Summary
Здесь мы представляем протокол для создания человеческой печени химерных мыши модели семейной гиперхолестеринемией, используя человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток гепатоцитов. Это является полезной моделью для тестирования новых терапий для гиперхолестеринемии.
Abstract
Семейной гиперхолестеринемией (FH) в основном вызвано мутациями липопротеинов низкой плотности рецептора (LDLR) и приводит к повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний раннего начала из-за заметное повышение ЛПНП в крови холестерина (LDL-C). Статины являются первой линией гиполипидемические препараты для лечения FH и другие виды гиперхолестеринемии, но появляются новые подходы, в частности PCSK9 антител, которые в настоящее время проходит испытания в клинических испытаниях. Изучить новые терапевтические подходы для FH, новых лекарств или новых формулировок, мы должны надлежащим в естественных условиях модели. Однако различия в метаболические профили липидов, по сравнению с людьми являются ключевой проблемой доступных животных моделей FH. Для решения этой проблемы, мы породили модель человеческой печени химерных мыши, с помощью FH индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)-производных гепатоцитов (iHeps). Мы использовали/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) мышах, чтобы избежать иммунной неприятие трансплантированных человеческих клеток и для оценки эффекта LDLR-дефицит iHeps в LDLR null фон. Пересаженные FH iHeps может населить 5-10% печени мыши LRG основе человеческого альбумина пятнать. Кроме того прижившимися iHeps ответил гиполипидемические препараты и резюмировалась клинические наблюдения повышенной эффективности PCSK9 антител, по сравнению с статины. Наши человеческой печени химерных модель таким образом может быть полезным для доклинических испытаний новых терапий для FH. Используя тот же протокол, аналогичных человеческой печени химерных мышей для других генетических вариантов FH или мутации, соответствующий других наследственных заболеваний печени, также могут быть созданы.
Introduction
Рецептор липопротеинов низкой плотности (LDLR) захватывает LDL холестерина (LDL-C) в крови, чтобы модулировать синтез холестерина в печени. Мутации в гене LDLR являются наиболее частой причиной семейной гиперхолестеринемией (FH)1. Статины традиционно первая линия препаратов для лечения FH и другие виды гиперхолестеринемии (унаследованные или приобретенных). Статины препятствовать 3-гидрокси-3-methylglutaryl кофермент редуктазы снизить синтез холестерина в печени2. Кроме того статины увеличить уровень LDLR на поверхности гепатоцитов содействовать плазмы LDL-C разминирование. Однако основных предостережение лечения статинами является, что они одновременно стимулировать выражение proprotein конвертазы Субтилизин/ОА 9 (PCSK9), фермент, который привязывается к LDLR для содействия ее деградации3. Этот эффект отвечает за недостаточное или даже null ответ на статинов у многих пациентов. Изучая этот механизм неожиданно, привело к открытию альтернативный способ лечения гиперхолестеринемии. PCSK9 антитела, недавно утвержденных FDA в настоящее время используется в клинических испытаниях и показать более высокой эффективности и лучшего терпимости чем статины4. Успех PCSK9 антител также подразумевает, что могут существовать другие терапевтические возможности для модуляции путь деградации LDLR (кроме PCSK9) у больных с гиперхолестеринемией. Аналогичным образом есть интерес к разработке новых ингибиторов PCSK9 помимо антител, например, siRNA oligos5.
Для тестирования новых терапий для FH и вообще любой другой тип гиперхолестеринемии, необходимы соответствующие в естественных условиях модели. Основной проблемой текущего в естественных условиях модели, основном мышей6 и кроликов7, являются их физиологические различия с людьми. Самое главное эти проблемы включают различные липидного метаболизма профиля. Поколение человеческой печени животных химерных8 может помочь преодолеть этот нюанс. Человеческой печени химерных мышь — это тип «гуманизированные» мышь с ее печень, заселена с человека гепатоцитов, например, основного человеческого гепатоцитов (ПГГ)9. Проблема с ПГГ состоит в том, что они не могут быть расширенной ex vivo, быстро теряют свою функцию после изоляции, и ограниченным источником. Альтернативой ПГГ является использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)-производных гепатоцитов (iHeps)10. Примечательно iPSCs конкретного пациента и может выращиваться на неопределенный срок, поэтому iHeps могут быть изготовлены по требованию, которая является значительным преимуществом над свежие ПГГ. Кроме того iPSCs также может быть легко генной инженерии с конструктора nucleases исправления или вводить мутации в isogenic фон, чтобы позволить более верным сравнения11.
Человеческой печени химерных мышь с прижившимися ПГГ показать сходство с людьми в печени метаболические профили, наркотиков ответы и восприимчивость к инфекции вируса гепатита12. Это делает их хорошей моделью для изучения гиперлипидемии в естественных условиях. Наиболее широко используемый мыши модели основаны на/фа- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (ФРГ) мыши13 и УПА трансгенные мыши8, в котором до 95% мыши печени могут быть заменены ПГГ. Интересно, что недавний доклад описал человека FH печени химерных мышь (основанный на мыши ФРГ) с ПГГ от пациента, перевозящих гомозиготных мутации LDLR 14. В этой модели repopulated человека гепатоцитов без функциональных LDLR, но остаточный мыши гепатоцитов сделал, тем самым уменьшая утилита для выполнения в vivo тестирование препаратов, опираясь на LDLR пути.
Здесь мы приводим подробный протокол, основанный на наших недавно опубликованной работе15 за отлаживание FH iHeps в/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) мыши печени. Эта человеческой печени химерных мышь является полезным для моделирования FH и выполнения тестирования на наркотики в vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные здесь методы, которые предполагают использование животных были утверждены Комитетом по использовать Live животных в области преподавания и научных исследований (CULATR) из университета Гонконга.
1. мышь, подготовка и фенотипические тестирования
-
Поколение иммунодефицитных Ldlr нокаут (KO) мышах.
- Используйте мышь штаммов Ldlr- / -, Rag2- / -и Il2rg- / - (см. Таблицу материалы).
- Крест Rag2- / - мышей с Il2rg- / - мышей для создания Rag2- / -/- / - мыши Il2rg, затем крест Ldlr- / - мышей с Rag2- / - / Il2rg- / - мышь для создания/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) мышах15. В возрасте от 3 до 4 недель Соберите геномной ДНК из уха для определения генотипа ПЦР и последовательности.
- В возрасте от 8 до 12 недель используйте LRG мышей-самцов в качестве получателей для iHeps для создания человеческой печени химерных мышей.
- Кормить мышей с высоким содержанием жиров и высоким уровнем холестерина диета (HFHC) за 7 дней до трансплантации ИФВЭ, чтобы помочь им развивать гиперхолестеринемии.
- Чтобы вызвать повреждение печени, что облегчает распространение прижившимися iHeps в печени, поместите мышей в стерильный контейнер и облучать их с помощью облучателя гамма с гамма-лучи в дозе 3 Gy 24 ч до приживления. Затем вернуть их жилья клетки мышей. Состояние Исправен эти облученных мышей может контролироваться путем измерения их веса. Мышей с потерей веса 20% или больше будет быть euthanized.
2. ИФВЭ дифференциации и диссоциации
Гетерозиготных KO LDLR (+/-) или гомозиготных человека iPSCs KO (- / -) или FH пациента iPSCs с гетерозиготной мутации в LDLR (FH iPSCs) используются для производства iHeps. Поколение LDLR + /- или- / - iPSCs и FH iPSCs описан в наших предыдущих доклада15.
- Направленного дифференцирования iPSCs в iHeps
Примечание: Метод дифференциации человека iPSCs в iHeps изменяется от предыдущего доклада16.- За три дня до дифференциации (день -3), семян iPSCs на внеклеточного матрикса покрытием 6-ну пластины (см. Таблицу материалы) на плотности 300 000 клеток/хорошо в 1,5 мл (и далее) человека iPSC обслуживания среды (см. таблица материалов ) дополнены рок ингибитором 5 мкм (Y27632). Культура клетки при 37 ° C в 5% CO2 увлажненные инкубатора. Как правило iHeps от 6-ну плиты достаточно привить 5 мышей.
- спустя 24 часа (сутки -2) и 48 h позже (день -1), измените средство свежий человека iPSC обслуживания среднего без добавления ингибитора рок.
Примечание: iPSCs до дифференциации следует выразить высокий уровень OCT4 и NANOG, который может быть проверен количественного RT-PCR, иммунофлюоресценции или проточной цитометрии. - В день 0 дифференциации вымыть клетки с RPMI 1640 раз, а затем добавить RPMI 1640, дополненная 100 нг/мл Activin A и 25 нг/мл WNT3a.
- В день 1, день 2 дифференциации измените носитель для RPMI 1640 дополнена 100 нг/мл Activin а.
Примечание: Если на данном этапе есть слишком много клеточную смерть (дней 0-3), вплоть до 0,5% плода бычьим сывороточным (ФБС) могут быть добавлены к средству улучшить жизнеспособность клеток. Однако мы предлагаем тестирование минимальное количество FBS быть добавлены для каждой конкретной iPSC линии, как избыток FBS может также повлиять на дифференциации. - На 3 день вымыть клетки с DMEM один раз и затем переключиться на 2 средний этапnd (замена 20% сыворотки, 1 x несущественные аминокислот, 2 M L-глютамина, 0,1 М бета меркаптоэтанол и 1% диметилсульфоксида в среде DMEM). Изменение среднего каждый день до 10 день.
Примечание: На 7 день, клетки должны достигли слияния и отображения четкие края. Там могут быть некоторые недифференцированные областей, появляющиеся на данном этапе; Игнорируйте их, если небольшой процент из этих областей. Если процент высок, уменьшить впадении iPSCs в день 0 и уменьшить количество ФБС, используемых на первой стадии дифференцировки. - На 10 день вымыть клетки с базальной среднего гепатоцитов один раз, а затем переключитесь гепатоцитов культуры среднего дополнены 20 нг/мл человеческой печени роста фактор и 20 нг/мл oncostatin M содействовать ИФВЭ созревания. Изменение среднего каждый день.
Примечание: на данном этапе > 90% клеток должен быть положительным для HNF4A, согласно иммунофлюоресценции пятнать или потока цитометрии. - В день 15 – 17 клетки готовы для приживления. При необходимости надосадке культуры клеток может собраны и температуре-80 ° C для количественной оценки секретируемые альбумина (ALB), iHeps.
Примечание: на данном этапе > 80% iHeps должно быть положительным для HNF4A, ALB и α1-антитрипсина (ААТ) согласно иммунофлюоресценции пятнать. Около 60 – 70% день 17 iHeps должно быть положительным для ASGPR, как показано в проточной цитометрии. В наших руках iHeps в этот период имеют оптимальные возможности для населить мыши печени; iHeps может выделяют высокий уровень ALB в пробирке, но и стать стареющей, если приживления задерживается.
- Диссоциация и загрузка iHeps в шприц инсулина
- Подготовьте необходимые реактивы и материалы:
- за 24 часа до приживления, оттепель требуемой суммы (V = 40 мкл * число мышей) внеклеточной матрицы в ледяной коробки в холодной комнате и положил шприц инсулина и коробка 200 мкл советы в 4 ° C холодильник.
- Один час до приживления, теплый фермента диссоциации клеток дополнена 50 мкг/мл DNase I до комнатной температуры и место среднего RPMI 1640, дополнены 20% сыворотки замена на льду.
- Возьмите фазы контраст изображения (100 X и 200 X) iHeps для записи их статуса, в том числе морфологии клеток, рост и плотность клеток.
- Мыть iHeps с 2 мл/хорошо комнатной температуре Ca2 + и Mg2 +-бесплатно PBS дважды, а затем добавить 1 мл фермента диссоциации клеток дополнена 50 мкг/мл DNase I для каждой скважины. Вернуть клетки в инкубатор для 8-10 мин.
Примечание: Чтобы улучшить диссоциации клеток с энзимом диссоциации клеток, вымыть клетки с Ca2 + и Mg2 +-бесплатно PBS. Чтобы максимизировать жизнеспособность клеток, мы предлагаем отделения не более чем 6 скважин в пакете одновременно. Кроме того мы предлагаем ограничить диссоциации клеток фермент лечение до менее чем 10 минут. - Контролировать морфологии клеток под микроскопом. Когда большинство из клетки становятся раунд, добавить равное количество холодной RPMI 1640, дополнены 20% сыворотки замена для каждой скважины, Пипетка клетки аккуратно отсоединить от плиты и передать новой трубки 15 мл суспензии клеток.
Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для жизнеспособности заготовленных клеток. Если клетки трудно отделить от плиты, не имеет значения, если некоторые из клеток остались. Если клетки отсоединить как большие квадраты монослоя, затем аккуратно Пипетка после центрифугирования для получения одной ячейки подвеска. - Повторите шаг 2.2.4 для каждого хорошо до тех пор, пока почти все прикрепленные клетки собираются. Центрифуга на 200 x g 3 мин при 4 ° C.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 2 мл холодного PBS в 15 мл. Пипетка клетки осторожно, чтобы получить подвески одной ячейки, а затем добавить холодной PBS в окончательный объем 1 мл * количество диссоциированных скважин. Наконец передайте клетки через стрейнер клеток 40 мкм, для удаления агрегатов.
Примечание: Обычно 1-2 х 106 клеток/скважины могут быть собраны после фильтрации. - Аликвота 20 мкл ячейки подвеска и 20 мкл раствора Трипановый синий 0,4%, затем подсчитать ячейки, используя автоматизированные ячейки счетчика и записывать концентрацию суспензию клеток как «C». Рассчитать необходимый объем (V1 = [106 * (n + 1)] / C, где n — это количество мышей, чтобы быть прижившимися) из суспензии клеток (1 000 000/мышь) для инъекций intrasplenic.
- Алиготе необходимый объем суспензии клеток в 15 мл пробирок и центрифуги на 200 x g 3 мин при 4 ° C.
- Удалить супернатант, Ресуспензируйте клетки в соответствующий объем холодной PBS сделать объем суспензии клеток (n + 1) * 55/2 мкл (n = количество мышей), а затем добавить равным объемом внеклеточной матрицы, чтобы сделать окончательный объем суспензии клеток (n + 1) * 55 мкл.
- Поместите шприц холодной инсулина на льду, выньте поршень, передача 55 мкл суспензии клеток в шприц и затем вернуть поршень. Тщательно выполнять пузыри и положил шприц обратно на льду.
- Повторите 2.3.10 до тех пор, пока все шприцы были загружены с клетками. Шприцы для инъекций теперь готовы.
Примечание: Чтобы повысить жизнеспособность клеток, мы рекомендуем сохранять клетки на льду после диссоциации. Для выше шаги 2.2.4–2.2.11 убедитесь, что все реагенты в 2-8 ° C перед использованием.
- Подготовьте необходимые реактивы и материалы:
3. intrasplenic инъекция iHeps
- Анестезировать мышей с кетамин (100 мг/кг) и вводили внутрибрюшинно Ксилазина (10 мг/кг). Надел мышей глаза для предотвращения сухости во время процедуры анестезии мазь ветеринара и контролировать их мышц рефлексы, чтобы наблюдать эффект анестезии и оценки боли.
- После того как мышей потеряли мышц рефлекса к стимуляции, поместите их в правый боковой пролежни позиции. Применить толстый слой депиляционный крем для области разреза на левом фланге для 5-8 мин. Затем удалите депиляционный крем и волос, вытирая области с марлевой смачивают водой.
- Скраб левый фланг с повидон йод или, альтернативно, с 70% этиловом спирте, 3 раза, после чего окончательный замачивания с повидон йода для дезинфекции.
- В 2-го уровня биобезопасности кабинета, найдите позицию селезенки, которые могут быть визуализированы прозрачно на левом фланге и затем надрезать кожу и брюшной стенки 0,5 – 1 см. неубранной селезенки, потянув жировой ткани мягко вблизи его, используя острые пинцет. Стабилизируйте селезенки, используя тампоном осторожно.
- Вставьте иглу шприца инсулина 3 – 4 мм в паренхимы селезенки и осторожно вставляют примерно 50 мкл суспензии клеток. Убрать иглы и наведите укола ватным тампоном на 1 минуту, чтобы предотвратить кровотечение и просыпания материала.
- Вернуться селезенки в брюшине и закрыть рану швы нейлона 5-0. Затем Держите мышей в теплой Камера/инкубатор для 3 – 16 h вернуть их к их нормальной температуры тела и возродить их. Мышей, которые подверглись операции не возвращаются в компании других животных до тех пор, пока полностью выздоровел.
- Добавить мелоксикам (26 мкг/мл) в питьевой воде и вставляют бупренорфин (50 мкг/кг) внутримышечно как противовоспалительный препарат и обезболивающее, соответственно. Монитор хирургической раны ежедневно, чтобы предотвратить любое воспаление.
Примечание: Убедитесь, что все инструменты и материалы, используемые в шагах 4-7 стерильны.
4. тест уровня LDL-C плазмы
- На 0, 7, 14, 21 и 28 дней после приживления сдерживать LRG мышей плотно свести к минимуму-бокового движения головы, с использованием метода двуручный удержать, а затем прокалывать лицевой Вены, используя lancet. Кровь начнет течь после удаления lancet. Соберите около 50 мкл крови в 1,5 мл пробирки, содержащие 1 мкл ЭДТА.
Примечание: Если захват является слишком жесткой, может быть уменьшен объем собранной крови и мышей может умереть из-за затрудненное дыхание. - Осторожно перемешать крови, инвертирование трубы несколько раз и затем центрифуги на 950 x g 15 мин supernatants собирать и хранить их в-80 ° C немедленно.
- После того, как собраны все образцы, оттепель плазмы при комнатной температуре и проверить уровень LDL-C, с помощью обнаружения kit LDL-C в соответствии с инструкцией производителя.
5. в естественных условиях тестирования на наркотики в химерных мышей, прижившимися с LDLR + / и FH iHeps
- Чтобы побудить гиперхолестеринемии, кормить мышей HFHC диета 7 дней до приживления.
- В 7 дней после приживления, относиться к каждой группе мышей с транспортного средства (PBS, вводят подкожно), 10 мг/кг/в неделю PCSK9 антител (клинико класса формулировка PCSK9 моноклональных антител, вводят подкожно тоже), 10 мг/кг/день симвастатин (40 мг/Л мг / Мл в питьевой воде), или комбинированные PCSK9 антител и симвастатин.
- Сбор плазмы мыши на 0 (в день приживления), 14, 21 и 28 дней после приживления. Хранение образцов-80 ° C немедленно.
- После того, как все образцы доступны, тест плазмы ЛПНП уровень, используя набор для обнаружения LDL-C, согласно инструкции производителя.
6. Эндотелиальная функция теста
Эндотелиальная функция влияет в начале FH и может быть проверена в нашей модели мыши как показатель степени тяжести болезни или оценить улучшения с различными процедурами. Stereomicrocope, рассечение щипцы, ножницы, myograph проволока, приобретение оборудования (см. Таблицу материалы), и для этого необходимы компьютер.
- Пожертвуйте мышей внутрибрюшинной инъекцией фенобарбитал 100 мг/кг. Удалите внутренние органы, чтобы нисходящей аорты, параллельно позвоночника является видимым и может рассечена ножницы вместе с прилегающих тканей и сердце из. Вскрыть aortae тонкой ножницами и поместите их в холодной кислородом растворе Кребса (мм: 119 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl2, 1 MgCl2, 25 NaHCO3, 1,2 кН2PO4и 11 D-глюкозы).
- Трансфер aortae в растворе Кребса в чашку Петри с силиконовым покрытием. PIN-код в соединительной ткани, чтобы исправить положение части аорты без растяжения его. Под стереомикроскопом, использование тонкой щипцы пружинные ножницы и вскрыть аорты, свободный от окружающих тканей жира и adventitial без повреждения стенки сосуда, затем разрезать его на 1,5-2 мм длина сегментов.
- Вырезать примерно 2 см длиной и 40 мкм толщиной нержавеющей проволоки и аккуратно положить через просвета аорты. Передача сегмента в палату myograph проволока, наполненный кислородом Кребс решения путем проведения проволоки.
- Чтобы измерить длину сегментов aortae при изучении сократимости, место каждого сегмента перпендикулярно между челюстями и запись чтение (1D) на Микрометр. Удалить сегмент и переместить челюсти вместе и записывать чтения (D0). Длина сегмента будет L = D1-D0.
- Следуйте инструкциям в руководстве пользователя крепления провода и закрепите его с отверткой, хотя размещение сегмента между челюстями, но оставить его нерастянутое.
- Для нормализации перед эксперимент установите myograph к нулю в положении прибить. Затем медленно перемещать челюсть помимо и наблюдать аорты напряженность изменить до достижения 3 млн. После 15 минут слейте раствор из myograph камеры и заменить свежим раствором Кребс, подождите 15 минут и отрегулируйте натяжение снова до 3 млн.
- Измените стандартное решение Кребс 60 мм раствор KCl содержащих Кребс побудить сжатия для по крайней мере 15 минут промыть свежим раствором Кребс 3 раза.
- Добавление увеличении концентрации фенилэфрина (ПТО; например, от 10 Нм до 100 мкм). Промыть раствором стандартных Кребс и добавить одну концентрацию Пхе на ~ 70% максимального сокращения от предыдущих сужением. При стабильным сужением, добавьте увеличение концентрации ацетилхолина (ACh; например, с 1 или 3 Нм до 10 или 30 мкм) вызвать вазодилатацию. ACh добавляется около 2 мин интервалом.
Примечание: В некоторых аорты сегментов с небольшой Phe индуцированной сокращения, например, меньше, чем 30% хлористого калия индуцированной сужением, U46619 (другой вазоконстриктора) в концентрациях от 1 Нм до 30 Нм может использоваться для стимулирования стабильного сокращения, что больше, чем 70% от KCl индуцированной сужением. - Очистите myograph согласно инструкции производителя.
- С помощью программного обеспечения для анализа данных (см. Таблицу материалы), рекорд силы (F) после каждого добавления наркотиков. Привлечь маркер к базальной напряженности (Fбазальную) для относительных измерений, переместите стрелку к самой высокой точке после пе как FПТОи затем перейти к самой низкой точке после каждого добавления ACh как FACh. Рассчитать ACh индуцированной эндотелий зависимой вазодилатацию (EDV) релаксация % = (FACh-Fбазальную) / (FPhe-Fбазальной) на оси y. Подготовьте ответ кривой концентрации на статистического программного обеспечения с помощью log10 значение концентрации в М по оси x.
- Для анализа статистической разницы, использовать площадь под кривой каждого сегмента с одной мыши и проанализировать разницу на площадь под кривой среди групп с использованием односторонней ANOVA. Отдельные точки также могут быть проанализированы при необходимости.
7. доказательства ИФВЭ заселение в печени мыши
- В конечной точке Пожертвуйте мышей путем инъекций внутрибрюшинно фенобарбитал 100 мг/кг.
- Сбор плазмы путем пункции сердца. Вскрыть долей печени, офтальмологический ножницами, а затем положить печень в 10см Пери блюдо и дважды промыть соленой. Удаление физиологического раствора с поверхности печени с фильтровальной бумаги, а затем вырезать лопастями в вокруг штук длина 0,6 см. Исправьте долей печени в формалина 10%.
- Внедрить фиксированной печень в парафин и раздел, используя ткань, обработки системы и раздвижные микротом, соответственно, согласно инструкциям производителя.
- Тепло слайды до 60 ° C за 1 ч до растопить воск. Затем дважды погружать слайды в ксилоле на 5 мин и увлажняет ткань с 100%, 90% и 70% этанол последовательно.
- Погружайте слайды в зале слайд содержащие около 50 мл раствора антигена поиска, а затем положить камеру в скороварку, 120 ° C для стирки 1.5 мин слайды плавно с трубой воды на 5 минут.
- Пятно секции с первичных антител (около 100 мкл/секция) ориентации человека ALB (hALB) и человека ядер антигена (СКС). Затем пятно с вторичные антитела, конъюгированных с флуоресцентные метки или пероксидаза (которая реагирует с DAB обнаружения kit).
- Чтобы вычислить процент hALB + областей и СКС + клеток, сканировать слайды витражи с анти hALB и анти СКС и прореагировало с DAB, с помощью автоматизированных слайд, сканирование системы, чтобы получить целый раздел изображения.
Примечание: Всего раздела отсканированные изображения полезны для расчета заполнения эффективность в непредвзято, основанные на hALB + областей или СКС + клеток в печени иммуногистохимия витражи. Как альтернативный метод для контроля эффективности заселение ИФВЭ плазменный уровень человеческого альбумина может быть проверена с помощью человека конкретных ALB ELISA kit. - Взять снимок изображения, чтобы покрыть весь слайд с помощью связанного цифровой слайд просмотра программного обеспечения под 5 X вид. Для количественной оценки доли hALB + районы, для каждого снимка изображения, использовать Микроскоп изображений программное обеспечение для получения положительной области (P) и (T) Общая площадь изображения и использовать изображения J для уточнения в пустой области (B). Процент hALB + районах выражается как P/(T-B) * 100%. Для каждой группы должен быть выбран по крайней мере 3 мышей. И для каждой мыши, следует выбрать по крайней мере 4 секции с разных позиций печени.
- Для количественной оценки доли СКС + клетки, для каждого снимка образа, произвольно выбрать 1/16 района с обработки изображений программное обеспечение и затем вручную подсчитать количество общего ядра (T) и СКС + ядер (N). Процент СКС + выражается как N/T * 100%. Для каждой группы должен быть выбран по крайней мере 3 мышей. Для каждой мыши должен быть выбран по крайней мере 4 секции с разных позиций печени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Направленного дифференцирования человека iPSCs в iHeps
При достижении 70% слияния, человеческие iPSCs дифференцированы в iHeps с 3-х ступенчатая протокол16 (рис. 1 верхняя группа). После 3 дней дифференцировки энтодермы iPSC колонии становятся ослабла и распространилась до полного слияния (Рисунок 1 нижней панели). Затем с 2 средний этапnd , hepatoblasts появляются и размножаться. Эти клетки переполнены, но показать четкие края, на данном этапе (день 7, нижней панели рис. 1 ). После 17 дней дифференциации поляризованные iHeps с типичной шестиугольника морфология появляются (Рисунок 1 нижней панели). Эти iHeps Экспресс ПГГ маркеров, в том числе ААТ и ALB (рис. 2A). Кроме того соотношение ASGPR + iHeps должно быть относительно высокими, измеряемый поток цитометрии (рис. 2B)15.
Поколение iHeps FH в Vivo болезни модель с помощью FH
Чтобы помочь LRG мышей развивать гиперхолестеринемии, мы их кормить с диетой, HFHC 7 дней до приживления (день -7). В день приживления (день 0) LRG мышей отображения около вывозимому плазменный уровень LDL-C (около 600 мг/дл, рисунок 3B). День 15 – 17 iHeps прижившимися в LRG мышей через intrasplenic инъекции; Эти iHeps вскоре проживают в паренхиме печени и размножаться там (рис. 3A). В конечной точке печень таких химерных мышей собраны и фиксированной, то окрашивали hALB и СКС, оба из которых должны показать четкое доказательство ИФВЭ опосредованной заселения печени печени мыши LRG основе пятная для hALB и СКС (Рисунок 4A-E). В наших руках, LDLR + / и FH iHeps может уменьшить плазмы LDL-C уровня значительно 21 дней после приживления (Рисунок 4F). На данный момент FH человеческой печени химерных мышей может использоваться для проверки терапии FH.
Проверка FH человеческой печени химерных мыши модели с использованием имеющихся лекарственных средств
Чтобы проверить нашу модель, мы использовали 2 известных LDL-C понижая наркотиков, СИМВАСТАТИН и PCSK9 антител (Рисунок 5A). Наши данные показывают, что 21 дней после лечения, PCSK9 антитела имеют сильнее способность для снижения LDL и EDV чем СИМВАСТАТИН FH химерных мышей (Рисунок 5B-D). В частности наблюдается процентное сокращение плазмы LDL-C с PCSK9 антител в FH химерных мышей похож на сообщили в клинических испытаниях4. Эти результаты свидетельствуют о потенциальной полезности LRG химерных мышей прижившимися с iHeps FH для Доклинические испытания новых препаратов для FH.
Рисунок 1: направлены дифференциация прав человека iPSCs в iHeps.Top группа, временная шкала для iPSC дифференцировку в iHeps; ключевых цитокинов и средства массовой информации указаны для каждой стадии. (Нижняя панель) Представитель этап контрастность изображения различных временных точек ИФВЭ дифференциации. KSR: нокаут сыворотки замена; HCM: гепатоцитов питательной среды; HGF: фактора роста гепатоцитов; OSM: oncostatin м. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: характеристика iHeps производится с изменение протокола дифференциация. (A) иммунофлюоресценции iHeps на различных стадиях дифференцировки. Ядер окрашенных в синий в Объединенном композиций. (B) бар, граф показывает процент ASGPR + iHeps производных получил на день 17, как измеряется проточной цитометрии. Образцы были измерены в 3 независимых экспериментах; показаны средние значения и погрешностей указать стандартное отклонение (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Поколение модели болезни FH In Vivo с iHeps. (A) время линия для поколения человеческой печени мышей химерных впрыской intrasplenic FH iHeps в LRG мышей. (B) бар, график показывает, что питание LRG мышей с HFHC диета приводит к значительно повысила уровень LDL-C (n = 10). P значения указаны на рисунке и были получены с помощью непарных t теста; показаны средние значения и погрешностей указывают Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Группа B изменяется от Рисунок 3I нашего предыдущего доклада15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: ИФВЭ опосредованным заселения печени мышей LRG. (A) представитель весь раздел сканирования изображение hALB окрашивание в печени мыши заселена с LDLR + / iHeps. Стрелки указывают скопления человека iHeps прижившимися в печени мыши; увеличенной разделы отображаются на правой панели. (B) точечная диаграмма показывает процент заполнения hALB + соответствующие ИФВЭ содержащих районы в мыши печени (от различных доноров iPSCs), расчет основан на весь раздел отсканированных изображений (n = 19). Показаны средние значения и погрешностей указывают SD. (C) представитель образы применением иммуногистохимического окрашивания для СКС в мыши печень с прижившимися FH iHeps. (D) гистограммы показывает процент заполнения СКС + iHeps (от различных доноров iPSCs) в LRG мыши печень (n = 3). Показаны средние значения и погрешностей указывают SD. (E) hALB и hNA окрашивания на двух последовательных участках мыши печени, заселена с дикого типа iHeps. (F) Гистограмма показывает процент плазмы снижения LDL-C от базовой линии на 21 день после приживления; n = 5 для LDLR + /-iHeps и n = 6 для FH iHeps и транспортного средства. P значения указаны на рисунке и были получены с помощью непарных t теста; приведены значения погрешностей указывают SEM. панелей B, D и E изменяются от Рисунок 3 gв виду-3I нашего предыдущего доклада15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : PCSK9 антитела Показать сильнее ЛПНП, снижение способности чем симвастатин в человеческой печени химерных LRG мышей. (A) Схематический вид препарата в vivo тестирование подход с использованием FH человеческой печени химерных мышей. (B и C) процентное изменение плазмы LDL-C от базовой линии в дни 14, 21 и 28 FH химерных мышей кормили с HFHC диета и лечение с указанных препаратов; n указывает количество мышей. P значения были получены с помощью Крускала-Уоллиса; показаны средние значения и погрешностей указывают SEM. (D) EDV в ответ на повышение концентрации ACh. P значения указаны на рисунке для указанной концентрации. P значения были получены с помощью двухсторонней ANOVA, скорректирована с Дуннетт множественные сравнения; планки погрешностей указывают что SEM. Рисунок 5 изменяется от Рисунок 4A-4 C и Рисунок 5A нашего предыдущего доклада15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предыдущие исследования с использованием iHeps грызунов подтвердили, что они являются эффективным способом для изучения наследственных заболеваний печени17. Для дальнейшего расширения использования этой технологии и потому что текущих FH Животные модели субоптимальные, мы прижившимися FH iHeps в LRG мышей и показали, что прижившимися LDLR + / или гетерозиготных LDLR-мутировавших FH iHeps можно уменьшить уровень мышей плазмы LDL-C и реагировать гиполипидемические препараты в естественных условиях.
Есть 3 важнейшие шаги в нашей протокол для создания человеческой печени FH химерных мышей с использованием iHeps:
1) производство высокого качества iHeps путем направленного дифференцирования. Учитывая клоновых изменчивость между iPSC линии18, важно, чтобы использовать isogenic iPSCs для правильного сравнения и проверить эффективность дифференциация ИФВЭ мать клеточной линии перед выполнением инженерных и приживления.
2) правильно ИФВЭ загрузки в шприц. Отличается от других протоколов мы используем 50% внеклеточного матрикса (конечная концентрация, v/v) Ресуспензируйте iHeps и затем загрузить их в шприц инсулина. Мы считаем, что внеклеточного матрикса защищает клетки и обеспечивает микроокружения, что облегчает ИФВЭ миграции в печени от хандры. Пузыри являются фактором смертельной для хирургии и следует избегать полностью в шприц.
3) правильное количество прижившимися клеток. Перегрузка клеток может также привести к высокая летальность. Мы рекомендуем, прививающих iHeps 1 – 1,5 млн за 25 – 30 g мышь.
Наш протокол также имеет некоторые ограничения: повреждения печени, вызванных облучением, умеренный и разовая доза, и созревания состояние нашего iHeps не сопоставимы с ПГГ. Связанные с обоих соображений, степень химеризма нашей модели похож на недавние сообщения, описывающие NOD/Lt-ТКИД/Ил 2Rγ/−− мышей или крыс Ганн, прижившимися с iPSC производные iHeps17,19 , но значительно ниже, чем ФРГ мышей или УПА трансгенных мышей прижившимися с ПГГ. Для преодоления этой оговоркой, с одной стороны, один может еще больше оптимизировать печеночная дифференциация протокол для улучшения созревания iHeps. С другой стороны LRG мышей может быть скрещивали с ФРГ мышей для создания Ldlr- / -/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - мышей.
Таким образом здесь мы описали подробный протокол для создания человеческой печени химерных животных с FH iHeps и для тестирования функциональности прижившимися iHeps. Важно отметить, что эти химерных мышей может использоваться для в естественных условиях тестирования на наркотики. Наша модель скорее всего может быть оптимизирована путем улучшения функциональности iHeps или выбив дополнительные гены (например., Фах) в получателя LRG мышей и он будет полезным для расследования патологических механизмов болезни и выполнять доклинических исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
H.-чл.КОРР является национальным координатором и следователь Одиссея результатов исследования, авторами Санофи и Regeneron Фармацевтика.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Shenzhen науки и технологии Совета основной исследовательской программы (JCYJ20150331142757383), стратегической приоритетной исследовательской программы Китайской академии наук (XDA16030502), Гонконг грант Совета темы на основе исследования Схема (T12-705/11), программа сотрудничества Фонда Национальный природный науки Китая (N-HKU730/12 и 81261160506), команда исследовательского проекта Гуандун естественных наук и научно-исследовательских грантов Совета Специального административного района Гонконг Фонд (2014A030312001), Гуанчжоу науки и технологий программы (201607010086) и провинции Гуандун науки и технологии программы (2016B030229007 и 2017B050506007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
