolæmi (FH) er for det meste forårsaget af low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutationer og resulterer i en øget risiko for tidlig debut hjerte-kar-sygdom på grund af markant forhøjede LDL kolesterol (LDL-C) i blodet. Statiner er den første linje af lipid-sænkende medicin til behandling af FH og andre typer af hyperkolesterolæmi, men nye tiltag er på vej, i særlige PCSK9 antistoffer, som er nu ved at blive testet i kliniske forsøg. For at udforske nye terapeutiske tilgange til FH, enten nye lægemidler eller nye formuleringer, har brug for vi passende i vivo modeller. Men forskelle i lipid metaboliske profiler i forhold til mennesker er et centralt problem i de tilgængelige dyremodeller for FH. For at løse dette problem, vi har genereret en menneskelig lever kimære musemodel ved hjælp af FH induceret pluripotente stamceller (iPSC)-afledt hepatocytter (iHeps). Vi brugte/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) mus undgå immun afvisning af transplanterede menneskelige celler og vurdere effekten af LDLR-mangelfuld iHeps i en LDLR null baggrund. Transplanterede FH iHeps kunne repopulate 5-10% af LRG mus leveren baseret på human albumin farvning. Desuden, den aflægger iHeps reagerede lipid-sænkende stoffer og sammenfattet kliniske observationer af øget effektivitet af PCSK9 antistoffer i forhold til statiner. Vores menneskelige lever kimære model kunne således være nyttige for præklinisk afprøvning af nye behandlinger til FH. Ved hjælp af samme protokol, lignende menneskelige lever kimære Mus for andre FH genetiske varianter, eller mutationer svarende til andre arvelige leversygdomme, kan også blive genereret.
Introduction
Low-density lipoprotein receptor (LDLR) fanger LDL kolesterol (LDL-C) i blodet til at modulere kolesterol syntese i leveren. Mutationer i LDLR genet er den hyppigste årsag til familiær hyperkolesterolæmi (FH)1. Statiner har traditionelt været den første linje af medicin til behandling af FH og andre typer af hyperkolesterolæmi (arvet eller erhvervet). Statiner hæmme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym en reduktase til at sænke kolesterol syntese i leveren2. Derudover øge statiner LDLR niveauet på hepatocyt overflade til at fremme plasma LDL-C clearance. En større advarsel af behandling med statiner er dog at de samtidig inducerer udtryk af proprotein convertase subtilisin/hexin 9 (PCSK9), et enzym, der binder sig til LDLR at fremme dets nedbrydning3. Denne effekt er ansvarlig for den utilstrækkelige eller endda null svar på statiner observeret i mange patienter. At studere denne mekanisme har, uventet, førte til opdagelsen af en alternativ metode til behandling af hyperkolesterolæmi. PCSK9 antistoffer for nylig godkendt af FDA i øjeblikket bliver brugt i kliniske forsøg og vise højere effektivitet og bedre tolerance end statiner4. Succesen af PCSK9 antistoffer indebærer også, at der kan være andre terapeutiske muligheder til at modulere LDLR Nedbrydningsvejen (udover PCSK9) hos patienter med hyperkolesterolæmi. Tilsvarende er der interesse i at udvikle nye hæmmere af PCSK9 end antistoffer, eksempelvis siRNA oligos5.
For at teste nye behandlinger for FH og generelt enhver anden type af hyperkolesterolæmi, er passende i vivo modeller nødvendige. Et stort problem for nuværende i vivo modeller, for det meste mus6 og kaniner7, er deres fysiologiske forskelle med mennesker. Afgørende, omfatter disse problemer en forskellige metaboliske lipidprofilen. Generation af menneskelige lever kimære dyr8 kan hjælpe med at overvinde denne advarsel. Den menneskelige lever kimære Mus er en form for “humaniseret” mus med sin leveren genbefolket med humane hepatocytter, for eksempel, primære humane hepatocytter (pHH)9. Et problem med pHH er, at de ikke kan være udvidet ex vivo, hurtigt mister deres funktion på isolation, og er en begrænset kilde. Et alternativ til pHH er brug af induceret pluripotente stamceller (iPSC)-afledt hepatocytter (iHeps)10. Især, iPSCs er patient-specifikke og kan dyrkes på ubestemt tid, så iHeps kan være fremstillet på efterspørgslen, hvilket er en betydelig fordel over frisk pHH. Desuden kan iPSCs også være let genetisk manipuleret med designer nukleaser at korrigere eller indføre mutationer i en isogene baggrund at tillade mere trofaste sammenligninger11.
Menneskelige lever kimære Mus med aflægger pHH udviser ligheder til mennesker i leveren metaboliske profiler, drug svar og modtagelighed for hepatitis virus infektion12. Dette gør dem en god model til at studere hyperlipidæmi i vivo. De mest udbredte musemodeller er baseret på/Fah– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (FRG) mus13 og den uPA Transgene mus8, i hvilken op til 95% af musen leveren kan erstattes af pHH. Interessant nok, beskrives en nylig rapport en menneskelig FH lever kimære Mus (baseret på FRG musen) med pHH fra en patient med en homozygot LDLR mutation14. I denne model, de genopbyggede humane hepatocytter havde ingen funktionel LDLR, men de resterende mus hepatocytter gjorde, hvorved utility til at udføre i vivo test af narkotika påberåbe sig LDLR vej.
Her rapporterer vi en detaljeret protokol baseret på vores nyligt offentliggjorte arbejde15 for engrafting FH iHeps ind i/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) mus leveren. Denne menneskelige lever kimære Mus er nyttigt for modellering FH og udfører drug test in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere undersøgelser ved hjælp af iHeps i gnavere har bekræftet, at de er en effektiv måde at studere arvelige leversygdomme17. Yderligere udvide brugen af denne teknologi og fordi aktuelle FH dyremodeller er ikke optimalt, vi aflægger FH iHeps til LRG mus og viste, at den aflægger LDLR +/- eller heterozygous LDLR-muterede FH iHeps kan reducere mus plasma LDL-C niveau og reagere på lipid-sænkende stoffer i vivo.
Der er 3 vigtige tri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Shenzhen videnskab og teknologi Rådet grundlæggende Research Program (JCYJ20150331142757383), strategiske prioritet Research Program af kinesiske Academy of Sciences (XDA16030502), Hong Kong forskning tilskud Rådet tema baseret forskning Ordningen (T12-705/11), samarbejde Program tilskud Forskningsråd af Hong Kong Special Administrative Region og National Natural Science Foundation i Kina (N-HKU730/12 og 81261160506), Team forskningsprojekt Guangdong Naturvidenskabelig videnskabsteori Foundation (2014A030312001), Guangzhou videnskab og teknologi Program (201607010086), og Guangdong provinsen videnskab og teknologi Program (2016B030229007 og 2017B050506007).
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
