Un modèle de souris chimériques du foie humain de l’hypercholestérolémie utilisant des hépatocytes de dérivés de cellules souches pluripotentes induites
Summary
Nous présentons ici un protocole visant à créer un modèle de souris chimériques du foie humain de l’hypercholestérolémie familiale à l’aide des hépatocytes de dérivés de cellules souches humaines pluripotentes induites. Il s’agit d’un modèle précieux pour tester de nouvelles thérapies pour l’hypercholestérolémie.
Abstract
Hypercholestérolémie familiale (FH) est principalement causé par des mutations du récepteur (LDLR) lipoprotéine de basse densité et entraîne un risque accru de maladie cardiovasculaire précoce en raison d’une élévation marquée du cholestérol LDL (LDL-C) dans le sang. Statins sont la première ligne de médicaments hypolipidémiants pour traiter les FH et autres types d’hypercholestérolémie, mais de nouvelles approches font leur apparition, en particulier PCSK9 anticorps, qui sont actuellement testés dans des essais cliniques. Afin d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour FH, soit de nouveaux médicaments ou de nouvelles formulations, nous avons besoin approprié en vivo modèles. Toutefois, les différences dans les profils métaboliques de lipides par rapport à l’homme sont un problème clé des modèles animaux disponibles de FH. Pour résoudre ce problème, nous avons généré un modèle de souris chimériques du foie humain à l’aide de FH induite par les cellules souches pluripotentes (CISP)-dérivé des hépatocytes (iHeps). Nous avons utilisé des souris/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (GRL) pour éviter le rejet immunitaire des cellules humaines transplantées et d’évaluer l’effet du gène LDLR-iHeps déficientes dans un gène LDLR null fond. Transplanté FH iHeps pourrait repeupler 5 à 10 % de la foie de souris LRG basé sur la coloration de l’albumine humaine. En outre, l’iHeps implantée a répondu aux médicaments hypolipidémiants et récapitulées observations cliniques d’efficacité accrue de PCSK9 anticorps comparée aux statines. Notre modèle chimérique du foie humain pourrait donc être utile pour les tests précliniques de nouvelles thérapies à FH. En utilisant le même protocole, semblables humains souris chimériques du foie pour d’autres variantes génétiques FH, ou correspondant aux autres maladies du foie héréditaires, des mutations peut-être également être généré.
Introduction
Récepteur de lipoprotéines de basse densité (LDLR) capte le cholestérol LDL (LDL-C) dans le sang pour moduler la synthèse du cholestérol dans le foie. Des mutations dans le gène LDLR sont la cause la plus fréquente de l’hypercholestérolémie familiale (FH)1. Statins sont traditionnellement la première ligne de médicaments pour traiter les FH et autres types d’hypercholestérolémie (hérité ou acquis). Statines inhibent la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme A réductase pour diminuer la synthèse du cholestérol dans le foie2. En outre, statines augmentent les niveaux de LDLR sur la surface des hépatocytes pour promouvoir plasma clairance du LDL-C. Toutefois, un bémol majeur du traitement par statines est qu’ils induisent simultanément l’expression de la proprotéine convertase subtilisine/hexin 9 (PCSK9), une enzyme qui se lie à LDLR pour promouvoir sa dégradation3. Cet effet est responsable des interventions insuffisantes ou même nulle aux statines observées chez de nombreux patients. Étudier ce mécanisme a, contre toute attente, conduit à la découverte d’une autre façon de traiter l’hypercholestérolémie. Les anticorps de PCSK9 récemment approuvés par la FDA sont actuellement utilisés dans les essais cliniques et montrent une efficacité plus élevée et meilleure tolérance que les statines4. Le succès de PCSK9 anticorps implique aussi qu’il peut y avoir d’autres possibilités thérapeutiques pour moduler la voie de dégradation LDLR (en dehors de PCSK9) chez les patients atteints d’hypercholestérolémie. De même, il y a intérêt à développer de nouveaux inhibiteurs de PCSK9 autres que des anticorps, par exemple, siARN oligos5.
Pour tester les nouvelles thérapies de FH et en général tout autre type d’hypercholestérolémie, approprié en vivo modèles sont nécessaires. Un problème majeur de l’actuelle en vivo modèles, pour la plupart des souris6 et7, les lapins sont leurs différences physiologiques chez l’homme. Fondamentalement, ces problèmes sont notamment un profil métabolique de différents lipides. La génération des animaux chimériques du foie humain8 pourrait aider à surmonter cette mise en garde. La souris chimérique du foie humaine est un type de « humanisé » souris avec son foie repeuplée avec des hépatocytes humains, par exemple, des hépatocytes humains primaires (pHH)9. Un problème avec pHH, c’est qu’ils ne peuvent pas être expansion ex vivo, rapidement perdre leur fonction à l’isolement, et sont une source limitée. Une alternative à pHH est l’utilisation des cellules souches pluripotentes induites (CISP)-dérivé des hépatocytes (iHeps)10. Notamment, CISP est spécifiques à un patient et peut être cultivés indéfiniment, aussi iHeps peut-elle être produite sur demande, qui est un avantage important sur pHH fraîche. En outre, CISP peut également être facilement modifié génétiquement avec des nucléases concepteur de corriger ou d’introduire des mutations dans un contexte isogénique pour permettre le plus fidèle des comparaisons11.
Homme souris chimérique du foie avec pHH implantée présentent des similitudes avec les humains en profils métaboliques du foie, réponses de drogue et la susceptibilité à l’hépatite virus infection12. Cela fait d’eux un bon modèle pour étudier hyperlipidémie in vivo. Les modèles de souris plus largement utilisé sont inspirent de la/Fah– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (RFA) souris13 et l’uPA souris transgéniques8, dans lequel jusqu’à 95 % de la souris le foie peut être remplacé par pHH. Fait intéressant, un récent rapport décrit une humain FH foie chimérique souris (basée sur la souris de la RFA) avec pHH provenant d’un patient portant un homozygote de mutation de gène LDLR 14. Dans ce modèle, les hépatocytes humains regarnis n’eu aucun LDLR fonctionnelle, mais les hépatocytes de souris résiduelle faisaient, réduisant ainsi l’utilitaire permettant d’effectuer en vivo analyse de drogues en s’appuyant sur le parcours du LDLR.
Nous rapportons ici un protocole détaillé basé sur notre ouvrage récemment publié15 de faire une exception FH iHeps dans le foie de souris/Ldlr– / –/Rag2/ –/Il2rg– / – (GRL). Cette souris chimérique du foie humaine est utile pour la modélisation de FH et effectuer le dépistage des drogues in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des études antérieures à l’aide d’iHeps chez les rongeurs ont confirmé qu’ils sont un moyen efficace pour étudier les maladies du foie héréditaires17. Afin d’étendre l’utilisation de cette technologie et parce que les modèles animaux actuels FH sont pas optimaux, nous greffée FH iHeps dans des souris LRG et a montré que l’implantée LDLR +/-ou hétérozygotes LDLR-muté FH iHeps peut réduire la concentration plasmatique LDL-C de souris et répondre aux hyp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Science de Shenzhen et de la technologie Conseil base Research Programme (JCYJ20150331142757383), programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des Sciences (XDA16030502), Hong Kong Research Grant Conseil thème recherche Régime (T12-705/11), programme de coopération du Soviet de subventions de recherche de la région Administrative spéciale de Hong Kong et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (N-HKU730/12 et 81261160506), l’équipe projet de recherche des sciences naturelles de Guangdong Foundation (2014A030312001), Guangzhou Science et Technology Program (201607010086) et la Province de Guangdong programme Science et technologie (2016B030229007 et 2017B050506007).
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
