Summary

Un modèle de souris chimériques du foie humain de l’hypercholestérolémie utilisant des hépatocytes de dérivés de cellules souches pluripotentes induites

Published: September 15, 2018
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Summary

Nous présentons ici un protocole visant à créer un modèle de souris chimériques du foie humain de l’hypercholestérolémie familiale à l’aide des hépatocytes de dérivés de cellules souches humaines pluripotentes induites. Il s’agit d’un modèle précieux pour tester de nouvelles thérapies pour l’hypercholestérolémie.

Abstract

Hypercholestérolémie familiale (FH) est principalement causé par des mutations du récepteur (LDLR) lipoprotéine de basse densité et entraîne un risque accru de maladie cardiovasculaire précoce en raison d’une élévation marquée du cholestérol LDL (LDL-C) dans le sang. Statins sont la première ligne de médicaments hypolipidémiants pour traiter les FH et autres types d’hypercholestérolémie, mais de nouvelles approches font leur apparition, en particulier PCSK9 anticorps, qui sont actuellement testés dans des essais cliniques. Afin d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour FH, soit de nouveaux médicaments ou de nouvelles formulations, nous avons besoin approprié en vivo modèles. Toutefois, les différences dans les profils métaboliques de lipides par rapport à l’homme sont un problème clé des modèles animaux disponibles de FH. Pour résoudre ce problème, nous avons généré un modèle de souris chimériques du foie humain à l’aide de FH induite par les cellules souches pluripotentes (CISP)-dérivé des hépatocytes (iHeps). Nous avons utilisé des souris/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (GRL) pour éviter le rejet immunitaire des cellules humaines transplantées et d’évaluer l’effet du gène LDLR-iHeps déficientes dans un gène LDLR null fond. Transplanté FH iHeps pourrait repeupler 5 à 10 % de la foie de souris LRG basé sur la coloration de l’albumine humaine. En outre, l’iHeps implantée a répondu aux médicaments hypolipidémiants et récapitulées observations cliniques d’efficacité accrue de PCSK9 anticorps comparée aux statines. Notre modèle chimérique du foie humain pourrait donc être utile pour les tests précliniques de nouvelles thérapies à FH. En utilisant le même protocole, semblables humains souris chimériques du foie pour d’autres variantes génétiques FH, ou correspondant aux autres maladies du foie héréditaires, des mutations peut-être également être généré.

Introduction

Récepteur de lipoprotéines de basse densité (LDLR) capte le cholestérol LDL (LDL-C) dans le sang pour moduler la synthèse du cholestérol dans le foie. Des mutations dans le gène LDLR sont la cause la plus fréquente de l’hypercholestérolémie familiale (FH)1. Statins sont traditionnellement la première ligne de médicaments pour traiter les FH et autres types d’hypercholestérolémie (hérité ou acquis). Statines inhibent la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme A réductase pour diminuer la synthèse du cholestérol dans le foie2. En outre, statines augmentent les niveaux de LDLR sur la surface des hépatocytes pour promouvoir plasma clairance du LDL-C. Toutefois, un bémol majeur du traitement par statines est qu’ils induisent simultanément l’expression de la proprotéine convertase subtilisine/hexin 9 (PCSK9), une enzyme qui se lie à LDLR pour promouvoir sa dégradation3. Cet effet est responsable des interventions insuffisantes ou même nulle aux statines observées chez de nombreux patients. Étudier ce mécanisme a, contre toute attente, conduit à la découverte d’une autre façon de traiter l’hypercholestérolémie. Les anticorps de PCSK9 récemment approuvés par la FDA sont actuellement utilisés dans les essais cliniques et montrent une efficacité plus élevée et meilleure tolérance que les statines4. Le succès de PCSK9 anticorps implique aussi qu’il peut y avoir d’autres possibilités thérapeutiques pour moduler la voie de dégradation LDLR (en dehors de PCSK9) chez les patients atteints d’hypercholestérolémie. De même, il y a intérêt à développer de nouveaux inhibiteurs de PCSK9 autres que des anticorps, par exemple, siARN oligos5.

Pour tester les nouvelles thérapies de FH et en général tout autre type d’hypercholestérolémie, approprié en vivo modèles sont nécessaires. Un problème majeur de l’actuelle en vivo modèles, pour la plupart des souris6 et7, les lapins sont leurs différences physiologiques chez l’homme. Fondamentalement, ces problèmes sont notamment un profil métabolique de différents lipides. La génération des animaux chimériques du foie humain8 pourrait aider à surmonter cette mise en garde. La souris chimérique du foie humaine est un type de « humanisé » souris avec son foie repeuplée avec des hépatocytes humains, par exemple, des hépatocytes humains primaires (pHH)9. Un problème avec pHH, c’est qu’ils ne peuvent pas être expansion ex vivo, rapidement perdre leur fonction à l’isolement, et sont une source limitée. Une alternative à pHH est l’utilisation des cellules souches pluripotentes induites (CISP)-dérivé des hépatocytes (iHeps)10. Notamment, CISP est spécifiques à un patient et peut être cultivés indéfiniment, aussi iHeps peut-elle être produite sur demande, qui est un avantage important sur pHH fraîche. En outre, CISP peut également être facilement modifié génétiquement avec des nucléases concepteur de corriger ou d’introduire des mutations dans un contexte isogénique pour permettre le plus fidèle des comparaisons11.

Homme souris chimérique du foie avec pHH implantée présentent des similitudes avec les humains en profils métaboliques du foie, réponses de drogue et la susceptibilité à l’hépatite virus infection12. Cela fait d’eux un bon modèle pour étudier hyperlipidémie in vivo. Les modèles de souris plus largement utilisé sont inspirent de la/Fah– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (RFA) souris13 et l’uPA souris transgéniques8, dans lequel jusqu’à 95 % de la souris le foie peut être remplacé par pHH. Fait intéressant, un récent rapport décrit une humain FH foie chimérique souris (basée sur la souris de la RFA) avec pHH provenant d’un patient portant un homozygote de mutation de gène LDLR 14. Dans ce modèle, les hépatocytes humains regarnis n’eu aucun LDLR fonctionnelle, mais les hépatocytes de souris résiduelle faisaient, réduisant ainsi l’utilitaire permettant d’effectuer en vivo analyse de drogues en s’appuyant sur le parcours du LDLR.

Nous rapportons ici un protocole détaillé basé sur notre ouvrage récemment publié15 de faire une exception FH iHeps dans le foie de souris/Ldlr– / –/Rag2/ –/Il2rg– / – (GRL). Cette souris chimérique du foie humaine est utile pour la modélisation de FH et effectuer le dépistage des drogues in vivo.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici qui impliquent l’utilisation d’animaux ont été approuvés par le Comité sur l’utilisation des animaux vivants dans l’enseignement et de recherche (CULATR) de l’Université de Hong Kong. 1. préparation et analyse phénotypique de souris Génération d’un déficit immunitaire Ldlr chez des souris knockout (KO). Utilisez la souris souches Ldlr- / -, Rag2- / -et…

Representative Results

Dirigée CISP la différenciation de l’homme en iHepsLorsque vous atteignez 70 % confluence, CISP humaine est différenciées en iHeps avec un protocole de 3 étapes16 (du haut dela Figure 1 ). Après 3 jours de différenciation de l’endoderme, iPSC colonies devient desserrés et répartis à confluence complet (panneau inférieur dela Figure 1 ). Puis, avec 2 milieu de scène de<s…

Discussion

Des études antérieures à l’aide d’iHeps chez les rongeurs ont confirmé qu’ils sont un moyen efficace pour étudier les maladies du foie héréditaires17. Afin d’étendre l’utilisation de cette technologie et parce que les modèles animaux actuels FH sont pas optimaux, nous greffée FH iHeps dans des souris LRG et a montré que l’implantée LDLR +/-ou hétérozygotes LDLR-muté FH iHeps peut réduire la concentration plasmatique LDL-C de souris et répondre aux hyp…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Science de Shenzhen et de la technologie Conseil base Research Programme (JCYJ20150331142757383), programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des Sciences (XDA16030502), Hong Kong Research Grant Conseil thème recherche Régime (T12-705/11), programme de coopération du Soviet de subventions de recherche de la région Administrative spéciale de Hong Kong et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (N-HKU730/12 et 81261160506), l’équipe projet de recherche des sciences naturelles de Guangdong Foundation (2014A030312001), Guangzhou Science et Technology Program (201607010086) et la Province de Guangdong programme Science et technologie (2016B030229007 et 2017B050506007).

Materials

Materials
40 µm Cell strainer BD B4-VW-352340
6-Well plate Thermofisher 140675 Extracellular matrix coated
Accutase Millipore SCR005
Acetylcholine Sigma Aldrich A6625 Dissolve in water
Antigen retrieval solution IHC World IW-1100-1L
Calcium chloride Sigma Aldrich C8106 CaCl2
Cell dissociation enzyme Thermofisher 12604-013 TrypLE
D-glucose Sigma Aldrich D8270
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D5879 DMSO
DMEM Thermofisher 10829 Knockout DMEM
DNase I Roche 11284932001
EDTA USB 15694 0.5 M, PH=8.0
Extracellular matrix (for cell suspension) Corning 354234 Matrigel
Extracellular matrix (for iHep differentiation) Corning 354230 Matrigel
Hepatocyte basal medium Lonza CC-3199
Hepatocyte culture medium Lonza CC-3198
High-fat and high-cholesterol diet Research Diet D12079B
Human Activin A Peprotech 120-14E
Human hepatocyte growth factor Peprotech 100-39
Human iPSC maintenance medium STEMCELL Technologies 5850 mTeSR1
Human oncostatin M Peprotech 300-10
Ketamine 10% Alfasan N/A
L-glutamine Thermofisher 35050
LDL-C detection kit WAKO 993-00404 and 993-00504
Magnesium chloride VWR P25108 MgCl2
Meloxicam Boehringer Ingelheim NADA 141-213
Monopotassium phosphate USB S20227 KH2PO4
Non-essential amino acids Thermofisher 11140
PBS GE SH30256.02 Calcium and magnesium-free
PCSK9 antibodies Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals SAR236553/REGN727 Alirocumab
Phenobarbital Alfamedic company 013003
Phenylephrine RBI P-133 Dissolve in water
Potassium chloride Sigma Aldrich P9333 KCl
Povidone-iodine Mundipharma Betadine
Recombinant mouse Wnt3a R&D Systems 1324-WN-500/CF
ROCK inhibitor Y27632 Sigma Aldrich Y0503-5MG
RPMI 1640 Thermofisher 21875
Serum replacement Thermofisher 10828
Silicone coated petri dish Dow Corning Sylgard 184 silicone elastomer kit
Simvastatin Merck Sharp & Dohme ZOCOR
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6297 NaHCO3
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653 NaCl
Trypan blue solution 0.4% Thermofisher 15250061
U-46619 Cayman 16450 Dissolve in DMSO
Xylazine 2% Alfasan N/A
β-mercaptoethanol Thermofisher 31350
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
AAT DAKO A0012 1:400
ALB Bethyl Laboratories A80-129 1:200
ASGPR Santa Cruz Sc-28977 1:100
HNF4A Santa Cruz Sc-6557 1:35
NANOG Stemgent 09-0020 1:200
OCT4 Stemgent 09-0023 1:200
Name Company Catalog Number Comments
Mice
Il2rg-/- Jacson lab 003174
Ldlr-/- Jacson lab 002077
Rag2-/- Jacson lab 008449
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Automated cell counter Invitrogen Countess
Gamma irradiator MDS Nordion Gammacell 3000 Elan II
Insulin syringe BD 324911
Powerlab ADInstruments Model 8/30
Slides scanning system Leica biosystems Aperio scanScope system
Sliding Microtome Leica biosystems RM2125RT
Stereomicrocope Nikon SMZ800
Tissue processing system Leica biosystems ASP200S
Wire myograph DMT 610M
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Digital slide viewing software Leica Aperio ImageScope Version 12.3.2
Image J NIH Version 1.51e
Image processing software Adobe Photoshop CC Version 2015
Microscope imaging software Carl Zeiss AxioVision LE Version 4.7

References

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Yang, J., Wong, L., Tian, X., Wei, R., Lai, W., Au, K., Luo, Z., Ward, C., Ho, W., Ibañez, D. P., Liu, H., Bao, X., Qin, B., Huang, Y., Esteban, M. A., Tse, H. A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes. J. Vis. Exp. (139), e57556, doi:10.3791/57556 (2018).

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