Summary
نقدم هنا، على بروتوكول استخدام حقن نيوروبلاستوما (ملحوظة) والخلايا ساركومه (ES) يوينغ الموجهة بالموجات فوق الصوتية (إنشاء خطوط الخلايا والخلايا السرطانية المستمدة من المريض) في المواقع ذات الصلة بيولوجيا لإنشاء نماذج موثوقة السريرية للسرطان البحث.
Abstract
التجارب الإكلينيكية لعلاجات السرطان يعتمد على نماذج xenograft ذات الصلة التي تحاكي ميول فطرية للسرطان. وتشمل مزايا النماذج القياسية الجناح تحت الجلد سهولة إجرائية، والقدرة على رصد تطور الورم والاستجابة دون تصوير الغازية. هذه النماذج غالباً ما تكون غير متناسقة في التجارب السريرية متعدية الجنسيات ومحدودة من الخصائص ذات الصلة بيولوجيا مع نزوع منخفضة لإنتاج ورم خبيث، كما أن هناك نقص المكروية الأصلي. وبالمقارنة، أظهرت نماذج إكسينوجرافت أورثوتوبيك في مواقع الورم الأصلي إلى تقليد وورم المكروية وتكرار خصائص الأمراض الهامة مثل انتشار المنتشر بعيد المنال. غالباً ما تتطلب هذه النماذج مملة العمليات الجراحية مع فترات طويلة من الزمن والإنعاش مخدر. ولمعالجة ذلك، استخدمت الباحثين السرطان مؤخرا تقنيات الحقن الموجهة بالموجات فوق الصوتية سرطان إكسينوجرافت وضع نماذج للتجارب الإكلينيكية، والتي تسمح بإنشاء نماذج مورين الموجه من الأنسجة سريعة وموثوق بها. التصوير بالموجات فوق الصوتية كما يوفر أسلوب موسع لتقييم طولية للورم انجرافتمينت والنمو. هنا، نحن تصف طريقة الحقن الموجهة بالموجات فوق الصوتية للخلايا السرطانية، استخدام الغدة الكظرية ملحوظة وكبسولة شبه الكلي لوفاق. هذا النهج كسبها يتغلب على الجراحة المفتوحة مملة زرع الخلايا السرطانية في المواقع الخاصة بالانسجة للنمو وورم خبيث، ويوقف فترات الانتعاش المهووسين. يصف لنا الاستفادة من خطوط الخلايا المحددة وخطوط الخلايا المشتقة المرضى لحقن أورثوتوبيك. تتوفر مجموعات تجارية مسبقة الصنع للانفصال من ورم ووضع علامات لوسيفراس من الخلايا. حقن تعليق خلية باستخدام الصورة-التوجيه يوفر منبرا الحد الأدنى الغازية واستنساخه لإنشاء نماذج الإكلينيكية. ويستخدم هذا الأسلوب لإنشاء نماذج موثوقة السريرية لسرطانات أخرى مثل المثانة والكبد والبنكرياس تجسد إمكانات لم تستغل بعد للعديد من النماذج السرطان.
Introduction
نماذج xenograft الحيوانية أدوات أساسية للدراسات الإكلينيكية لرواية علاجات السرطان. تكثيفها موريني القياسية تعتمد على غرس الجناح تحت الجلد من الخلايا، وتزويد موقع كفاءة ويمكن الوصول إليها بسهولة لرصد نمو الورم. العيب نماذج تحت الجلد هو افتقارها إلى الخصائص البيولوجية الخاصة بالأورام، التي قد تحد من إمكاناتها السرطاني1. يتم التغلب على هذه القيود باستخدام أورثوتوبيك تكثيفها في أي ورم الخلايا هي انجرافتيد في مواقع النسيج الأصلي، وتزويد المكروية ذات صلة المحتملة النقيلي2. نماذج إكسينوجرافت أورثوتوبيك الحفاظ على السمات البيولوجية الأصلية، وتوفير نماذج موثوقة لاكتشاف العقاقير السريري3،4. الخلايا السرطانية تستخدم لزرع الأنسجة الموجهة هي خطوط الخلايا المحددة أو خلايا المريض-مشتقة من أورام المرضى. قد يحمل تكثيفها المنشأة من خطوط خلايا السرطان عالية التباين الوراثية من الورم الرئيسي مقارنة بتكثيفها المشتقة المريض5. ونظرا لهذا، أصبح إنشاء تكثيفها أورثوتوبيك المستمدة من المريض المعيار المفضل لاختبار علاجات جديدة في اكتشاف الأدوية السرطان.
في نيوروبلاستوما السرطان طب الأطفال (ملحوظة)، نماذج إكسينوجرافت أورثوتوبيك الخص البيولوجيا الورم الرئيسي، وتطوير ورم خبيث لمواقع نموذجية لملاحظة: نشر6،7. ملحوظة: يطور في الغدة الكظرية أو على طول سلسلة متعاطفة مع مجاورة. الأساليب الأكثر شيوعاً لزرع أورثوتوبيك تتطلب فتح البطن عبر العمليات الجراحية. هذه الأساليب غالباً ما تكون شاقة، والأمراض الحيوانية عالية، وفترات الانتعاش المعقدة. وقد استخدمت الاستبانة بالموجات فوق الصوتية مؤخرا لزرع الأنسجة الموجهة للخلايا السرطانية في تطوير عدة نماذج مورين لبحوث السرطان8،9. هذا الأسلوب موثوق بها، واستنساخه، فعالة وآمنة لإقامة الصلة الورم المنتشر تكثيفها10،11.
إنشاء تكثيفها طب السرطان بهدف الاسترشاد بالموجات فوق الصوتية الجهاز التعريب وابرة زرع خطوط الخلايا والخلايا السرطانية المستمدة من المريض هو أظهر11. واستخدمت التقنية لملاحظة موجهة إلى الغدة الكظرية مورين. ساركومه يوينغ في (ES) في الغالب سرطان العظمى، ينظر عادة في العظام الطويلة مثل عظمة الفخذ وعظام الحوض12. وقد أظهرت تقارير حالة أن تحديد ما إذا كان نمو السرطان العظمى الغالب عمليا في الأنسجة الكلوية، اختير موقع الحافظة شبه الكلي ل غرس أورثوتوبيك13. وقد استخدمت sub الكلوي الخلية الحافظة زرع الخلايا السرطانية كنموذج واعدة لدراسة الانبثاث العفوية لوفاق14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم ذلك وفقا "جامعة ميتشجان" مجلس المراجعة المؤسسية (هوم 00052430) جميع الأعمال ويتفق مع الإجراءات التي أقرتها "اللجنة الجامعة" في استخدام ورعاية الحيوانات (أوكوكا). الوحدة للمختبر في الحيوان الطب (اولام) أشرفت على رعاية الحيوان.
كل عمل تم بموافقة من "جامعة ميتشجان" مجلس المراجعة المؤسسية (هوم 00052430) ويتفق مع جميع اللوائح لجنة أخلاقيات البحوث البشرية. وتعتبر الخلايا البشرية تكون مادة يحتمل أن تكون اوتوكلاف، حتى اتباع جميع الاحتياطات الخاصة وممارسات السلامة الحيوية الملائمة التي تتطلبها المؤسسة الخاصة بك. مجموعة موردي المواد النووية الفئران المناعة بشدة وعرضه للأمراض التي تسببها البكتريا التي توجد عادة في البيئة.
دائماً استخدم أسلوب تعقيم صارمة عند إعداد المواد اللازمة لغرس والقيام بالحقن.
1-خلية ثقافة
- تنمو المنشأة البشرية NB خطوط الخلايا (ش-SY5Y وكورونا-N-BE2 IMR32) في المتوسط الأساسية الدنيا، وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين الجلوتامين 2 مم، 100 وحدة/مل البنسلين و 100 ميكروغرام/مل والستربتوميسين. الملحق IMR32 خلايا أخرى مع 1 مم بيروفات و 0.075% ناكو3. الحفاظ على كافة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 التقاء 70-80%.
- تنمو البشرية ES خطوط الخلايا (TC32، A673، تشلا-25 و A4573) في المتوسطة ربمي تكملة مع 10% مصل بقرى الجنين و 6 مم L-الجلوتامين. الحفاظ على كافة الخلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO2 في التقاء 70-80%.
- إرسال جميع خطوط الخلايا للمصادقة.
ملاحظة: يتم مصادقة الخلية في منشأة خارج، يرجى الرجوع إلى الاعترافات.
2-إعداد الخلايا السرطانية الأولية المستمدة من المريض
- مع موافقة المريض والموافقة عليه، تجاهل الحصاد NB ورم الأنسجة البشرية من المرضى الذين يخضعون للاستئصال الجراحي للسيطرة المحلية والنقل إلى المختبر في حل تخزين الأنسجة للحفاظ على.
ملاحظة: إلغاء تحديد جميع عينات المرضى والتعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية "مجلس المراجعة المؤسسية". - إنشاء تعليق خلية سرطان المستمدة من مريض واحد (UMNBL001, UMNBL002) من ورم الأنسجة باستخدام مجموعة تفارق ورم. نقل حوالي 0.5 غرام ورم إلى 100 مم طبق ثقافة خلية التي تحتوي على 5 مل من المخزن المؤقت ربمي، ميليلتر 200 إنزيم ح، 100 ميليلتر من إنزيم R و 25 ميليلتر إنزيم A من الطقم الانفصال من الأورام البشرية.
- فرم الورم إلى قطع صغيرة (2-4 مم كل) باستخدام مقص وملقط الأنسجة. مزيج من هذه الشظايا مع الحلول في الخطوة 2، 2.
- "الماصة؛" الخليط ورم في أنبوب ديسوسياتور وإغلاق الأنبوب. عكس الأنبوب ونعلق على الكم ديسوسياتور الأنسجة. تشغيل برنامج h_tumor_01.
- احتضان تعليق خلية الورم الحصول عليها أعلاه في 37 درجة مئوية ح 1 على رف الدورية مع تريتوريشن متقطعة كل 15 دقيقة.
- نقل تعليق خلية في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد وإضافة 10 مل ربمي. الطرد المركزي بتعليق خلية في 314 س ز لمدة 5 دقائق.
- إزالة المادة طافية وتعليق بيليه في 5 مل ربمي. تمرير هذا الحل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر وجمع الحل المتوترة في أنبوب مخروطي طازجة 50 مل. تغسل هذه المصفاة مرة واحدة مع 5 مل الإعلام ربمي والطرد المركزي المخلوط في 314 س ز لمدة 5 دقائق لجمع بيليه.
- قياس كثافة الخلية باستخدام هيماسيتوميتير15. تعليق بيليه التي تم الحصول عليها من أعلى في ربمي للحصول على تركيز نهائي من5 × 10 4 خلايا/10 ميليلتر. تأخذ 5 ميليلتر من هذا التعليق الخلية و 5 ميليلتر من ماتريجيل لجعل 10 ميليلتر من حل خلية لكل حقن.
ملاحظة: يتوقف مبلغ ربمي المستخدمة في قياس كثافة الخلية. على سبيل المثال، إذا كانت الخلية قياس كثافة بيليه حصل على 4 × 105 خلايا، تعليق بيليه في 10 ميليلتر من ربمي.
3-لوسيفراس تمييز الخلايا السرطانية
- جعل 10 مل من توصيل الوسائط مع 5 مل من الفيروسية طافية EF1a-Luc2-آيريس--مشري و 5 مل من الخلايا الجذعية وسائط الإعلام. إضافة 7.5 ميليلتر من بوليبريني س 1.
- مزيج 5 × 106 خلايا السرطان في توصيل الوسائط ولوحة في لوحة 100 ملم مرفق منخفضة للغاية. احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 بين عشية وضحاها.
ملاحظة: تستخدم ألواح مرفق منخفضة، ستلتزم الخلايا لا للوحة. - بعد 24 ساعة، جلب لوحة 100 ملم تحتوي على خلايا تحت غطاء زراعة الأنسجة ونقل الخليط في أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي بتعليق خلية في 314 س ز لمدة 5 دقائق للحصول على خلية بيليه. أغسل بيليه الخلية مرة واحدة مع 1 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) وتعليق بيليه الخلية في 1 مل حبس يحتوي على 1% مصل بقرى الجنين (FBS).
- فرز الخلايا لوسيفراس استناداً إلى إشارة إيجابية بروتينات فلورية خضراء على الأسفار تنشيط الخلية الفرز التحليل (نظام مراقبة الأصول الميدانية). لوحة الخلايا تم فرزها في زراعة الأنسجة 100 ملم تعامل طبق والحفاظ على التقاء 70-80%، 37 درجة مئوية و 5% CO2 حتى المطلوبة.
- تأكد من إشارة لوسيفراس مع طقم الإنزيم لوسيفراس. وكذلك لوحة لوحة 10 × 104 فرز الخلايا كل بئر في إيلومينوميتير 96 متوافقة احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2. بعد 24 ساعة، جلب لوحة جيدا 96 إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة الكاشف ثابت-Glo وسائل الإعلام مثقف في الآبار بنسبة 1:1. السماح للخلايا لمدة 5 دقائق وقراءة التﻷلؤ في جهاز المطياف الضوئي.
- إحضار طبق 100 ملم تحت غطاء زراعة الأنسجة. تجاهل وسائل الإعلام طافية. تغسل الخلايا مرة واحدة مع 2 مل من س 1 برنامج تلفزيوني.
- إضافة 2 مل من 0.25% التربسين والعودة الطبق 100 مم إلى حاضنة لمدة 2-3 دقائق. بعد 2-3 دقائق، تحقق من الخلايا المزاحة تحت المجهر وإضافة 8 مل ربمي لإلغاء تنشيط التربسين.
- جمع تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 314 س ز لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه. تجاهل المادة طافية. أغسل بيليه الخلية مع 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني وتعليق بيليه في 5 مل ربمي وتحديد كثافة الخلية باستخدام هيماسيتوميتير15. الطرد المركزي yhe المتبقية حل الخلية في ز 314 x لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه.
- تعليق بيليه في ربمي للحصول على تركيز من 4 × 105 خلايا/10 ميليلتر. تأخذ 5 ميليلتر من تعليق خلية و 5 ميليلتر من ماتريجيل لجعل 10 ميليلتر من حل خلية لكل حقن.
4-الموجات فوق الصوتية تسترشد الغدة الكظرية (ملحوظة) أو غرس كبسولة (ES) Sub الكلوي
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الإجراءات بالموجات فوق الصوتية دقة عالية في فيفو نظام التصوير باستخدام. واستخدمت للإجراءات الموصوفة، محول، التي قد تردد مركز 40 ميغاهرتز، وعرض النطاق الترددي من 22-55 ميجا هرتز.
- الاستفادة من 6-8 أسبوع من العمر تعاني من نقص المناعة مجموعة موردي المواد النووية الفئران لجميع إجراءات الحقن.
- البرد ماتريجيل ويعقم هاملتون المحاقن مزودة بإبرة ز 27 (1.25 ")، وبين عشية وضحاها القسطرة ز 22 (القطر الخارجي 0.9 مم، الطول 25 مم) في 4 درجات مئوية.
- ضع الحل خلية إعدادها في الخطوة 3 على الجليد.
- تخدير الفئران في دائرة التعريفي لاستخدام إيسوفلوراني 2% في س2 في 2 لتر في الدقيقة.
ملاحظة: يتم تحديد التخدير الكافي مع عدم وجود حركة نشطة والحفاظ على التنفس العفوي. - بمجرد تخديره، تضطرين في الظهر والجناح من الحيوانات باستخدام محلول إزالة الشعر (مثل نير) وماكينة حلاقة.
- نقل الحيوانات إلى منصة التصوير مع الجانب البطن إلى أسفل، حيث وضعت في نوسيكوني آنف الحيوان وتأمينها أثناء استنشاق isoflurane.
- ضع مرهم الضوئية في عيون الحيوان لمنع التجفيف. الشريط الماوس في المكان لمنع أي حركة غير مقصودة.
- تحديد مورين الكبد والوريد الأجوف، والطحال، واستئصال كليته اليسرى، والمتاخمة الغدة الكظرية الأيسر باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية.
- استخدام قفازات معقمة والقناع وغطاء للحماية الشخصية، والحفاظ على ظروف معقمة. تحت توجيه الموجات فوق الصوتية، بلطف إدراج قسطرة ز 22 عن طريق الجلد والعضلات مباشرة في الغدة الكظرية اليمنى توفير قناة لحقن الخلايا. إزالة الإبرة وترك القسطرة في المكان.
- تحميل حقنه هاملتون مبردة مزودة بإبرة العيار الصغير مع 10 ميليلتر من حل الخلية، ثم توجيه المحاقن ستيريوتاكتيكالي عن طريق القسطرة المتمركزة داخل مركز الغدة الكظرية.
- حقن الخلايا في أنسجة الغدة الكظرية المستهدفة. اترك الإبرة في مكان لمدة 1-2 دقيقة للسماح ماتريجيل لتعيين. إزالة الإبرة، متبوعاً بإزالة القسطرة ببطء.
- ضع الفئران مرة أخرى إلى القفص بهم وضمان أن الماوس يستعيد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية.
ملاحظة: نظراً لطبيعة هذا الأسلوب كسبها، ألم وظيفة إجرائية الحد الأدنى، ولكن لا تزال ترصد على أساس يومي مع الضوابط الصحية الفئران. "ينبغي أن يتبع بجملة:" إذا كانت علامات غير متوقعة من الألم أو المعاناة حددت أثناء من تجربة، بالتشاور مع وحدة الدعم المؤسسي البيطرية الخاصة بك للحصول على معلومات بشأن التسكين أو الرعاية الطبية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام الإجراءات المقدمة، تم غرس الموجهة بالموجات فوق الصوتية للخلايا ملحوظة في الغدة الكظرية في إجراء مخصص غرفة مجهزة بطاولة العمليات جراحية ساخنة. تم وضع منصات الذراع والقدم لمراقبة نشاط القلب مورين (الشكل 1A). وظل الحيوان أنيسثيتيزيد تحت إيسوفلوراني باستخدام مخروط الآنف استنشاق. باستخدام مجس الموجات فوق الصوتية عالية الدقة، قد حددت الكلية اليسرى مع الغدة الكظرية الجمجمة فقط للكلى (الشكل 1B). ثم طرحت الإبرة في الغدة الكظرية تحت التصور مباشرة (الشكل 1). أثناء الاستخدام الأولى لهذا الأسلوب، استخدمت خليط من صبغة أزرق الميثيلين وماتريجيل للتأكد من الترجمة الصحيحة للغدة الكظرية. تمت التضحية بالحيوان، وأكد أن نجاح الإجراء في نيكروبسي تصور صبغة أزرق الميثيلين تحت الكبسولة الغدة الكظرية (الشكل 1).
وكانت أسبوعية بالموجات فوق الصوتية والتصوير بالإضاءة الحيوية الطرائق المستخدمة لرصد معدل انجرافتمينت ونمو الورم. وتم قياس التصوير بالإضاءة الحيوية للمنطقة لمصلحة كالفوتونات/s/سم2/steridian (خ ع/s/سم2) مع عدد أدنى من 106 إلى 108 تشير إلى حجم الورم كافية للتجارب السريرية9 ( الشكل 2). تحليل استخدام t-اختبار أظهرت زيادة ذات دلالة إحصائية في الإضاءة الحيوية لوحظ على مدى فترة مدتها ثمانية أسابيع (* ف< 0.05؛ * *ف< 0.001؛ * * *ف< 0.0001). التصوير بالموجات فوق الصوتية يسمح قياسات موسع لمنطقة الورم ووحدة التخزين. هذا إلى جانب قياس الإضاءة الحيوية رصد الورم انجرافتمينت والتقدم (الشكل 3). واستخدمت إجراءات مماثلة لخلايا ES حقن الكبسولة sub الكلوي (الشكل 4).
التحليل الإجمالي والنسيجي للأورام الناتجة تتميز بالأورام الأولية والانبثاث في نيكروبسي. دراسة لأنماط الخلية مورفولوجك عينات الأنسجة والملون لعلامات البروتين الخاصة بورم (الشكل 5، الشكل 6). انجرافتمينت الورم الرئيسي لخطوط الخلايا NB (IMR32، SH-سي-5Y، كورونا-N-BE2، UMNBL001، UMNBL002) تراوحت بين 62-100%، مع الانبثاث في 0-100 في المائة من حقن الفئران. وشوهدت الانبثاث أقوى في كورونا-N-BE2 (33 في المائة) و UMNBL002 (100%). وكانت مواقع المنتشر لملاحظة العقد الليمفاوية والكبد والرئة والعظام القشرية. انجرافتمينت الحافظة شبه الكلي لخطوط خلايا ES (A4573، A673، كحلة-25، TC-32) تراوحت بين 60 100 في المائة، مع الانبثاث في 0-40 في المائة من حقن الفئران. شملت مواقع المنتشر درست لوفاق الغدد الليمفاوية، الرئتين والعظام القشرية. وشوهدت engraftment أقوى (100%) والانبثاث (40 ٪) في الفئران إكسينوجرافت TC-32.
الشكل 1 . تعريب الغدة الكظرية مورين والموجهة بالموجات فوق الصوتية ملحوظة: خلية زرع. (A) التصوير بالموجات فوق الصوتية عالية الدقة من أجهزة البطن موريني يسمح بزرع خلايا ورم الغدة الكظرية. (ب) حددت الكلية اليسرى. (ج) الغدة الكظرية اليمنى يقع المتاخمة لاستئصال كليته اليسرى هيبوتشويك (الظلام) جولة الهيكل. وكان المتقدم الإبرة في الغدة الكظرية متبوعاً بحقن الخلايا. (د) خليط من ماتريجيل وصبغة أزرق الميثيلين استخدمت لتقييم مدى دقة إجراءات الحقن. الممثل السابقين فيفو الصورة الكلية اليسرى والغدة الكظرية مع صبغة ماتريجيل وأزرق الميثيلين في كبسولة الغدة الكظرية ومساحة المناطق المحيطة بالمدن-الكظرية. تم تعديل هذا الرقم مع إذن من فإن نورد، قانون الجمهورية وآخرون. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . في فيفو تصوير الإضاءة الحيوية من معدل انجرافتمينت ونمو الورم. (A) وتم رصد تكثيفها الغدة الكظرية NB البشرية انجرافتمينت ونمو الورم أكثر من ثمانية أسابيع. (ب) تم تحديد إشارة الإضاءة الحيوية القصوى داخل منطقة الفائدة. ملاحظة: خطوط الخلايا (ش-SY5Y، 32 معدل وفيات الرضع، وكورونا-N-BE2) والخلايا المستمدة من المريض (UMNBL001، UMNBL002) زادت أنماط التألق والنمو مع مرور الوقت. زيادة الإضاءة الحيوية على مدى فترة مدتها ثمانية أسابيع معتدا به إحصائيا (*p< 0.05؛ * *ف< 0.001؛ * * *ف< 0.0001). تم تعديل هذا الرقم مع إذن من فإن نورد، قانون الجمهورية وآخرون. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . في فيفو التصوير بالموجات فوق الصوتية لورم انجرافتمينت والنمو- التصوير بالموجات فوق الصوتية رصد في فيفو تطور الورم. وترد بالموجات فوق الصوتية والصور المقابلة الإضاءة الحيوية في واحد واثنين وثمانية أسابيع. في أسبوع واحد، كان تصور انجرافتمينت في كل طرائق التصوير. منطقة الورم وحجم حسبت باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية. 3D الموجات فوق الصوتية صور معكوسة قصت الأورام عند انتهاء الدراسة. تم تعديل هذا الرقم مع إذن من فإن نورد، قانون الجمهورية وآخرون. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . التعريب الكلي مورين وغرس دإط الخلايا الموجهة بالموجات فوق الصوتية- (A) واستخدمت الإضاءة الحيوية لرصد الورم التألق والنمو. (ب-ج) وضع الحيوانات أورام محلياً الغازية التي تشوه المحيطة بهياكل البطن وغزت في الهياكل المحلية مثل العضلات. تم تعديل هذا الرقم مع إذن من فإن نورد، قانون الجمهورية وآخرون. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . ورم الأنسجة الأورام xenograft NB و ES- (A) وكان الفئران إكسينوجرافت ملحوظة: الأورام الأولية محلياً إينفيلتراتيفي في مواقع الغدة الكظرية والغدة الكظرية المناطق المحيطة بالمدن، والتي تشوه البطن الأجهزة المجاورة. (ب) مجهريا (20 س، بار = 50 ميكرومتر)، أورام الغدة الكظرية إكسينوجرافت وأظهر ميزات مورفولوجك متسقة مع ملاحظة البشرية (مجموعات ضعيفة متباينة الزاوي جولة الخلايا)، بما في ذلك تشكيل روزيت العرضية الزائفة (السهم). (ج) ورم الأنسجة وأظهر قوية تيروزين hydroxylase (ملحوظة: الورم العلامة) إيمونوريكتيفيتي (40 X، بار = 40 ميكرومتر؛ مراقبة إيجابية تلطيخ المبين في اللوحة اليسرى؛ 1: 100). (د) ES إكسينوجرافت الورم قد الميزات النسجية متسقة مع ES إينفيلتراتيفي (40 X، بار = 40 ميكرومتر)، مجموعات من الزاوي جولة epithelioid الخلايا مفصولة غرامة الليفي ستروما الأوعية الدموية، يمحوا وضغط الكلي المتاخمة العادي (السهم؛ ومضغوطة مخلفات حمة الكلي). (ﻫ (ES ورم الأنسجة وأظهرت إيمونوريكتيفيتي غشاء قوي لعلامة الورم ES CD99 (40 X، بار = 40 ميكرومتر؛ مراقبة إيجابية تلطيخ المبين في اللوحة اليسرى؛ 1: 100). تم تعديل هذا الرقم مع إذن من فإن نورد، قانون الجمهورية وآخرون. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 . الانبثاث البعيدة نمواً في تكثيفها المنشأة بواسطة تقنية حقن الموجهة بالموجات فوق الصوتية- (أ) الإضاءة الحيوية التصوير تبين الورم NB الرئيسي في الفضاء الغدة الكظرية والمنتشر البؤر التي تم اكتشافها في العظام القشرية. (ب) أثبت التحليل المجهري ورم المنتشر (السهم) يمحوا وتجويف نخاع العظام القشرية لعظم الفخذ الدانية (4 X، بار = 400 ميكرون). (ج) تيروزين hydroxylase إيمونوريكتيفيتي هيولى الموقع المنتشر العظام القشرية NB (40 X، بار = 40 ميكرومتر). (د) الفحص المجهري المستمدة من المريض أورثوتوبيك إكسينوجرافت (UMNBL002) مع ورم خبيث كبدي (السهم) داخل الوريد كبدي (رأس السهم يوضح خلايا بطانية)، والتسلل إلى لحمه الكبد المجاور (L) (20 س، بار = 50 ميكرومتر). (ﻫ (نيوروبلاستوما خبيث الصغرى (سهم) في حمة الرئة (40 X، بار = 40 ميكرومتر). تم تعديل هذا الرقم مع إذن من فإن نورد، قانون الجمهورية وآخرون. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
زرع خلايا ملحوظة ووفاق الموجهة بالموجات فوق الصوتية وسيلة فعالة وآمنة لإثبات موثوقية تكثيفها مورين للدراسات الإكلينيكية في بيولوجيا السرطان. حاسمة بالنسبة لنجاح الموجهة بالموجات فوق الصوتية هو زرع الأنسجة المستهدفة بوجود وتوافر الموظفين المدربين ذوي الخبرة في تشريحيا إضفاء الطابع المحلي على جهاز الفائدة والمناظير باستخدام الأشعة حقن الخلايا السرطانية.
الانفصال من أنسجة الورم أثبتت أنها خطوة حاسمة في تطوير النموذج وصف xenograft المستمدة من المريض. ويشمل أنسجة الورم الأصلي المكروية الخلوية وستروما المحيطة التي قد تؤثر على امتصاص الورم أو انجرافتمينت. خلية العد، بعد عملية الانفصال الكامل، توفير مقياس للكثافة الخلوية في العينة، 2 × 105 خلايا/10 ميكروليتر تعتبر حصيلة خلية مثلى لغرس وورم ناجحة انجرافتمينت.
علامات لوسيفراس الخلايا المسموح بها للتحقق انجرافتمينت الورم ورصد نمو الورم بقياس الإشارات الإضاءة الحيوية، مع 10 من6 إلى 108 يجري النظر يدل على امتصاص الورم9. لضمان توصيل ناجحة، كان النشاط لوسيفراس المؤكدة في المختبر قبل حقن الخلايا. وقد تم ذلك الفلورة، معدات الفحص لوسيفراس، وأيضا عن طريق فحص الخلايا لإشارة الإضاءة الحيوية. وأبقى الإعدادات المستخدمة لقياس الإضاءة الحيوية المستمرة، تقديم بيانات متسقة خلال قياسات أسبوعية.
وأكد السابقين فيفو نسيجية تحليل الأورام نوع خلية ومورفولوجيا الأورام الناتجة مع تلوين المحددة لعلامات البروتين. وأكد تحليل نسيجية الورم انجرافتمينت وورم خبيث تظاهر بالموجات فوق الصوتية والتصوير بطرحه.
وتشمل المزايا لغرس الخلوية الموجهة بالموجات فوق الصوتية طبيعته غير الغازية والوقت الانتعاش الحيوان الحد الأدنى، والنجاح المتزايد في إنشاء العديد من النماذج الناجحة xenograft. التصوير بالموجات فوق الصوتية كما يوفر طريقة موثوقة لرصد في فيفو الورم الورم وتطور وحدات التخزين. في هذه النماذج السريرية، تقدمت الأورام إلى الأمراض الغازية محلياً مع ورم خبيث في غضون 5 أسابيع. وتشمل القيود توافر تكنولوجيا التصوير عالية الدقة والقدرة على استمرار تعريب الجهاز المستهدف. توافر الموظفين ذوي الخبرة في مجال التصوير بالموجات فوق الصوتية للجهاز للفائدة عناصر حاسمة لهذا الأسلوب.
توفير التصوير بالموجات فوق الصوتية عالية الدقة قد زاد زيادة كبيرة خلال العقد الماضي واستعماله وتواصل توسيع ليس فقط في الممارسة السريرية ولكن أيضا في مختبر البحوث. استخدام الموجات فوق الصوتية لتطوير تكثيفها مورين الحديثة تطبيق واعدة، مع إمكانات للنهوض بنماذج الأبحاث الإكلينيكية للسرطان اكتشاف العقاقير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا الكشف.
Acknowledgments
تلقي هذا العمل الدعم من روبرت الخشب جونسون مؤسسة/آموس كلية تطوير البرنامج، توبمان معهد الأبحاث الطبية، وقسم جراحة الأطفال، جامعة ميتشجان. الكتاب أود أن أشكر كيمبر كونفيرسو-باران والدكتور ماركوس جربو للمساعدة مع إجراءات الحقن بالموجات فوق الصوتية ومنصة التصوير. ونشكر ترومبليي بول لمساعدته مع رسومات الشكل. ونشكر أيضا قسم الأشعة في "جامعة ميتشجان" لاستخدام مركز للتصوير الجزيئي والورم التصوير الأساسية، التي تدعمها جزئيا "مركز السرطان الشامل المعاهد الوطنية للصحة"، منح P30 CA046592. جامعة "ميشيغان فسيولوجيا Phenotyping الأساسية" معتمدة جزئيا بتمويل من منحة من المعهد الوطني للصحة (OD016502) ومركز القلب والأوعية الدموية فرانكل. تم مصادقة خط الخلية في "مرافق البحوث راديل إيديكسكس"، كولومبيا، ميزوري ونحن نشكر ستول تامي والدكتور راجين مودي وبرنامج علم الأورام الأورام الصلبة موت. لدينا المرضى والأسر العرفان للإلهام، وشجاعتهم، والدعم المستمر لابحاثنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
- Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).
- Fidler, I. J., Hart, I. R. Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications. Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation. Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice. Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis. In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).
- Stewart, E., et al. Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft. Dev Biol. 407, 344-355 (2015).
- Jäger, W., et al. Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts. J. Vis. Exp. (84), e51123 (2014).
- Teitz, T., et al. Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment. PLoS ONE. 6 (4), e19133 (2011).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours. International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).
- Van Noord, R. A., et al. Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).
- Vormoor, B., et al. Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging. PLoS ONE. 9 (1), e85128 (2014).
- Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature. Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).
- Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor. Sarcoma. 2010, 174528 (2010).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
