Summary
Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een menselijke lever chimeer muismodel van familiale hypercholesterolemie met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige hepatocyten. Dit is een waardevol model voor het testen van nieuwe therapieën voor hypercholesterolemie.
Abstract
Familiale hypercholesterolemie (FH) wordt meestal veroorzaakt door mutaties van low-density lipoprotein receptor (LDLR) en resulteert in een verhoogd risico op hart-en vaatziekten van early-onset als gevolg van de aanzienlijke verhoging van LDL cholesterol (LDL-C) in het bloed. Statines zijn de eerste regel van lipide-verlagende medicijnen voor de behandeling van FH en andere soorten hypercholesterolemie, maar nieuwe benaderingen zijn in opkomst, in bepaalde PCSK9 antilichamen, die nu zijn getest in klinische proeven. Voor het verkennen van nieuwe therapeutische benaderingen voor FH, nieuwe geneesmiddelen of nieuwe formuleringen, moeten we in vivo modellen nodig. Verschillen in de metabole lipidenprofielen vergeleken bij de mens zijn een kernprobleem van de beschikbare dierlijke modellen van FH. Om dit probleem te verhelpen, hebben we een muismodel van de menselijke lever chimeer met behulp van FH geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) gegenereerd-afgeleid van hepatocyten (iHeps). We gebruikten/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) muizen te vermijden immuun afwijzing van getransplanteerde menselijke cellen en te beoordelen van het effect van LDLR-deficiënte iHeps in een LDLR null achtergrond. Getransplanteerde FH iHeps kon weer toevoegen aan 5-10% van de IRG muis lever gebaseerd op menselijke albumine kleuring. Bovendien, het werk iHeps gereageerd op lipide-verlagende medicijnen en klinische waarnemingen van verhoogde efficiëntie van PCSK9 antilichamen t.o.v. statines gerecapituleerd. Onze menselijke lever chimeer model kan dus nuttig zijn voor preklinische testen van nieuwe therapieën voor FH. Met behulp van de hetzelfde protocol, soortgelijke menselijke lever chimeer muizen voor andere FH genetische varianten of overeenkomt met andere erfelijke lever ziekten, mutaties kan ook worden gegenereerd.
Introduction
Low-density lipoprotein receptor (LDLR) vangt LDL-cholesterol (LDL-C) in het bloed naar het moduleren van de synthese van cholesterol in de lever. Mutaties in het gen LDLR zijn de meest voorkomende oorzaak van familiale hypercholesterolemie (FH)1. Statines zijn traditioneel de eerste regel van medicatie voor de behandeling van FH en andere soorten hypercholesterolemie (geërfd of verworven). Statines remmen 3-hydroxy-3-methylglutaryl-co-enzym een reductase te verlagen van de synthese van cholesterol in de lever2. Bovendien, verhogen statines LDLR op het oppervlak van de hepatocyte ter bevordering van plasma LDL-C klaring. Een belangrijke caveat van behandeling met statines is echter dat ze gelijktijdig de expressie van het proprotein convertase subtilisin/hexin 9 (PCSK9), een enzym dat zich aan LDLR bindt te bevorderen de afbraak3induceren. Dit effect is verantwoordelijk voor de onvoldoende of zelfs null reactie op statines bij veel patiënten waargenomen. Bestuderen van dit mechanisme heeft onverwacht, geleid tot de ontdekking van een alternatieve manier voor de behandeling van hypercholesterolemie. PCSK9 antilichamen onlangs goedgekeurd door de FDA worden momenteel gebruikt in klinische proeven en Toon grotere werkzaamheid en betere tolerantie dan statines4. Het succes van PCSK9 antilichamen houdt ook in dat er mogelijk andere therapeutische mogelijkheden aan het moduleren van het traject van de LDLR-degradatie (behalve PCSK9) bij patiënten met hypercholesterolemie. Ook is er belang bij de ontwikkeling van nieuwe remmers van PCSK9 dan antilichamen, bijvoorbeeld, siRNA oligos5.
Als u wilt testen van nieuwe therapieën voor FH en in het algemeen een andere soort hypercholesterolemie, zijn passende in vivo modellen nodig. Een groot probleem van de huidige in-vivo modellen, meestal muizen6 en7, konijnen hun fysiologische verschillen met de mens. Deze problemen omvatten is cruciaal, een verschillende lipide metabole profiel. De generatie van menselijke lever chimeer dieren8 kan helpen overwinnen van deze waarschuwing. De menselijke lever Chimeer muis is een soort "gehumaniseerd" muis met haar lever opnieuw gevuld met menselijke hepatocyten, bijvoorbeeld primaire menselijke hepatocyten (pHH)9. Een probleem met pHH is dat ze niet kunnen uitgevouwen ex vivo, snel worden verliezen hun functie op isolatie, en een beperkte bron. Een alternatief voor pHH is het gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleid van hepatocyten (iHeps)10. Met name iPSCs patiënt-specifiek zijn en kunnen worden gekweekt voor onbepaalde tijd, zodat iHeps kunnen worden geproduceerd op vraag, die een aanzienlijk voordeel ten opzichte van verse pHH. Bovendien, iPSCs kan ook worden gemakkelijk genetisch gemanipuleerde met designer nucleasen te corrigeren of mutaties in een isogene achtergrond om meer trouw vergelijkingen11te voeren.
Menselijke lever Chimeer muis met werk pHH vertonen overeenkomsten op de mens in de lever metabool profielen, drug reacties en gevoeligheid voor hepatitis virus infectie12. Dit maakt ze een goed model te bestuderen hyperlipidemie in vivo. De meest gebruikte Muismodellen zijn gebaseerd op de/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (FRG) muis13 en de uPA transgene muis8, welke tot 95% van de muis lever door pHH vervangen kan. Interessant, beschreven een recent rapport een menselijke FH lever Chimeer muis (gebaseerd op de muis FRG) met pHH uit een patiënt een homozygoot LDLR mutatie14uitvoering. In dit model, de nieuwe menselijke hepatocyten had geen functionele LDLR, maar de resterende muis hepatocyten deed, waardoor het hulpprogramma voor het uitvoeren van de in vivo tests van drugs afhankelijk van de LDLR-pathway.
Wij rapporteren hier een gedetailleerde protocol is gebaseerd op onze onlangs gepubliceerde werk15 voor enten FH iHeps in de/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) muis lever. Deze menselijke lever Chimeer muis is handig voor het modelleren van FH en uitvoeren van de drug testen in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven die betrekking hebben op het gebruik van dieren zijn goedgekeurd door de Commissie op de gebruiken van levende dieren in het onderwijs en onderzoek (CULATR) van de Universiteit van Hongkong.
1. muis voorbereiding en fenotypische testen
-
Generatie van immunodeficiëntie Ldlr knock-out (KO) muizen.
- Gebruik de muizen stammen Ldlr- / - Rag2- /-en Il2rg- / - (Zie Tabel van materialen).
- Kruis Rag2- / - muizen met Il2rg- / - muizen voor het genereren van Rag2- / -/ Il2rg- / - muizen, kruis dan Ldlr- / - muizen met Rag2- / - / Il2rg- / - muizen voor het genereren van/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) muizen15. Op de leeftijd van 3 tot 4 weken, genomic DNA van het oor om te bepalen van het genotype door PCR en sequentiebepaling te verzamelen.
- Op de leeftijd van 8 tot 12 weken, door mannelijke LRG muizen als ontvangers voor iHeps voor het genereren van menselijke lever chimeer muizen te gebruiken.
- Feed de muizen met een hoog-vet en hoog cholesterol (HFHC)-dieet 7 dagen vóór de iHep transplantatie te helpen hen ontwikkelen van hypercholesterolemie.
- Om te induceren lever letsel dat de proliferatie van werk iHeps in de lever vergemakkelijkt, de muizen in een steriele container plaatsen en bestralen met behulp van een gamma irradiator met γ-stralen bij een dosis van 3 Gy 24 h vóór engraftment. Vervolgens terug de muizen naar hun kooien huisvesting. De status in orde krijgt van deze bestraalde muizen kan worden gecontroleerd door het meten van hun gewicht. Muizen met 20% verlies van het gewicht of groter zal worden euthanized.
2. iHep differentiatie en dissociatie
De heterozygoot KO LDLR (+/-) of homozygoot KO (- / -) menselijke iPSCs of FH patiënt-iPSCs met heterozygoot mutaties in LDLR (FH iPSCs) worden gebruikt voor de productie van iHeps. De generatie van LDLR +/- of- / - iPSCs en FH iPSCs wordt beschreven in onze eerdere verslag15.
- Gestuurde differentiatie van iPSCs in iHeps
Opmerking: De methode voor differentiatie van menselijke iPSCs in iHeps is gewijzigd van een vorige verslag16.- Drie dagen vóór de differentiatie (dag -3), zaad de iPSCs op de extracellulaire matrix gecoat 6-Wells-platen (Zie Tabel van materialen) bij een dichtheid van 300.000 cellen per putje in 1,5 mL (ook hierna) menselijke iPSC onderhoud voedingsbodem (Zie tabel van materialen ) aangevuld met 5 µM ROCK remmer (Y27632). Cultuur van de cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator. Normaal, zijn iHeps van een 6-well-plate voldoende om engraft 5 muizen.
- 24 uur later (dag -2) en 48 uur later (dag -1), te wijzigen in het medium verse menselijke iPSC onderhoud normaal zonder ROCK inhibitor.
Opmerking: iPSCs voordat differentiatie hoge niveaus van OCT4 en NANOG, die kan worden onderzocht door kwantitatieve RT-PCR, immunofluorescentie of stroom cytometry moet uitspreken. - Op dag 0 van differentiatie, de cellen met RPMI 1640 keer wassen en voeg vervolgens RPMI 1640 aangevuld met 100 ng/mL Activin A en 25 ng/mL WNT3a.
- Op dag 1 en dag 2 van differentiatie, het medium voor RPMI 1640 aangevuld met 100 ng/mL Activin A. wijzigen
Opmerking: Als er teveel celdood in dit stadium is (0-3 dagen), maximaal 0,5% foetale runderserum (FBS) kan worden toegevoegd aan het medium ter verbetering van de levensvatbaarheid van de cellen. Wij stellen echter voor testen van de minimale hoeveelheid FBS worden toegevoegd voor elke specifieke iPSC-regel, zoals overtollige FBS kan ook invloed hebben op de differentiatie. - Op dag 3, wassen van de cellen met DMEM eens en ga op 2nd fase gemiddeld (20% serum vervanging, 1 x niet-essentiële aminozuren, 2 M L-glutamine, beta-mercaptoethanol 0,1 M en 1% dimethylsulfoxide in DMEM medium). Wijzig het medium om de andere dag tot dag 10.
Opmerking: Op dag 7, de cellen moeten hebben bereikt samenvloeiing en duidelijke randen van de display. Er zou sommige ongedifferentieerde gebieden verschijnen in dit stadium; ze negeren als het percentage van deze gebieden klein is. Als het percentage hoog is, verlaagt u de samenvloeiing van de iPSCs op dag 0 en verminderen de hoeveelheid FBS gebruikt in de eerste fase van de differentiatie. - Op dag 10, de cellen met hepatocyte Basaal medium keer wassen en vervolgens overschakelt naar de hepatocyte kweekmedium aangevuld met 20 ng/mL menselijke hepatische groeifactor en 20 ng/mL oncostatin M ter bevordering van de rijping van de iHep. Wijzig het medium om de andere dag.
Opmerking: in dit stadium > 90% van de cellen volgens kleuring of stroom cytometry van de immunofluorescentietest positief voor HNF4A, moet worden. - Op dag 15 – 17: de cellen zijn klaar voor engraftment. Optioneel, kan het supernatant van de cultuur van de cel worden verzameld en opgeslagen bij-80 ° C voor het kwantificeren van de secreted albumine (ALB) door iHeps.
Opmerking: in dit stadium > 80% iHeps moet positief voor HNF4A, ALB en alpha1-antitrypsine (AAT) volgens immunofluorescentie kleuring. Ongeveer moet 60-70% van de dag 17 iHeps positief voor ASGPR, zoals blijkt uit de stroom cytometry. In onze handen hebben iHeps in deze periode optimale capaciteit aan repopulate de muis lever; iHeps kan afscheiden van hogere niveaus van ALB in vitro maar ook worden verouderend als de engraftment is vertraagd.
- Dissociatie en laden van iHeps in een insuline spuit
- Het opstellen van de benodigde reagentia en materialen:
- 24 h vóór engraftment, ontdooien het normbedrag (V = 40 µL * muizen nummer) van de extracellulaire matrix in een ijs vak in een koude kamer, en de insuline spuit en een doos van 200 µL tips in een koelkast 4 ° C worden gebracht.
- Een uur vóór engraftment, warme de cel dissociatie enzym aangevuld met 50 µg Mo/mL DNase ik tot kamertemperatuur en plaats het medium van de RPMI 1640 aangevuld met 20% serum vervanging op ijs.
- Neem fase contrast beelden (100 X en X 200) van iHeps hun status, met inbegrip van cel morfologie, groei en celdichtheid wilt vastleggen.
- Wassen van iHeps met 2 mL/goed of kamertemperatuur Ca2 + en Mg2 +-gratis PBS tweemaal en voeg vervolgens 1 mL van cel dissociatie enzym aangevuld met 50 µg Mo/mL DNase ik aan elk putje. Zet de cellen terug in de incubator voor 8-10 min.
Opmerking: Om te verbeteren cel dissociatie met cel dissociatie enzym, wassen de cellen met Ca2 + en Mg2 +-gratis PBS. Levensvatbaarheid van de cellen te maximaliseren, is het raadzaam de distantiëren van niet meer dan 6 wells per batch op een moment. Bovendien is het raadzaam de cel dissociatie enzym behandeling tot minder dan 10 minuten te beperken. - Monitor de morfologie van de cel onder de Microscoop. Wanneer allermeest naar de cellen ronde worden, voeg een gelijk volume van koude RPMI 1640 aangevuld met 20% serum vervanging aan elk putje Pipetteer de cellen voorzichtig losmaken van de plaat en de celsuspensie overbrengen in een nieuwe tube van 15 mL.
Opmerking: Deze stap is essentieel voor de levensvatbaarheid van de geoogste cellen. Als de cellen niet goed om los van de plaat te zijn, het maakt niet uit als sommige van de cellen zijn overgebleven. Als de cellen als grote pleinen van enkelgelaagde loskoppelen, pipetteer dan voorzichtig na het centrifugeren te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel. - Herhaal stap 2.2.4 voor elk goed totdat bijna alle gekoppelde cellen worden verzameld. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 2 mL koude PBS in een tube van 15 mL. Pipetteer van de cellen zachtjes voor het verkrijgen van een eencellige schorsing en voegt u koude PBS tot een eindvolume van 1 mL * aantal gedissocieerde wells. Ten slotte, passeren de cellen een 40 µm cel zeef verwijderen aggregaten.
Opmerking: Normaal 1-2 x 106 cellen/goed kan worden geoogst na filtering. - Aliquot 20 µL van cel schorsing Voeg 20 µL van 0.4% trypan blauw-oplossing, met behulp van een geautomatiseerde cel counter cellen tellen en de concentratie van celsuspensie als "C" wordt geregistreerd. Berekenen van het vereiste volume (V1 = [106 * (n + 1)] / C, waarbij n is het aantal muizen te worden geaccepteerd) van celsuspensie (1 miljoen/muis) voor intrasplenic injectie.
- Aliquot deel de vereiste hoeveelheid celsuspensie in 15 mL tubes en centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer de cellen in de juiste hoeveelheid koud PBS te maken van de omvang van de celsuspensie (n + 1) * 55/2 µL (n = aantal muizen), en voegt u een gelijk volume van extracellulaire matrix te maken van het uiteindelijke volume van de celsuspensie (n + 1) * 55 µL.
- Plaats de koude insuline spuit op ijs, haal de zuiger, 55 µL celsuspensie Pipetteer in de spuit en zet dan de zuiger terug. Ontlaadt bubbels zorgvuldig en zet de spuit weer op ijs.
- Herhaal 2.3.10 totdat alle spuiten zijn geladen met de cellen. De spuiten zijn nu klaar voor de injectie.
Opmerking: Om te maximaliseren de levensvatbaarheid van de cellen, we raden de cellen op het ijs na dissociatie. Voor de bovenstaande stappen 2.2.4–2.2.11, zorg ervoor dat alle reagentia voor gebruik bij 2-8 ° C worden gehouden.
- Het opstellen van de benodigde reagentia en materialen:
3. intrasplenic injectie van iHeps
- Anesthetize van de muizen met ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) geïnjecteerd intraperitoneally. Dierenarts zalf zetten muizen ogen om te voorkomen dat droogte tijdens de procedure verdoving en volgen hun reflexen van de spier om te kijken wat effect is van de narcose en beoordelen van de pijn.
- Zodra muizen hebben verloren spier reflex aan stimulatie, plaats ze in de juiste positie van de laterale decubitus. Een dikke laag ontharende room van toepassing op het gebied van de incisie in de linkerflank voor 5 – 8 min. Verwijder vervolgens de ontharende room en haren door te vegen het gebied met een water-bevochtigd gaas zeem.
- Schrob de linkerflank met Povidon-jodium of, als alternatief, met 70% ethanol 3 keer gevolgd door een laatste inweken met Povidon-jodium voor desinfectie.
- Zoek in een niveau 2 bioveiligheid kabinet, de positie van de milt, die transparant kan worden gevisualiseerd in de linkerflank, en vervolgens incise van de huid en de buikwand voor 0,5 – 1 cm. Exteriorize de milt door te trekken uit het vetweefsel voorzichtig in de buurt van het gebruik van puntige pincet. Het stabiliseren van de milt met behulp van een wattenstaafje zachtjes.
- De naald van de insuline spuit 3-4 mm steek de parenchym van de milt en ongeveer 50 µL celsuspensie zachtjes te injecteren. Intrekken van de naald en plaats een wattenstaafje over de injectieplaats voor 1 minuut te voorkomen bloeden en morsen van materiaal.
- De milt terug te keren naar het buikvlies en de wond met 5 – 0 nylon hechtingen te sluiten. Houd vervolgens, muizen in een warme kamer/incubator voor 3 – 16 h hen terug te keren naar hun normale lichaamstemperatuur en blazen ze. Muizen die een operatie hebben ondergaan niet worden teruggestuurd naar het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld.
- Meloxicam (26 μg/mL) toevoegen aan het drinkwater en injecteren buprenorfine (50 μg/kg) intramuscularly als anti-inflammatoire drugs- en pijnstillend, respectievelijk. Monitor chirurgische wonden dagelijks om te voorkomen dat een ontsteking.
Opmerking: Zorg ervoor dat alle instrumenten en supplies gebruikt in stap 4-7 zijn steriel.
4. test van Plasma LDL-C niveau
- Op dag 0, 7, 14, 21 en 28 na engraftment, beperken de IRG muizen strak om te minimaliseren van links-naar-rechts beweging van het hoofd tweehandige restrain methode, dan doorprikken van de facial ader met behulp van de lancet. Bloed zal beginnen te stromen na verwijdering van de lancet. Ongeveer 50 µL bloed in 1,5 mL tubes met 1 µL van EDTA verzamelen.
Opmerking: Als de grip te krap is, het verzamelde bloed-volume kan worden verminderd en muizen kunnen sterven als gevolg van ademhaling moeite. - Meng het bloed zachtjes door het omkeren van de buizen meerdere malen en dan Centrifugeer bij 950 x g gedurende 15 min. het supernatant verzamelen en opslaan bij-80 ° C onmiddellijk.
- Zodra alle monsters worden verzameld, het plasma op kamertemperatuur ontdooien en testen van de LDL-C-niveau met behulp van een LDL-C detectie kit volgens de handleiding van de fabrikant.
5. in Vivo Drug Testing in chimeer muizen geaccepteerd met LDLR +/- en FH-iHeps
- Om te induceren hypercholesterolemie, voeden de muizen een HFHC dieet 7 dagen vóór de engraftment.
- Bij 7 dagen na engraftment, behandeling van elke groep van muizen met voertuig (PBS, subcutaan geïnjecteerd), 10 mg/kg/week PCSK9 antilichamen (een klinisch-grade formulering van PCSK9 monoclonal antilichamen, subcutaan geïnjecteerd ook), 10 mg/kg/dag simvastatine (40 mg/L mg / mL in het drinkwater), of gecombineerd van PCSK9 antilichamen en simvastatine.
- Verzamelen muis plasma op dagen 0 (de dag van engraftment), 14, 21 en 28 na engraftment. De monsters bij-80 ° C onmiddellijk opslaan.
- Zodra alle monsters beschikbaar zijn, testen de plasma LDL-niveau met behulp van een LDL-C detectie kit, volgens de handleiding van de fabrikant.
6. endothelial functietest
Endotheel functie vroeg in FH wordt beïnvloed en kan worden getest in onze muismodel als indicator voor de ernst van de ziekte of om te evalueren van de verbetering met verschillende behandelingen. Een stereomicrocope, dissectie pincet, schaar, draad myograph, overname hardware (Zie Tabel of Materials), en een computer nodig voor dit.
- Offeren de muizen door intraperitoneale injectie van 100 mg/kg fenobarbital. Inwendige organen te verwijderen zodat de aflopende aorta parallel aan de wervelkolom zichtbaar is en uit kan worden ontleed door schaar samen met aangrenzende weefsel en hart. Ontleden de aortae met fijne schaar en plaats ze in koude zuurstofrijk Krebs-oplossing (mM: 119 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl2, 1 MgCl2, 25 NaHCO3, 1.2 KH2PO4en 11 D-glucose).
- De aortae in Krebs oplossing overbrengen in een petrischaal siliconen-coating. PIN het bindweefsel te lossen van de aorta positie zonder uit te rekken. Onder een stereomicroscoop, gebruik fijne pincet voorjaar de schaar en ontleden de aorta vrij van het omringende vet- en adventitial weefsel zonder beschadiging van de vaatwand, dan snijd het in 1,5 tot 2 mm lengte segmenten.
- Knip een ongeveer 2 cm lang en 40 μm dik RVS draad en zachtjes doorgeschakeld naar de aorta lumen. Het segment overbrengen in de draad myograph kamer gevuld met zuurstofrijk Krebs oplossing door de draad te houden.
- Voor het meten van de lengte van de segmenten aortae bij de studie van contractility, plaatst u elk segment loodrecht tussen de kaken en de lezing (D1) record op de micrometer. Verwijderen van het segment en samen bewegen van de kaken en de lezing (D0) opnemen. De lengte van het segment zou L = D1-D0.
- Volg de gebruikersgids om de klem van de draad en veilig met de schroevendraaier terwijl het segment tussen de kaken te plaatsen, maar laat het verband.
- Voor normalisatie voordat het experiment, stelt u de myograph op nul in de zonder rek positie. Vervolgens langzaam verplaatsen van de kaak uit elkaar en de spanning van de aorta wijzigen tot het bereiken van de 3 mN observeren. Na 15 minuten, drain de oplossing van de myograph-zaal, en vervangen door verse Krebs oplossing, wacht 15 min en aanpassen van de spanning aan 3 mN opnieuw.
- Wijzig de standaardoplossing Krebs tot 60 mM KCl-bevattende Krebs oplossing voor het opwekken van een samentrekking voor minstens 15 min. spoelen met verse Krebs oplossing 3 keer.
- Toevoegen van toenemende concentraties van phenylephrine (Phe; bijvoorbeeldvan 10 nM tot 100 μM). Wassen met standaardoplossing Krebs en voeg een enkele concentratie van Phe aan ~ 70% van de maximale samentrekking van de vorige contractie. Wanneer de samentrekking is stabiel, het toevoegen van toenemende concentraties van acetylcholine (ACh; bijvoorbeeldvan 1 of 3 nM tot 10 of 30 µM) ertoe vasodilatatie. ACh wordt toegevoegd met ongeveer 2 min interval.
Opmerking: In sommige aorta segmenten met kleine Phe-geïnduceerde contractie, bijvoorbeeld kleiner dan 30% van KCl geïnduceerde contractie, U46619 (een ander vasoconstrictor) met een concentratie van 1 nM tot en met 30 nM kan worden gebruikt voor het opwekken van een stabiele contractie die groter is dan 70% van KCl-geïnduceerde contractie. - Reinig de myograph volgens de handleiding van de fabrikant.
- Met behulp van de software van de analyse van de gegevens (Zie Tabel of Materials), record de kracht (F) na elke toevoeging van drugs. De markering vestigen basale spanning (Fbasale) voor relatieve metingen, verplaatst u de pijl naar het hoogste punt na Phe als FPhe, en verplaats naar het laagste punt na elke toevoeging van ACh als FACh. Berekenen van de ACh-geïnduceerde endotheel-afhankelijke vasodilatatie (EDV) door % ontspanning = (FACh-Fbasale) / (FPhe-Fbasale) op de y-as. Bereiden een concentratie responscurve op statistische software met behulp van de log10-waarde van de concentratie in M op de x-as.
- Om het statistisch verschil te analyseren, het oppervlak onder de kromme van elk segment van een muis te gebruiken en analyseren van het verschil van het gebied onder de curve fracties met one-way ANOVA. Afzonderlijke punten kunnen ook worden geanalyseerd indien nodig.
7. bewijs van iHep herbevolking in de lever van de muis
- Aan het eindpunt, de muizen te offeren door het injecteren van intraperitoneally 100 mg/kg fenobarbital.
- Het verzamelen van plasma door cardiale punctie. Ontleden lobben van de lever met behulp van oogheelkundige schaar, dan levers gestoken met een 10-cm peri-schotel en spoel tweemaal met zoutoplossing. Saline verwijderen uit de lever oppervlak met absorberend papier, knip dan de kwabben in rond 0.6-cm-lengte stukken. Corrigeer de lobben van de lever in 10% formaline.
- De vaste levers insluiten in paraffine en sectie met behulp van een tissue verwerking van systeem en een glijdende microtome, respectievelijk, volgens de instructies van de fabrikant.
- Verwarm de dia's tot 60 ° C gedurende 1 uur te smelten van de was. Vervolgens tweemaal de dia's in xyleen gedurende 5 min. onderdompelen en het weefsel met 100%, 90% en 70% ethanol achtereenvolgens hydrateren.
- Dompel de dia's in de dia-kamer met ongeveer 50 mL van de oplossing van de gegevensherwinning van antigeen en zet dan de kamer in de snelkookpan, 120 ° C gedurende 1,5 min. Wash de dia's met pijp voorzichtig water gedurende 5 minuten.
- Vlek van de secties met primaire antilichamen (ongeveer 100 µL/sectie) gericht op menselijke ALB (hALB) en menselijke kernen antigeen (hNA). Vervolgens vlek met secundaire antilichamen zijn geconjugeerd met een fluorescerende label of mierikswortelperoxidase (die reageert met de DAB detectie kit).
- Voor de berekening van het percentage hALB + gebieden en hNA + cellen, scan de dia's gekleurd met anti-hALB en anti-hNA en gereageerd met schar met behulp van een geautomatiseerde dia scannen systeem om hele sectie beelden te krijgen.
Opmerking: Geheel sectie-gescande afbeeldingen zijn handig voor het berekenen van nieuwe efficiëntie op onpartijdige wijze op basis van hALB + gebieden of hNA + cellen in de lever van immunohistochemistry-gekleurd. Als een alternatieve methode om te controleren iHep herbevolking efficiëntie, kan plasma menselijke albumine niveau worden getest met behulp van een menselijke specifieke ALB ELISA-kit. - Het nemen van momentopname beelden ter dekking van de hele dia met behulp van de bijbehorende digitale dia software onder 5 X weergave weergeven. Te kwantificeren van het percentage van hALB + gebieden, voor elke momentopname afbeelding, gebruik de Microscoop beeldbewerkingssoftware te kwalificeren de positieve ruimte (P) en de totale oppervlakte (T) van het beeld, en Image J te kwalificeren van de lege ruimte (B). Het percentage van hALB + gebieden wordt uitgedrukt als P/(T-B) * 100%. Voor elke groep, moeten ten minste 3 muizen zijn geselecteerd. En voor elke muis, ten minste 4 secties uit verschillende posities van de lever moeten worden geselecteerd.
- Kwantificeren van het percentage van hNA + cellen, voor elke momentopname afbeelding, willekeurig selecteert u 1/16 van het gebied met een beeldverwerkingssoftware en vervolgens handmatig tellen het aantal totale kernen (T) en hNA + kernen (N). Het percentage van hNA + wordt uitgedrukt in N/T * 100%. Voor elke groep, moeten ten minste 3 muizen zijn geselecteerd. Voor elke muis, moeten ten minste 4 secties uit verschillende posities van de lever worden geselecteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gestuurde differentiatie van menselijke iPSCs in iHeps
Bij het bereiken van 70% samenvloeiing, worden menselijke iPSCs onderscheiden in iHeps met een 3-stap protocol16 (Figuur 1 bovenste deelvenster). Na 3 dagen van endoderm differentiatie, worden iPSC kolonies losgemaakt en verspreiden tot volledige samenkomst (Figuur 1 lagere paneel). Vervolgens met 2nd fase medium, hepatoblasts verschijnen en vermenigvuldigen. Deze cellen zijn overvol maar duidelijke randen tonen in dit stadium (dag 7, lagere paneel van Figuur 1 ). Na 17 dagen van differentiatie weergegeven gepolariseerde iHeps met typische zeshoek morfologie (Figuur 1 lagere paneel). Deze iHeps express pHH markers, met inbegrip van AAT en ALB (figuur 2A). Bovendien moet de verhouding tussen ASGPR + iHeps de relatief hoog, zoals gemeten door stroom cytometry (figuur 2B)15.
Generatie van een FH In Vivo ziekte Model met behulp van FH-iHeps
Om te helpen LRG muizen hypercholesterolemie ontwikkelen, voeden wij ze met een HFHC dieet 7 dagen vóór de engraftment (dag -7). Op de dag van engraftment (dag 0) weer LRG muizen rond 3-voudig plasma LDL-C niveau (rond 600 mg/dL, figuur 3B). Dag die 15-17 iHeps zijn geaccepteerd in LRG muizen via intrasplenic injectie; Deze iHeps al snel bevinden zich in de lever parenchym en er vermenigvuldigen (figuur 3A). Bij het eindpunt, worden levers van deze chimeer muizen verzameld en vaste, wordt gekleurd met hALB en hNA, die beide moeten duidelijk bewijs van iHep-gemedieerde lever herbevolking in LRG muis lever op basis van kleuring voor hALB en hNA (figuur 4A-E). In onze handen, kunnen LDLR +/- zowel FH iHeps plasma LDL-C niveau aanzienlijk 21 dagen na engraftment (figuur 4F) verminderen. Op dit punt, kunnen FH menselijke lever chimeer muizen worden gebruikt voor het testen van therapieën voor FH.
Validatie van FH menselijke lever chimeer muismodel beschikbaar Drugs gebruiken
Om te controleren ons model, we gebruikten 2 bekende LDL-C verlaging drugs, simvastatine en PCSK9 antilichamen (figuur 5A). Onze gegevens tonen aan dat 21 dagen na de behandeling, PCSK9 antilichamen een sterker vermogen voor verlaging van de LDL en EDV dan simvastatine in FH chimeer muizen (figuur 5B-D hebben). Met name is de waargenomen procentuele vermindering van plasma LDL-C met PCSK9 antilichamen in FH chimeer muizen vergelijkbaar met die gerapporteerd in klinische proeven4. Deze resultaten tonen aan dat het potentiële nut van LRG chimeer muizen geaccepteerd met FH iHeps voor preklinische testen van nieuwe medicijnen voor FH.
Figuur 1: regie differentiatie van menselijke iPSCs in het Comité van de iHeps.Top, tijdlijn voor iPSC differentiatie in iHeps; belangrijkste cytokines en media staan voor elk stadium. (Lagere paneel) Representatieve fase contrast beelden op verschillende tijdstippen van de differentiatie van de iHep. KSR: knock-out serum vervanging; HCM: hepatocyten kweekmedium; HGF: hepatocyte groeifactor; OSM: oncostatin M. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: karakterisering van iHeps geproduceerd met differentiatie Protocol bewerkt. (A) immunofluorescentie van iHeps in verschillende stadia van differentiatie. Kernen zijn gekleurd in het blauw in de samengevoegde composities. (B) Bar grafiek toont het percentage van ASGPR + iHeps afgeleid verkregen op dag 17, zoals gemeten door stroom cytometry. Monsters werden gemeten in 3 onafhankelijke experimenten; gemiddelde waarden worden weergegeven en foutbalken geven standaarddeviatie (SD). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Generatie van een FH In Vivo ziekte Model met iHeps. (A) tijd lijn voor de generatie van menselijke lever chimeer muizen door intrasplenic injectie van FH iHeps in LRG muizen. (B) Bar grafiek toont dat voeding LRG muizen met HFHC dieet leidt tot aanzienlijk verhoogd niveau van LDL-C (n = 10). P -waarden worden aangegeven op de figuur en werden verkregen met behulp van een ongepaard t-test; gemiddelde waarden worden weergegeven en foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Deelvenster B is aangepast ten opzichte van de figuur 3I van onze vorige verslag15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: iHep Mediated herbevolking van LRG muizen lever. (A) representatieve hele sectie-gescande afbeelding van hALB kleuring in een muis lever opnieuw gevuld met LDLR +/-iHeps. Pijlen geven aan clusters van menselijke iHeps geaccepteerd in de muis lever; ingezoomde secties worden weergegeven in het rechter paneel. (B) Scatter perceel grafiek het percentage van toont herbevolkt hALB + overeenkomt met iHep-bevattende gebieden in de lever van een muis (van verschillende donor iPSCs), de berekening werd gebaseerd op de hele sectie-gescande afbeeldingen (n = 19). Gemiddelde waarden worden weergegeven en foutbalken geven SD. (C) representatieve beelden van immunohistochemische kleuring voor hNA in de lever van een muis met werk FH iHeps. (D) Bar grafiek toont het percentage van de nieuwe hNA + iHeps (van verschillende donor iPSCs) in LRG muis levers (n = 3). Gemiddelde waarden worden weergegeven en foutbalken geven SD. (E) hALB en hNA kleuring aan twee opeenvolgende onderdelen van een muis lever opnieuw gevuld met wild type iHeps. (F) Bar grafiek toont het percentage van plasma LDL-C verlaging van de basislijn op dag 21 na engraftment; n = 5 voor LDLR +/-iHeps en n = 6 voor FH iHeps en het voertuig. P -waarden worden aangegeven op de figuur en werden verkregen met behulp van een ongepaard t-test; bedoel waarden staan Foutbalken geven SEM. panelen B, D en E zijn gewijzigd van Figuur 3 g-3I van onze vorige verslag15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : PCSK9 antilichamen Toon sterker LDL verlagen vermogen dan simvastatine in menselijke lever chimeer LRG muizen. (A) Schematische weergave van de in vivo drugstests aanpak met behulp van FH menselijke lever chimeer muizen. (B en C) procentuele verandering van plasma LDL-C basislijn dagen 14, 21 en 28 in FH chimeer muizen gevoed met HFHC dieet en behandeld met de aangegeven drugs; n geeft aantal muizen. P -waarden werden verkregen met behulp van een Kruskal-Wallis-test; gemiddelde waarden worden weergegeven en foutbalken geven SEM. (D) EDV in reactie op de toenemende concentraties van ACh. P -waarden worden aangegeven op de figuur voor de aangegeven concentratie. P -waarden werden verkregen met two-way ANOVA aangepast met Dunnett van meerdere vergelijking; Foutbalken geven dat SEM. Figuur 5 is uit figuur 4A-4 C en figuur 5A van onze vorige verslag15. gewijzigd Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eerdere studies met behulp van iHeps in knaagdieren hebben bevestigd dat zij een effectieve manier zijn om het studeren overgenomen leverziekten17. Verder uitbreiden van het gebruik van deze technologie omdat huidige FH diermodellen suboptimaal zijn, wij en FH iHeps geaccepteerd in LRG muizen is gebleken dat het werk LDLR +/- of heterozygoot LDLR-gemuteerde FH iHeps muizen plasma LDL-C niveau kan verminderen en reageren op het lipide-verlagende drugs in vivo.
Er zijn 3 belangrijke stappen in ons protocol voor het genereren van menselijke FH lever chimeer muizen met behulp van iHeps:
1) productie van kwalitatief hoogwaardige iHeps via gestuurde differentiatie. Gezien de klonale variabiliteit tussen iPSC lijnen18, is het belangrijk te gebruiken isogene iPSCs voor goede vergelijkingen en te testen van de efficiëntie van de differentiatie iHep van de moeder cellijn voor het uitvoeren van de engineering en de engraftment.
2) juiste iHep kunnen worden geüpload naar de spuit. Anders dan andere protocollen, wij gebruiken 50% extracellulaire matrix (eindconcentratie, v/v) aan resuspendeer iHeps, en ze vervolgens uploaden naar de insuline spuit. Wij zijn van mening dat de extracellulaire matrix cellen beschermt en zorgt voor een communicatie die iHep migratie naar de lever van de milt vergemakkelijkt. Bubbels zijn een letale factor voor chirurgie en volledig moeten worden vermeden in de spuit.
3) juiste aantal werk cellen. Overbelasting van de cellen kan ook leiden tot hoge letaliteit tarief. Het is raadzaam enten 1 – 1,5 miljoen iHeps per 25-30 g muis.
Ons protocol heeft ook enkele beperkingen: de lever schade geïnduceerd door bestraling van is matig en eenmalige toediening, en de staat van de rijping van onze iHeps is niet vergelijkbaar met pHH. Gerelateerd aan beide overwegingen, is de mate van chimerism van ons model vergelijkbaar met recente rapporten beschrijven knik/Lt-SCID/IL-2Rγ−/− muizen of Gunn ratten geaccepteerd met iPSC afkomstige iHeps17,19 , maar aanzienlijk lager is dan de BRD muizen of uPA transgene muizen met pHH geaccepteerd. Om te overwinnen van dit voorbehoud, aan de ene kant kan een verder optimaliseren van het hepatische differentiatie protocol ter verbetering van de rijping van iHeps. Aan de andere kant kon LRG muizen worden gekruist met FRG muizen voor het genereren van Ldlr- / -/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - muizen.
Kortom, hebben hier we een gedetailleerd protocol voor het genereren van menselijke lever chimeer dieren met FH iHeps, en voor het testen van de functionaliteit van het werk iHeps beschreven. Nog belangrijker is, kunnen deze chimeer muizen worden gebruikt voor in vivo drug testen. Ons model kan waarschijnlijk worden geoptimaliseerd door verbetering van de functionaliteit van iHeps of het uitsparen van extra genen (bv., Fah) in de ontvanger LRG muizen, en het zal nuttig zijn te onderzoeken van pathologische mechanismen van de ziekte en het uitvoeren van preklinische studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
H.-F.T. is de nationale coördinator en onderzoeker van de studie van de resultaten van de ODYSSEY gesponsord door Sanofi en Regeneron Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het Shenzhen wetenschap en technologie Raad Basic Research Program (JCYJ20150331142757383), strategische prioriteit Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen (XDA16030502), Hong Kong onderzoek subsidie Raad thema gebaseerd onderzoek Regeling (T12-705/11), samenwerking programma van de Onderzoeksraad van de subsidies van de speciale administratieve regio van Hongkong en de nationale natuurlijke Science Foundation van China (N-HKU730/12 en 81261160506), Team onderzoeksproject van Guangdong natuurwetenschappen Stichting (2014A030312001), Guangzhou Science en technologie programma (201607010086), en de provincie Guangdong Science and Technology Program (2016B030229007 en 2017B050506007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
