Summary
여기, 우리 현재 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 hepatocytes를 사용 하 여 가족성 콜레스테롤 혈 증의 인간 간 공상 마우스 모델을 생성 하는 프로토콜. 콜레스테롤 혈 증에 대 한 새로운 치료법을 테스트 하기 위한 유용한 모델입니다.
Abstract
가족성 콜레스테롤 혈 증 (FH) 대부분 저밀도 지 단백질 수용 체 (LDLR) 돌연변이 의해 발생 하 고 표시 된 혈액에 LDL 콜레스테롤 (LDL-콜레스테롤) 상승으로 인해 발병 초기 심혈 관 질환의 위험 증가에 결과. 스타 틴 FH와 다른 종류의 콜레스테롤 혈 증, 치료를 위한 지질 저하 약물의 첫 번째 줄만 지금은 임상 시험에서 테스트 되 고 특정 PCSK9 항 체에 새로운 접근 떠오르고 있다. FH, 신약 또는 새로운 공식에 대 한 새로운 치료 접근을 탐구 하 비보에 모델에 적절 한 필요 합니다. 그러나, 인 간에 비해 지질 대사 프로필에 차이 FH. 의 사용 가능한 동물 모델의 핵심 문제 우리 인간의 간 공상 마우스 모델 FH 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 사용 하 여이 문제를 해결 하려면 생성-파생 hepatocytes (iHeps). 이식된 인간 세포의 면역 거부를 방지 하 고 LDLR의 효과 평가/Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) 마우스를 사용 하는 우리-는 LDLR 결핍 iHeps null 배경. 이식된 FH iHeps 수 LRG 마우스 간 인간의 알 부 민 얼룩에 따라 5-10%를 다시 채웁니다. 또한, engrafted iHeps 지질 저하 약물에 반응 하 고 지 스타 틴에 비해 PCSK9 항 체의 증가 효능의 임상 관찰. 우리의 인간의 간 공상 모델 따라서 FH에 새로운 치료의 임상 테스트 하는 데 유용 수 있습니다. 다른 FH 유전 이체, 또는 다른 상속 된 간 질병에 해당 하는 돌연변이 대 한 동일한 프로토콜, 비슷한 인간의 간 공상 쥐를 사용 하 여 또한 생성 될 수 있습니다.
Introduction
저밀도 지 단백질 수용 체 (LDLR)는 간에 서 콜레스테롤 합성을 조절 하는 혈액에 LDL 콜레스테롤을 (LDL-콜레스테롤)을 캡처합니다. LDLR 유전자에 있는 돌연변이 가족성 콜레스테롤 혈 증 (FH)1의 가장 빈번한 원인이 됩니다. 스타 틴 FH와 다른 유형의 상속 (인수) 콜레스테롤 혈 증을 치료 하는 약물의 첫 번째 줄 전통적으로 있다. 스타 틴 3-히 드 록 시-3-methylglutaryl-코엔자임 reductase 낮은 간2에서 콜레스테롤 합성을 억제 합니다. 또한, 스타 틴 혈장 LDL-C 클리어런스를 홍보 hepatocyte 표면에 LDLR 수준을 높일. 그러나, 스타 틴 치료의 주요 경고는 그들은 동시에 proprotein convertase subtilisin/9 (PCSK9), 그것의 저하3홍보 LDLR 바인딩하는 효소 hexin의 표현을 유도. 이 효과 많은 환자에서 스타 틴을 부족 하거나 심지어 null 응답에 대 한 책임. 이 메커니즘을 공부 예기치 않게, 콜레스테롤 혈 증을 치료 하는 대체 방법의 발견으로 이끌어 냈다. PCSK9 항 체 최근 FDA에 의해 승인 임상 시험에서 현재 사용 되 고 높은 효능과 스타 틴4보다 더 나은 향상을 보여. PCSK9 항 체의 성공 또한 콜레스테롤 혈 증 환자에서 (외 PCSK9) LDLR 저하 통로 조절 하는 다른 치료 가능성 있을 수 있음을 의미 합니다. 마찬가지로, 항 체, 예, siRNA oligos5이외의 새로운 PCSK9 억제제 개발에 관심이 있다.
FH 고 콜레스테롤 혈 증의 일반적 다른 형식에 대 한 새로운 치료를 테스트 하려면 적절 한 비보에 모델은 필요 합니다. 현재 생체 내에서 주요 문제 모델, 대부분 마우스6 및7, 토끼는 인간과 그들의 생리 적인 차이. 결정적으로,이 문제는 다른 지질 대사 프로필을 포함 됩니다. 인간의 간 공상 동물8 세대는이 경고를 극복 하는 데 도움이 있습니다. 인간의 간 공상 마우스의 간 인간의 hepatocytes, 예를 들어 기본 인간의 hepatocytes (pHH)9로 다시 채울 "인간 답게" 마우스의 유형입니다. PHH와 문제는 그들이 신속 하 게 확장 된 전 비보, 수 없습니다 격리에 그들의 기능을 잃게 하 고 제한 된 소스. PHH에 대안은 이다 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 사용 하 여-파생 hepatocytes (iHeps)10. 특히, Ipsc 환자 전용 이며 iHeps은 상당한 이점을 신선한 pHH 주문형 생산 될 수 있도록 무기한, 성장 될 수 있다. 또한, Ipsc 수 있습니다 또한 쉽게 유전자 설계 될 디자이너 nucleases 수정 하거나 더 충실 한 비교11수 있도록 isogenic 배경에서 돌연변이 소개와 함께.
Engrafted pHH와 인간의 간 공상 마우스 간 대사 프로필, 약물 반응, 간염 바이러스 감염12민감성에 인 간에 게 유사점을 보여줍니다. 이로써 그들 혈에서 vivo에서공부 하기 좋은 모델. 가장 널리 사용 되는 마우스 모델/파-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (FRG) 마우스13 와 uPA 유전자 변형 마우스8, 마우스의 95%는 최대에 간 pHH에 의해 대체 될 수를 기반으로 합니다. 흥미롭게도, 최근 보고서는 인간의 간 FH 공상 마우스 (독일 연방 공화국 마우스에 따라) pHH homozygous LDLR 돌연변이14들고 환자에서 설명 합니다. 이 모델에서 repopulated 인간의 hepatocytes 했다 아무 기능 LDLR 했지만 잔여 마우스 hepatocytes, 따라서 vivo에서 LDLR 경로에 의존 하는 약물의 테스트를 수행 하기 위한 유틸리티를 감소.
여기, 우리 보고 상세한 프로토콜을 우리의 최근에 출판 된 작품 15/Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) 마우스 간으로 FH iHeps를 engrafting에 기반으로 합니다. 이 인간의 간 공상 마우스는 FH를 모델링 및 약물 테스트를 수행 하는 데 유용 vivo에서.
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Protocol
동물의 사용을 포함 하는 여기에 설명 된 모든 메서드는 사용 하 여 라이브 동물의 교육 및 연구 (CULATR) 홍콩의 대학에 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 마우스 준비 및 Phenotypic 테스트
-
Immunodeficient Ldlr 녹아웃 (KO) 마우스의 세대.
- 사용 하 여 쥐 긴장 Ldlr-/-, Rag2-/-, Il2rg-/- ( 재료의 표참조).
- Rag2-/-을 생성 하기 위해 Il2rg/- 생쥐와 Rag2-/- 생쥐 크로스 / Il2rg/- 생쥐, 다음 교차 Ldlr Rag2-/--/- 생쥐 / Il2rg/- 생쥐/Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) 쥐15생성 하. 3 ~ 4 주의 나이, PCR 및 시퀀싱 유전자 형을 결정 하 귀에서 게놈 DNA를 수집 합니다.
- 8 ~ 12 주의 나이, iHeps에 대 한 받는 사람으로 남성 LRG 쥐를 사용 하 여 인간의 간 공상 쥐 생성 하.
- 쥐 먹이 고 지방 및 고 콜레스테롤 (HFHC) 다이어트 콜레스테롤 혈 증을 개발할 수 있도록 iHep 이식 하기 전에 7 일.
- 간 상해에에서 engrafted iHeps의 확산을 용이 하 게 유도, 멸 균 용기에 쥐를 놓고와 γ-engraftment 이전 3 Gy 24 h의 복용량 감마 irradiator를 사용 하 여 그들을 비추는. 그런 다음, 자신의 주택 새에 쥐를 반환 합니다. 그들의 무게를 측정 하 여 방사능된이 쥐의 건강 상태를 모니터링할 수 있습니다. 쥐 20% 체중 감소 또는 더 큰 안락사 될 것입니다.
2. iHep 차별화 및 분리
LDLR heterozygous 코 (+) 또는 homozygous 코 (-/-) 인간의 Ipsc, FH 환자-Ipsc LDLR (FH Ipsc) heterozygous 돌연변이와 iHeps를 생산 하는 데 사용 됩니다. + LDLR 생성 또는-/-Ipsc FH Ipsc 우리의 이전 보고서15에서 설명 됩니다.
- IHeps로 Ipsc의 감독된 차별화
참고: iHeps로 인간의 Ipsc의 차별화 방법 이전 보고서16에서 수정 됩니다.- 3 일전 차별화 (-3 일), 씨앗 30만 셀/잘 인간의 iPSC 유지 보수 매체 (참조 테이블의 자료 (도) 1.5 mL의 조밀도에 기질에 Ipsc 코팅 6 잘 플레이트 ( 재료의 표참조) ) 5 µ M 바위 억제제 (Y27632)와 보충. 5% CO2 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 문화. 일반적으로, 6 잘 플레이트에서 iHeps engraft 5 쥐 충분 하다.
- 하루 24 시간 후 (-2) 48 h 후 (주-1), 록 억제제 없이 신선한 인간의 iPSC 유지 보수 매체 매체 변경.
참고: 차별화 하기 전에 Ipsc OCT4 및 NANOG 정량적 RT-PCR, 면역 형광 검사, 또는 cytometry에 의해 시험 될 수 있는 높은 수준의 표현 한다. - 차별화의 0 날 RPMI 1640 셀을 한 번 씻어 하 고 RPMI 1640 100 ng/mL Activin A와 25 ng/mL WNT3a 보충을 추가 합니다.
- 주 1와 차별화의 하루 2, 100 ng/mL Activin A. 보충 RPMI 1640 매체 변경
참고:이 단계에서 너무 많은 세포 죽음 인지 (0-3 일), 최대 0.5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 세포 생존 능력을 개선 하기 위해 매체에 추가할 수 있습니다. 그러나, 초과 FBS 또한 분화에 영향을 미칠 수 있습니다 각 특정 iPSC 라인에 대 한 추가 FBS의 최소한의 금액을 테스트 하는 것이 좋습니다. - 3 일에 한 번 DMEM 셀을 세척 하 고 2차 무대 중간 (20% 혈 청 교체, 1 x 비 본질적인 아미노산, 2 M L-글루타민, 0.1 m M 베타-mercaptoethanol, 및 1% 디 메 틸 sulfoxide DMEM 매체에서)로 전환. 10 일째까지 매일 매체를 변경 합니다.
참고: 7 일에 셀 한다 도달 했습니다 합류 및 디스플레이 명확 가장자리. 이 단계에서 나타나는 undifferentiated 부분도 있을 수 있습니다. 이 분야의 비율이 작은 경우 그들을 무시 합니다. 비율이 높은 경우 하루 0 Ipsc의 합류를 줄일 고 차별화의 첫 번째 단계에서 사용 하는 FBS의 양을 줄일 수 있습니다. - 10 일에 한 번 hepatocyte 기저 매체와 셀을 세척 하 고 hepatocyte의 배양 20 ng/mL 인간 간 성장 인자와 20 ng/mL oncostatin M iHep 성숙 촉진에 보충으로 전환. 매일 매체를 변경 합니다.
참고:이 단계에서 > 90% 면역 형광 염색 법 또는 흐름 cytometry에 따르면 HNF4A에 대 한 긍정적인 되어야 합니다. - 하루 15-17에 셀 engraftment 준비 되어 있다. 선택적으로, 세포 배양의 상쾌한 수집 하 고 iHeps에 의해 측정 secreted 알 부 민 (ALB)-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
참고:이 단계에서 > 80% iHeps HNF4A, ALB, 및 면역 형광 염색 법에 따라 α1-antitrypsin (AAT)에 대 한 긍정적인 되어야 합니다. 약 하루 17 iHeps의 60-70 %cytometry 여 같이 ASGPR에 대 한 긍정적인 되어야 합니다. 우리의 손에서이 기간에서 iHeps는 최적의 용량을 다시 마우스 간; iHeps는 ALB 생체 외에서의 높은 레벨을 분 비 하지만 또한 노화는 engraftment 지연 될 경우 될 수 있습니다.
- 분리 및 인슐린 주사기에 iHeps의 로드
- 필요한 시 약 및 재료 준비:
- engraftment, 전에 24 시간 해 동이 필요한 금액 (V = 40 µ L * 마우스 수) 얼음 세포 외 매트릭스의 차가운 방에 고 인슐린 주사기와 200 µ L 팁의 상자 4 ℃ 냉장고에 넣어.
- Engraftment, 이전 1 시간 따뜻한 셀 분리 효소 보충 50 µ g/mL DNase I 실내 온도에 그리고 얼음에 20% 혈 청 교체와 함께 보충 RPMI 1640 매체를 배치.
- 단계 대조 이미지 (100 X 200 X) 셀 형태학, 성장, 및 세포 밀도 포함 하 여 그들의 상태를 기록 하는 iHeps의 가져가 라.
- IHeps 2 mL/실내 온도 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +의 잘 씻어-무료 PBS, 그리고 셀 분리 효소의 1 mL 보충 50 µ g/mL DNase I을 각 영역을 추가 합니다. 8-10 분 동안 인큐베이터에 다시 세포를 넣어.
참고: 셀 분리 효소와 세포 분리를 개선, 세척 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +셀-PBS를 무료. 세포 생존 능력을 극대화 하기 위해 한 번에 일괄 처리 당 6 개 이상의 우물을 해리 하는 것이 좋습니다. 또한, 10 분 미만에 세포 분리 효소 처리를 제한 하는 것이 좋습니다. - 현미경 세포 형태학을 모니터링 합니다. 셀의 대부분 될 때 라운드, 차가운 RPMI 1640을 각 영역 20% 혈 청 대체 보완의 동일한 볼륨을 추가 하 고 플라스틱 접시에서 분리 하려면 부드럽게 셀 한 새로운 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
참고:이 단계는 수확된 세포의 생존 능력에 대 한 중요 한. 셀 접시에서 분리 하기 어려운 경우, 일부 셀 남은 경우 중요 하지 않습니다. 세포 단층의 큰 사각형으로 분리 하는 경우 다음 부드럽게 얻을 단일 세포 현 탁 액을 원심 분리 후 플라스틱. - 반복 단계 2.2.4 각 잘 거의 모든 연결 된 셀이 수집 됩니다. 4 ° c.에 3 분 200 x g 에서 원심 분리기
- 상쾌한을 제거 하 고 15 mL 튜브에 차가운 PBS의 2 mL로 세포를 resuspend. 부드럽게 하는 단일 세포 현 탁 액 다음 차가운 PBS 1 mL의 최종 볼륨을 추가 셀 플라스틱 * 천연된 우물의 수. 마지막으로, 집계 제거 하려면 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포를 전달 합니다.
참고: 일반적으로 1-2 106 셀/잘 x 수 있습니다 수확 될 필터링 후. - Aliquot 20 µ L의 세포 현 탁 액 0.4 %trypan 블루 솔루션의 20 µ L을 추가, 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 "C"로 세포 현 탁 액의 농도 기록. 필요한 볼륨을 계산 (V1 = [106 * (n + 1)] / C, 여기서 n은 생쥐 engrafted 될 수) 세포 현 탁 액 (1 백만/마우스) intrasplenic 주입에 대 한의.
- 약 15 mL 튜브와 4 ° c.에 3 분 200 x g 에서 원심 분리기에 세포 현 탁 액의 필요한 볼륨 수
- 상쾌한 제거, 적절 한 양의 세포 현 탁 액 (n + 1)의 볼륨을 차가운 PBS에 셀 resuspend * 55/2 µ L (n = 마우스의 수), 다음에 동일한 양의 기질 세포 현 탁 액 (n + 1)의 최종 볼륨을 추가 * 55 µ L.
- 차가운 인슐린 주사기 얼음에, 피스톤을 분리, 세포 현 탁 액의 55 µ L 주사기에 전송 놓고 다시 피스톤을 넣어. 거품을 신중 하 게 방전 하 고 얼음에 다시 주사기를 넣어.
- 2.3.10를 반복 하 여 모든 주사기 셀으로 로드 합니다. 주사기 주입에 대 한 준비가 지금입니다.
참고: 세포 생존 능력을 최대화 하려면 좋습니다 분리 후 얼음에 세포를 유지. 위의 단계 2.2.4–2.2.11 있는지 확인 모든 시 약은 사용 하기 전에 2-8 ° C에 보관 됩니다.
- 필요한 시 약 및 재료 준비:
3. intrasplenic iHeps 주입
- 케 타 민 (100mg/kg)와 xylazine (10 mg/kg) intraperitoneally 주입 마우스 anesthetize 수 의사 연 고 마 취 절차 동안 건조를 방지 하기 위해 쥐 눈에 넣어 하 고 마 취의 효과 관찰 하 고 평가 하는 통증을 그들의 근육 반사를 모니터링 합니다.
- 마우스에는 근육 반사 자극을 잃 었 어 요, 일단 오른쪽 옆 decubitus 위치에 그들을 놓습니다. 5-8 분 왼쪽된 측면에서 절 개 영역 depilatory 크림의 두꺼운 층을 적용. 다음, 습 하는 물 거 즈 패드로 영역을 닦아 하 여 depilatory 크림와 머리카락을 제거 합니다.
- Povidone-요오드 또는, 양자 택일로, 70% 에탄올 3 번 povidone-요오드 소독에 대 한 최종 몸을 담근 뒤 왼쪽된 측면을 문질러.
- 수준 2 biosafety 내각에서 비장을 왼쪽된 측면에 투명 하 게 구상 될 수 있다 고 다음 incise 피부와 복 부 벽의 위치를 찾습니다 0.5-1 cm. Exteriorize 비장 뾰족한 부드럽게 사용 하 여 가까운 지방 조직에 밖으로 당겨 겸 자입니다. 부드럽게 면봉을 사용 하 여 비장을 안정.
- 비장의 실질에 인슐린 주사기 3-4 m m의 바늘을 삽입 하 고 부드럽게 세포 현 탁 액의 대략 50 µ L를 주사. 바늘을 제거 하 고 출혈을 방지 하기 위해 1 분 및 자료의 유출에 대 한 주사 부 위에 면봉을 배치.
- 비장은 복 막에 반환 하 고 5-0 나일론 봉합 상처를 닫습니다. 다음, 그들을 회복 하 고 그들의 정상적인 신체 온도에 그들 하도록 3-16 h에 대 한 따뜻한 챔버/인큐베이터에서 마우스를 유지. 수술을 받은 마우스는 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사에 반환 되지 않습니다.
- 식 수에 meloxicam (26 μ g/mL)를 추가 하 고 주사 buprenorphine (50 μ g/kg) 피하 항 염증 제 약물과 진통제, 각각. 모니터 수술 상처 염증이 방지 하기 위해 매일.
참고: 모든 악기와 공급 단계 4-7에에서 사용 되는 메 마른 다는 것을 확인 하십시오.
4. 플라즈마 LDL-C 레벨의 테스트
- 0, 7, 14, 21, 및 28 일 후 engraftment에서 두 손으로 제 지 메서드를 사용 하 여 머리의 사이드-투-사이드 움직임을 최소화 하기 위해 단단히 LRG 마우스 억제 다음 펑크 랜 싯을 사용 하 여 얼굴 정 맥. 혈액 바소의 제거 후 흐르는 시작 됩니다. EDTA의 1 µ L을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 약 50 µ L의 혈액을 수집 합니다.
참고: 그립이 너무 꽉 경우, 수집 된 혈액 볼륨을 줄일 수 있습니다 및 마우스 호흡 어려움 때문에 죽을 수도 있습니다. - 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 혈액을 부드럽게 혼합 15 분 대에서 950 x g 다음 분리기는 supernatants 수집 하 고 즉시-80 ° C에서 저장.
- 일단 모든 샘플을 수집 하는 실 온에서 플라즈마 해 동 하 고 제조업체의 설명서에 따라 LDL-C 탐지 키트를 사용 하 여 LDL-C 레벨 테스트.
5. Vivo에서 마약 공상 쥐 Engrafted LDLR +와 FH iHeps 테스트
- 콜레스테롤 혈 증을 유도, 피드 쥐 HFHC 다이어트 7 일 engraftment 전에.
- 7 일 후 engraftment에서 차량 (PBS, 피하 주사), 10 mg/kg의 쥐의 각 그룹 치료/주 PCSK9 항 체 (너무 피하 주입 PCSK9 단일 클론 항 체의 임상 등급 책정), 10 mg/kg/하루 simvastatin (40 mg/L mg / 식 수에 mL), 또는 PCSK9 항 체 및 simvastatin 결합.
- 0 (engraftment의 날), 14, 21, 28 일 후 engraftment 마우스 플라즈마를 수집 합니다. 즉시-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
- 일단 모든 샘플을 사용할 수 제조 업체의 설명서에 따라 LDL-C 탐지 키트를 사용 하 여 플라즈마 LDL 수준을 테스트 합니다.
6. 내 피 기능 테스트
내 피 기능 초기 FH에에서 영향을 하 고 심각도 또는 질병의 다른 치료와 개선 평가의 지표로 서 우리의 마우스 모델에서 시험 될 수 있다. stereomicrocope, 해 부 집게가 위, 철사 myograph, 수집 하드웨어 ( 재료의 표참조), 컴퓨터가 필요.
- 100 mg/kg 페의 복 주입 하 여 쥐를 희생. 하강 대동맥 척추에 평행 하 게 볼 수 있으며가 위 인접 조직 및 심장에 의해 밖으로 해 부 될 수 있도록 내부 장기를 제거 합니다. 좋은 위를 사용 하 여 aortae를 해 부하 고 차가운 산소 Krebs 솔루션에 배치 (mM: 119 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl2, 1 MgCl2, 25 NaHCO3, 1.2 KH2포4및 11 D-포도 당).
- 실리콘 코팅 페 트리 접시에 Krebs 솔루션에서 aortae를 전송 합니다. 핀 결합 조직 스트레칭 없이 대동맥 위치를 해결 하기 위해. Stereomicroscope가 위를 봄, 혈관 벽을 손상 하지 않고 주변 지방과 adventitial 조직에서 대동맥 해 부를 사용 괜 찮 아 요 집게에서 다음 그것을 잘라 1.5-2 m m로 길이 세그먼트.
- 잘라는 대략 2 cm 길고 40 μ m 두꺼운 스테인리스 와이어 부드럽게 대동맥 루멘을 통해 넣어. 와이어를 눌러 산소 Krebs 솔루션으로 가득 와이어 myograph 약 실에 세그먼트를 전송 합니다.
- 수축 공부를 할 때 aortae 세그먼트의 길이 측정 하는 마이크로 미터에 턱과 레코드 읽기 (D1)의 사이 수직 각 세그먼트를 놓습니다. 세그먼트를 제거와 함께 문 턱을 이동 하 고 읽기 (D0)를 기록. 세그먼트의 길이 L 것 = D1-D0.
- 와이어 클램프 하는 문 턱 사이 세그먼트를 배치 하는 동안 드라이버와 함께 보안 사용자 가이드를 따라 하지만 스트레치 그것을 두고.
- 실험 전에 정규화, myograph 스트레치 위치에 0으로 설정 합니다. 다음, 천천히 떨어져 턱 이동한 3 미네소타를 도달할 때까지 변경 대동맥 긴장을 관찰 합니다. 15 분 후, myograph 상공에서 솔루션 및 신선한 Krebs 솔루션으로 대체, 15 분 기다리는 배수와 3 미네소타 긴장을 다시 조정.
- 60 mm 유도 적어도 15 분 린스 신선한 Krebs 솔루션에 대 한 수축 3 번을 포함 하는 KCl Krebs 솔루션 표준 Krebs 솔루션을 변경 합니다.
- Phenylephrine (페;의 농도가 증가 추가 예를 들어, 10에서 μ M 100 nM). 표준 Krebs 솔루션을 밖으로 씻어 하 고 이전 수축에서 최대한 수축 ~ 70%에서 페의 단일 농도 추가 합니다. 때 수축 안정, 아 세 틸 콜린 (ACh;의 농도가 증가 추가 예를 들어, 1 또는 3 nM 10 또는 30 µ M에서에서) 혈관 확장을 유도 하. ACh는 약 2 분 간격에 추가 됩니다.
참고: 작은 페 유도 수축과 일부 대동맥 세그먼트에 KCl의 30% 보다 작은 예 유도 수축, U46619 (다른 vasoconstrictor) 1에서 농도에 30 nM nM의 70% 보다 더 안정적인 수축 유도를 사용할 수 있습니다 KCl 유발 수축입니다. - 제조업체의 설명서에 따라 myograph을 청소.
- 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 ( 재료의 표참조), 기록 후에 약물의 모든 추가 힘 (F). 기저 긴장 마커 그리기 (F기저) 상대 측정에 대 한 F페로 페 후 가장 높은 지점에 화살표를 이동 하 고 다음 F크로 ACh의 모든 추가 후 가장 낮은 지점으로 이동. % 휴식에 의해 ACh 유도 endothelium 종속 혈관 (EDV) 계산 = (FAChF기저) / (FPhe-F기저) y 축에. X 축에 m에서 농도의 log10 값을 사용 하 여 통계 소프트웨어에 농도 응답 곡선을 준비 합니다.
- 통계적 차이 분석 하려면 한 마우스에서 각 세그먼트의 곡선 아래의 영역을 사용 하 고 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 그룹 사이 곡선 아래 면적의 차이 분석 합니다. 필요한 경우 개별 포인트 또한 분석할 수 있습니다.
7. iHep 마우스에 Repopulation의 증거
- 끝점에서 intraperitoneally 페 100 mg/kg을 주입 하 여 쥐를 희생.
- 심장 빵 꾸에 의해 플라즈마를 수집 합니다. 안과 위를 사용 하 여 간 엽 해 부 다음 간은 10 cm peri-그릇에 넣고 식 염 수로 두 번 씻어. 흡수 성 종이 간 표면에서 염 분을 제거 후 0.6 c m 길이 조각 주위에 돌출부를 잘라. 10% 포 르 말린에 간의 돌출부를 수정.
- 파라핀 조직 처리 시스템 및 슬라이딩 톰, 각각, 제조업체의 지침에 따라 사용 하 여 섹션에서 고정된 간을 포함 합니다.
- 슬라이드 1 h 왁 스 용 해를 위한 60 ° C에가 열. 그리고 5 분 동안 크 실 렌에서 슬라이드를 두 번, 담가 연속적으로 100%, 90%, 70% 에탄올과 조직 rehydrate.
- 슬라이드 슬라이드-챔버 antigen 검색 솔루션의 약 50 mL를 포함 하 고 다음 챔버 압력 밥 솥, 1.5 분 세척 파이프와 부드럽게 슬라이드 5 분 동안 물에 대 한 120 ° C에를 담가.
- 인간의 ALB (hALB) 및 인간의 핵 항 원 (hNA)을 대상으로 1 차 항 체 (약 100 µ L/섹션)와 섹션을 얼룩. 다음, 이차 항 체 형광 라벨 또는 양 고추냉이 과산화 효소 (이 소량 검출 키트와 함께 반응) 활용으로 얼룩.
- HALB + 지역과 hNA + 세포의 백분율을 계산 하려면 슬라이드 안티-hALB와 안티-hNA 스테인드 및 DAB 시스템을 스캔 하는 자동화 된 슬라이드를 사용 하 여 전체 섹션 이미지와 반응을 검사 합니다.
참고: 전체 섹션 스캔 이미지 hALB + 지역 또는 hNA + immunohistochemistry 스테인드 간 셀에 따라 공평한 방식으로 다시 채울 효율성을 계산 하는 데 도움이 됩니다. IHep repopulation 효율성을 모니터링 하는 다른 방법으로 플라즈마 인간의 알 부 민 수준 인간의 특정 ALB ELISA 키트를 사용 하 여 테스트 수 있습니다. - 5 X 뷰 소프트웨어를 보고 관련된 디지털 슬라이드를 사용 하 여 전체 슬라이드를 스냅숏 이미지를 가져가 라. HALB +의 비율 척도를 영역, 각 스냅숏 이미지에 대 한 긍정적인 영역 (P) 및 이미지의 전체 면적 (T) 현미경 이미징 소프트웨어를 사용 하 고 이미지 J를 사용 하 여 빈 영역 (B) 자격. HALB + 지역의 백분율은 P/(T-B)로 표시 * 100%. 각 그룹에 대 한 적어도 3 마우스 선택 되어야 합니다. 그리고 각 마우스 간의 여러 위치에서 적어도 4 섹션을 선택 해야 합니다.
- HNA +의 비율 척도를 각 스냅숏 이미지에 대 한 셀 임의로 영역의 1/16 이미지 처리 소프트웨어, 선택한 다음 수동으로 총 핵 (T)과 hNA + 핵 (N)의 수를 계산 합니다. HNA +의 비율 N/T로 표시 됩니다 * 100%. 각 그룹에 대 한 적어도 3 마우스 선택 되어야 합니다. 각 마우스 간의 여러 위치에서 적어도 4 섹션을 선택 합니다.
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Representative Results
IHeps로 감독된 감 별 법의 인간 Ipsc
70%의 합류를 도달할 때 인간의 Ipsc iHeps 3 단계 프로토콜16 (그림 1 위 패널)로 구분 됩니다. 3 일 후 endoderm 차별화, iPSC 식민지 느슨하게 되 고 전체 합류 (그림 1 낮은 패널)에 확산. 다음, 2차 단계 매체, hepatoblasts 표시와 격 증. 이러한 셀 혼잡 하지만이 단계 (하루 7, 그림 1 낮은 패널)에서 분명 가장자리를 표시. 17 일 후 차별화의, 전형적인 육각형 형태와 편광된 iHeps (그림 1 낮은 패널) 나타납니다. 이러한 iHeps pHH 마커, AAT 및 ALB (그림 2A)를 포함 하 여 표현 한다. 또한, ASGPR + iHeps의 비율 해야 상대적으로 높은 흐름 cytometry (그림 2B)15에 의해 측정.
FH에 비보 질병 모델을 사용 하 여 FH iHeps의 생성
LRG 쥐 콜레스테롤 혈 증을 개발 하기 위해, 우리 먹이 그들 HFHC 다이어트 7 일전 engraftment (하루-7). Engraftment (0 일)의 날, LRG 마우스 약 3 플라스마 LDL-콜레스테롤 수준 (약 600 mg/dL, 그림 3B)를 표시합니다. 하루 15-17 iHeps intrasplenic 주입; 통해 LRG 쥐에 engrafted는 이러한 iHeps 곧 간 실질에 거주 하 고 있다 격 증 (그림 3A). 끝점에서 이러한 공상 쥐의 간은 수집 및 고정, 다음 hALB 고 hNA, 둘 다 LRG 마우스 간 hALB 고 hNA (그림 4A-E)에 대 한 얼룩에 따라 간 repopulation iHep 중재의 명확한 증거를 표시 한다 물. 우리의 손에 LDLR +와 FH iHeps 플라즈마 LDL-콜레스테롤 수준 크게 21 일 후 engraftment (그림 4 층)을 줄일 수 있습니다. 이 시점에서, FH 인간의 간 공상 쥐 FH에 대 한 치료를 테스트를 사용할 수 있습니다.
사용할 수 있는 약물을 사용 하 여 FH 인간의 간 공상 마우스 모델의 유효성 검사
우리의 모델의 유효성을 검사 하려면 우리가 사용 2 잘 알려진 LDL-콜레스테롤 낮추는 약물, simvastatin PCSK9 항 체 (그림 5A). 데이터 처리, 후 21 일 PCSK9 항 체는 더 강한 능력 LDL을 낮추는 및 EDV simvastatin FH 공상 쥐 (그림 5B-D)에서 보다 보여줍니다. 특히, FH 공상 쥐 항 체 PCSK9와 플라즈마 LDL-콜레스테롤의 관찰 된 비율 감소는4임상 시험 보고 된 유사 합니다. 이러한 결과 FH에 대 한 새로운 약물의 임상 시험에 대 한 FH iHeps와 engrafted LRG 공상 쥐의 잠재적인 유틸리티를 보여 줍니다.
그림 1: 감 별 법의 인간 Ipsc iHeps.Top 패널에 지시, iHeps;에 iPSC 차별화에 대 한 타임 라인 키 크린 시 토 킨 및 미디어 각 단계. 에 대 한 표시 됩니다. (하단 패널) 다른 시간 iHep 차별화의 포인트의 대표적인 단계 대조 이미지. KSR: 녹아웃 혈 청 대체; 호치민시: hepatocytes 문화 매체; HGF: hepatocyte 성장 인자; OSM: oncostatin M. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: iHeps 제작 수정 분화 프로토콜의. 차별화의 다양 한 단계에서 iHeps의 면역 형광 (A). 핵은 병합 된 작곡에 파란색으로 물 들 다. (B) 막대 그래프는 ASGPR + iHeps 파생의 비율을 보여줍니다 획득 하루 17, cytometry로 측정 된 3 독립적인 실험;에서 샘플 측정 평균 값 표시 되 고 오차 막대 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 세대 iHeps FH Vivo에서 질병 모델의. (A) 시간 LRG 쥐에 FH iHeps intrasplenic 주입에 의해 인간의 간 공상 쥐의 세대에 대 한 라인. (B) 막대 그래프는 HFHC 다이어트와 LRG 쥐 먹이 리드 크게 증가 LDL-C 레벨 (n = 10). P 값은 그림에 표시 됩니다와 짝이 없는 t-검정;를 사용 하 여 가져온 평균 값 표시 되 고 오류 막대 표시 평균 (SEM)의 표준 오차. 패널 B 그림 3I 의 우리의 이전 보고서15. 에서 수정 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: iHep LRG 쥐 간의 중재 Repopulation. (A) 대표 전체 섹션 검색의 이미지 hALB iHeps + LDLR 와 다시 채울 마우스 간에 얼룩. 화살표는 마우스 간;에 engrafted 인간 iHeps의 클러스터를 나타냅니다. 확대 된 섹션 오른쪽 패널에 표시 됩니다. (B) 분산형 그래프의 비율을 보여줍니다 다시 채울 hALB + (다른 기증자 Ipsc)에서 마우스 간 iHep 포함 된 영역에 해당, 계산 전체 섹션을 스캔 한 이미지에 근거 했다 (n = 19). 평균 값 표시 되 고 오차 막대 immunohistochemical hNA engrafted FH iHeps와 마우스 간에 대 한 얼룩의 sd. (C) 대표 이미지를 나타냅니다. (D) 막대 그래프에서는 (다른 기증자 Ipsc)에서 다시 채울 hNA + iHeps의 비율 LRG 마우스 간 (n = 3). 평균 값이 표시 됩니다 이며 오차 막대 sd (E). hALB 고 hNA 야생 타입 iHeps와 다시 채울 마우스 간 두 연속 섹션에 얼룩. (F) 하루 21 후 engraftment;에서 플라즈마 기준선에서 LDL-콜레스테롤 감소의 비율을 표시 하는 막대 그래프 n = 5 LDLR iHeps과 n + = FH iHeps와 차량에 대 한 6. P 값은 그림에 표시 됩니다와 짝이 없는 t-검정;를 사용 하 여 가져온 값은 오차 막대 표시 SEM. 패널 B, D, 그리고 E 그림 3G에서 수정 표시 됩니다 의미-3I 의 우리의 이전 보고서15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : PCSK9 항 체 표시 Simvastatin 인간의 간 공상 LRG 쥐에서 보다 능력을 낮추는 강한 LDL. Vivo에서 약물 테스트 접근 FH 인간의 간 공상 쥐를 사용 하 여 (A) 회로도 보기 (B 와 C) 일 14, 21, 28 FH 공상 쥐 HFHC 다이어트 먹이 표시 된 약물; 치료에서 기준선에서 플라스마 LDL-콜레스테롤의 비율 변화 n 쥐의 수를 나타냅니다. P 값 Kruskal-월리스 테스트;를 사용 하 여 가져온 평균 값 표시 되 고 오류 막대 표시 SEM. (D) EDV ACh의 농도 증가에 대 한 응답. P 값은 표시 된 농도 대 한 그림에 표시 됩니다. P 값 조정 Dunnett의 여러 비교; 양방향 ANOVA를 사용 하 여 가져온 오차 막대 표시 SEM. 그림 5 그림 4A-4 C 와 우리의 이전 보고서15. 의 그림 5A 에서 수정 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이전 연구에서 설치류 iHeps를 사용 하 여 상속 된 간 질환17를 공부 하는 효과적인 방법 다는 것을 확인 했습니다. 추가 하려면이 기술 사용 하 여 확장 하 고 현재 FH 동물 모델 차선 때문에, 우리 LRG 쥐로 FH iHeps engrafted engrafted LDLR + 또는 heterozygous LDLR보여주었다-돌연변이 FH iHeps 쥐 플라스마 LDL-콜레스테롤 수준을 줄일 수 있습니다 그리고 응답 지질 저하 약물 vivo에서.
IHeps를 사용 하 여 인간의 간 FH 공상 쥐를 생성 하기 위한 우리의 프로토콜에 있는 3 중요 한 단계 있다:
1) 감독된 차별화를 통해 높은 품질 iHeps의 생산. IPSC 라인18사이 클론 다양성을 감안할 때, 적절 한 비교 Ipsc isogenic를 사용 하 고 어머니 셀 라인의 iHep 차별화 효율성을 테스트 하는 엔지니어링과 engraftment를 수행 하기 전에 중요 하다.
2) 올바른 iHep 주사기로 업로드. 다른 프로토콜에서 다르게 우리 50% 기질 (최종 농도, v/v) iHeps, resuspend을 사용 하 고 인슐린 주사기에 그들을 업로드. 우리는 기질 세포를 보호 하 고 비장에서 간으로 iHep 마이그레이션 용이 하 게 microenvironment를 제공 믿습니다. 거품은 수술에 대 한 치명적인 요인이 고 주사기에 완전히 피해 야 한다.
3) engrafted 셀 수를 수정 합니다. 오버 로드 셀의 높은 치 사 율 속도 또한 발생할 수 있습니다. 25-30 g 마우스 당 1-1.5 백만 iHeps engrafting 하는 것이 좋습니다.
우리의 프로토콜에는 또한 몇 가지 제한 사항이 있다: 방사선에 의해 유도 된 간 상해는 중간 및 단일-복용량, 그리고 우리의 iHeps의 성숙 상태 pHH 비교. 두 고려 사항 관련, 우리의 모델의 chimerism의 정도 끄 덕/Lt-SCID/IL-2Rγ−/− 쥐 또는 Gunn 쥐 iPSC 파생 iHeps17,19 engrafted 설명 최근 보고서와 마찬가지로 하지만 FRG 쥐 또는 pHH와 engrafted uPA 유전자 변형 마우스 보다 훨씬 낮은. 한 반면에,이 경고를 극복 하기 위해 하나 더 iHeps의 성숙 개선 간 차별화 프로토콜 최적화 수 있습니다. 다른 한편으로, LRG 쥐 Ldlr-/-/Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg/- 생쥐를 생성 하기 위해 독일 연방 공화국 쥐와 교차 수 있습니다.
요약 하자면, 여기 우리 FH iHeps, 인간의 간 공상 동물을 생성 하기 위한 engrafted iHeps의 기능을 테스트 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 했습니다. 중요 한 것은, 이러한 공상 쥐 vivo에서 약물 테스트를 위해 사용할 수 있습니다. 우리의 모델 가능성이 iHeps의 기능 개선 또는 추가 유전자 밖으로 노크 하 여 최적화할 수 있습니다 (예., 파) 받는 LRG 마우스, 그리고 그것은 질병의 병 적인 메커니즘을 조사 하 고 전 임상 수행 도움이 될 것입니다 연구입니다.
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Disclosures
H. 무정 지형 국가 코디 네이 터와 사노 피와 Regeneron 제약 후원 오디세이 결과 연구의 탐정 이다.
Acknowledgments
이 작품은 심천 과학 및 기술 위원회 기본 연구 프로그램 (JCYJ20150331142757383), 홍콩 연구 보조금 위원회 테마 기반 연구 (XDA16030502), 과학의 중국 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 체계 (T12-705/11), 홍콩 특별 행정구의 연구 보조금 위원회 및 중국 (N-HKU730/12 81261160506), 연구 팀 프로젝트의 광 동 자연 과학의 국립 자연 과학 재단의 협력 프로그램 재단 (2014A030312001), 광주 과학 및 기술 프로그램 (201607010086), 그리고 광 동성 과학 및 기술 프로그램 (2016B030229007 및 2017B050506007)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
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