Summary
Здесь мы представляем протокол использовать УЗИ руководствуясь инъекций нейробластома (NB) и саркомой Капоши (ES) клетки (создана линии клеток и клеток опухоли пациента производные) на биологически соответствующие сайты для создания надежных доклинических моделей для рака исследования.
Abstract
Преклинические испытания противоопухолевой терапии опирается на соответствующих ксенотрансплантата моделей, которые имитируют врожденной тенденции рака. Преимущества стандартного подкожной фланге моделей включают процедурные легкость и способность монитора опухолевой прогрессии и ответ без инвазивных изображений. Такие модели часто непоследовательны в трансляционной клинических испытаний и имеют ограниченную биологически соответствующие характеристики с низкой склонности производить метастазов, как отсутствие родной микроокружения. В сравнении ортотопическая ксенотрансплантата моделей на участках родной опухоли показали имитировать микроокружения опухоли и тиражирования важные болезни характеристики таких отдаленных метастатической распространения. Эти модели часто требуют утомительные хирургических процедур с обезболивающий длительное время и восстановления. Для решения этой проблемы рака исследователи использовали недавно УЗИ руководствуясь инъекций методы учредить рака ксенотрансплантата модели для доклинических экспериментов, которые обеспечивает быстрое и надежное создание ткани направленных мышиных моделях. Ультразвуковой визуализации также предоставляет неинвазивный метод для продольной оценки приживления опухоли и роста. Здесь мы описываем метод для УЗИ руководствуясь инъекций раковых клеток, используя надпочечников NB и капсула почек sub для ES. Это минимально инвазивной подход преодолевает имплантации утомительно открытой хирургии раковых клеток в ткани конкретного места для роста и метастазирования и стихает болезненного восстановления периоды. Мы описываем использования установленных клеточных линий и пациентом производных клеточных линий для инъекций ортотопическая. Готовые коммерческие наборы доступны для опухоли диссоциации и Люцифераза пометки клеток. Введения суспензии клеток, используя изображение руководство обеспечивает минимально инвазивных и воспроизводимые платформу для создания доклинических моделей. Этот метод используется для создания надежных доклинических моделей для других раковых заболеваний, таких как мочевого пузыря, печени и поджелудочной железы, иллюстрируя свой неиспользованный потенциал для многочисленных моделей рака.
Introduction
Животных ксенотрансплантата модели являются необходимыми инструментами для доклинических исследований Роман противоопухолевой терапии. Стандартный мышиных ксенотрасплантатов полагаются на подкожную фланге имплантация клеток, предоставление эффективных и легко доступных сайт для мониторинга роста опухоли. Недостаток подкожной моделей является отсутствие опухоль – специфичные биологических характеристик, которые могут ограничить их способность метастазировать1. Такие ограничения преодолеваются с помощью ортотопическая ксенотрасплантатов в котором опухоли клетки являются прижившимися в родной ткани сайтов, предоставляя соответствующие микроокружения метастатического потенциала2. Ортотопическая гранулы ксенотрансплантата модели сохранить оригинальный биологические особенности и обеспечивают надежные модели для доклинических наркотиков discovery3,4. Раковые клетки используются для ткани направленных имплантации являются установленными клеточных линий или пациент производные клетки из опухоли пациента. Ксенотрасплантатов от линий клеток рака могут демонстрировать высокие генетических отклонений от первичной опухоли, по сравнению с пациентом производных ксенотрасплантатов5. Учитывая это, создание ксенотрасплантатов пациента производные ортотопическая стал предпочтительным стандартом для тестирования Роман терапии рака лекарственных препаратов.
В педиатрического рака нейробластома (NB) ортотопическая ксенотрансплантата модели пилки первичной опухоли биологии и развивать метастазирования типичные сайты NB распространение6,7. NB развивается в надпочечников или вдоль паравертебральных симпатической цепочки. Наиболее распространенные методы имплантации ортотопическая требуют открытой транс брюшной хирургических процедур. Такие методы часто утомительным, имеют высокую заболеваемость животных и сложные восстановления периоды. Высоким разрешением УЗИ недавно использовались для ткани направленных имплантации опухолевых клеток в развитии нескольких мышиных моделей для исследования рака8,9. Методика является надежным, воспроизводимость, эффективной и безопасной для создания соответствующих метастатические опухоли ксенотрасплантатов10,11.
Показали11является создание педиатрического рака ксенотрасплантатов по УЗИ руководствуясь целевой орган локализации и иглы имплантации пациент производные опухолевых клеток и клеточных линий. Техника была использована для NB, ориентированные на мышиных надпочечников. Саркома Юинга (ES) является преимущественно костной рак, часто видели в длинные кости бедренной кости и костей таза12. Доклады показали, что чтобы определить, является ли рост преимущественно костной рака возможно в почечной ткани, почечной суб капсульной место было выбрано для имплантации ортотопическая13. Имплантация капсульной клеток почек суб опухолевых клеток была использована как перспективной моделью для изучения спонтанной метастазов для ES14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все работы было сделано в соответствии с Мичиганского университета, институциональных Наблюдательный Совет (HUM 00052430) и соответствует процедурам, утвержденных Комитетом университета по использованию и заботе о животных (UCUCA). Единица для лабораторных животных медицины (УЛАМ) контролировала уход за животными.
Все работы было сделано с одобрения от Мичиганского университета, институциональных Наблюдательный Совет (HUM 00052430) и соответствует всем правилам комитета этики исследований человеческого. Клетки человека считаются быть потенциально зараженные материалы, так что следовать все специальные меры предосторожности и соответствующие биобезопасности практики, которые необходимы вашей организации. ГЯП мышей сильно ослабленным и восприимчивы к болезни, вызванные бактериями, которые обычно встречаются в окружающей среде.
Всегда используйте строгие стерилизации, при подготовке материалов для имплантации и выполнения инъекции.
1. клеточная культура
- Расти установленных человека NB клеточных линий (SH-SY5Y SK-N-BE2 и IMR32), в минимально необходимых среде, дополнена плода бычьим сывороточным 10%, глютамин 2 мм, 100 единиц/мл пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина. Дополнение IMR32 клетки далее с 1 мм пируват и 0,075% NaHCO3. Сохранить все клетки при 37 ° C, 5% CO2 , 70-80% слияния.
- Расти человеческого линии клетки ES (TC32, A673, ХЛ-25 и A4573) в среде RPMI, дополненная плода бычьим сывороточным 10% и 6 мм L-глютамина. Сохранить все клетки при 37 ° C, 5% CO2 при впадении в 70-80%.
- Отправьте всех клеточных линий для аутентификации.
Примечание: Клетки проверка подлинности выполняется на объекте за пределами, обратитесь к благодарности.
2. Подготовка клетки первичной опухоли пациента производные
- С согласия пациента и согласие урожай отбрасываются человека NB опухолевой ткани от пациентов, перенесших хирургической резекции для местного управления и транспорта в лабораторию в ткани решение хранения для сохранения.
Примечание: Все образцы пациента де выявляются и обрабатываются в соответствии с руководящими принципами институциональных Наблюдательный Совет. - Создавать один пациент производные рака суспензию клеток (UMNBL001, UMNBL002) из опухолевой ткани с помощью комплекта диссоциации опухоли. Передачи примерно 0,5 г опухоли в блюдо культуры клеток 100 мм, содержащие 5 мл RPMI буфера, промаркированные фермента H, 100 мкл фермента R и 25 мкл фермента A из комплекта диссоциации человека опухоли.
- Фарш опухоли на мелкие кусочки (2-4 мм) с помощью ножниц и ткани щипцами. Смешайте эти фрагменты с решениями на шаге 2.2.
- Пипетка смесь опухоли в диссоциатором трубу и закрыть трубку. Инвертировать трубу и прикрепить на рукав диссоциатором ткани. Запустите программу h_tumor_01.
- Инкубируйте суспензию клеток опухоли, полученные выше при 37 ° C для 1 h на вращающейся стойке с прерывистой Тритурация каждые 15 мин.
- Передать новые Конические трубки 50 мл суспензии клеток и добавляют 10 мл RPMI. Центрифуга суспензию клеток в 314 g x 5 мин.
- Удалить супернатант и приостановить гранулы в 5 мл RPMI. Передать это решение через стрейнер клетки 40 мкм и собирать напряженными решение в свежий 50 мл Конические трубки. Вымойте этот фильтр один раз с 5 мл RPMI СМИ и центрифуги смеси на 314 g x 5 мин для сбора гранул.
- Измерьте плотность клеток с помощью hemacytometer15. Приостановите гранулы, полученные из выше в RPMI для получения конечной концентрации 4 × 105 клеток/10 мкл. Возьмите 5 мкл этой суспензии клеток и 5 мкл matrigel сделать 10 мкл раствора ячейки для каждой инъекции.
Примечание: Количество используемых RPMI зависит от измерения плотности клеток. Например если плотность измеренной клеток полученные гранулы 4 x 105 клеток, приостановить гранулы в 10 мкл RPMI.
3. Люцифераза пометки раковых клеток
- Сделайте 10 мл трансдукции СМИ с вирусной супернатанта EF1a-Luc2-IRES-mCherry 5 мл и 5 мл стволовых клеток средств массовой информации. 7.5 мкл Полибрен 1 x.
- Смешайте 5 × 106 раковые клетки в средствах массовой информации трансдукция и пластины в 100 мм ультра-низким крепежную пластину. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 на ночь.
Примечание: Как низкий крепежные пластины используются, клетки не будут придерживаться пластины. - После 24 часов принести пластину 100 мм, содержащие клетки под капотом культуры ткани и передача смеси в коническую пробирку 15 мл. Центрифуга суспензию клеток в 314 g x 5 минут получить клетки Пелле. Помыть лепешка клетки один раз с 1 мл раствора 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) и приостановить Пелле клеток в 1 мл HBSS, содержащей 1% плода бычьим сывороточным (ФБС).
- Сортировать клетки Люцифераза, основанный на GFP-позитивный сигнал на активированной флуоресценции клеток, сортировка (FACS) анализ. Пластина сортировки клеток на культуре ткани 100 мм лечение блюдо и поддерживать на 70-80% слияния, 37 ° C и 5% CO2 до тех пор, пока требуется.
- Подтвердите Люцифераза сигнал с Люцифераза пробирного kit. Пластина 10 x 104 Сортировка ячеек на хорошо луксометр совместимый 96 хорошо пластины и инкубации клеток на ночь при 37 ° C и 5% CO2. После 24 часов довести 96 хорошо пластины до комнатной температуры и добавить устойчивый-Glo реагент культивированный СМИ в скважинах в соотношении 1:1. Позволяют клеткам лизируют для 5 минут и прочитайте люминесценции в спектрофотометре.
- Принесите блюдо 100 мм под капотом культуры ткани. Выбросите супернатанта СМИ. Вымойте клетки один раз с 2 мл ПБС.
- Добавить 2 мл 0,25% трипсина и вернуться на 100 мм блюдо инкубатора для 2-3 мин. После 2-3 мин проверьте выбили клетки под микроскопом и добавить 8 мл RPMI для деактивации трипсина.
- Соберите суспензию клеток в 15 мл Конические трубки и центрифуги на 314 g x 5 минут для получения гранул. Выбросите супернатант. Помыть лепешка клеток в 1 мл ПБС, приостановить гранулы в 5 мл RPMI и определить плотность клеток с помощью hemacytometer15. Центрифуга yhe оставшиеся ячейки решение на 314 x g 5 минут для получения гранул.
- Приостановите гранулы в RPMI для получения концентрации 4 x 105 клеток/10 мкл. Возьмите 5 мкл суспензии клеток и 5 мкл matrigel сделать 10 мкл раствора ячейки для каждой инъекции.
4. Ультразвуковая руководствуясь надпочечника (NB) или имплантации почечной Sub капсула (ES)
Примечание: Все ультразвуковые процедуры выполняются с использованием высокого разрешения в vivo imaging системы. Для описанных процедур был использован преобразователь, который имеет центр частотой 40 МГц и пропускной способностью 22-55 МГц.
- Используйте 6-8-week-old мышей ГЯП иммунной недостаточным для выполнения всех процедур инъекций.
- Chill matrigel и автоклавного Гамильтон шприцы с иглой 27G (1,25"), и 22G катетеры (внешний диаметр 0,9 мм, длиной 25 мм) на ночь при 4 ° C.
- Место клетки раствор, приготовленный в шаге 3 на льду.
- Анестезировать мышей в камеру всасывание с помощью 2% изофлюрановая O2 на 2 Л/мин.
Примечание: Адекватной анестезии определяется с отсутствием активного движения и поддержание спонтанного дыхания. - Как только под наркозом, депилировать обратно и грудинкой животных, с использованием лосьон для удаления волос (например Наир) и бритвы.
- Передать животное изображений платформы с брюшной стороны вниз, где помещены в ураном и обеспеченных вдохом изофлюрановая нос животного.
- Место оптических мази в глаза животного для предотвращения высыхания. Лента мыши в место, чтобы предотвратить любое случайное движение.
- Идентифицировать мышиных печени, верхней полой вены, селезенке, Левая почка и прилегающих левого надпочечника, используя ультразвуковой визуализации.
- Используйте стерильные перчатки, маска, шапочка для личной защиты и поддержания стерильных условий. Под УЗИ руководством аккуратно вставить катетер 22G через кожу и мышцы непосредственно в левого надпочечника в качестве канала для сотовых инъекций. Извлеките иглу и оставить катетер на месте.
- Загрузка охлажденные шприц Гамильтон оснащены малокалиберная игла с 10 мкл раствора ячейки, а затем руководство шприц вентрикуло через катетер, расположены в центре надпочечников.
- Inject клеток в целевой ткани надпочечников. Оставьте иглу в место для 1-2 мин позволить matrigel установить. Медленно извлеките иглу, последующим удалением катетера.
- Поместите мышей обратно в их клетке и убедитесь, что мышь восстанавливает достаточно сознания для поддержания грудной recumbency.
Примечание: из-за минимально инвазивной природы этой техники, болевых ощущений после минимальной, но по-прежнему наблюдается на ежедневной основе с мышей здравоохранения проверки.» следует использовать с предложением: «Если неожиданный признаки боли или страданий определяются в ходе эксперимента консультироваться с устройство ветеринарных институциональной поддержки для получения информации о обезболивание или другие медицинские услуги.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью процедур представлены, УЗИ руководствуясь имплантации NB клеток в надпочечников было сделано в специализированную процедуру, залом с подогревом столы. Руки и ноги колодки были размещены для наблюдения за активностью мышиных сердца (рис. 1A). Животное оставалась наркотизированных под изофлюрановая с помощью ингаляции носовой конус. Использование высокого разрешения ультразвуковой зонд, Левая почка отождествлялся с надпочечников точно краниально к почек (рис. 1B). Игла затем перешел в надпочечника под прямой визуализации (рис. 1 c). Во время первоначального использования этой техники смесь красителя метиленового синего и matrigel был использован для подтверждения правильного локализации надпочечников. Животное было принесено в жертву, и успех процедуры была подтверждена на вскрытие визуализации Метиленовый синий краситель под капсула надпочечника (рис. 1 d).
Способов, используемых для мониторинга опухоли приживления и темпы роста были загрузок УЗИ и биолюминесценции изображений. Биолюминесценции изображений региона интерес был измерен как фотоны/s/см2/steridian (/sr p/s/см2) с минимальным количеством 106 -108 ориентировочный размер адекватных опухоли для доклинических эксперименты9 ( Рисунок 2). Анализ с использованием t -теста показали статистически значимое увеличение в биолюминесценции было отмечено в течение восьми недель (* p< 0,05; **p< 0,001; ***p< 0.0001). УЗИ позволяет неинвазивного измерения опухоли площади и объема. Это наряду с измерения биолюминесценции мониторинг приживления опухоли и прогрессии (рис. 3). Аналогичные процедуры были использованы для ES клеток вводили в капсулу почки sub (рис. 4).
Грубые и гистологический анализ результирующей опухоли характеризуются первичной опухоли и метастазов на вскрытие. Образцы тканей были изучены для морфологической клетки узоры и витражи для маркеров опухоли специфических белков (Рисунок 5, Рисунок 6). Первичной опухоли приживления для NB клеточных линий (SH-SY-5Y, SK-N-BE2, UMNBL001, UMNBL002, IMR32) варьировались от 62-100%, с метастазами в 0-100% вводят мышей. Самые надежные метастазы были замечены в SK-N-BE2 (33%) и UMNBL002 (100%). Метастатические сайтов для NB были лимфатических узлов, печени, легких и кортикальной кости. Капсульные приживления почечной sub для ES клеточных линий (A4573, A673, ХЛ-25, TC-32) варьировались от 60-100%, с метастазами в 0-40% вводят мышей. Метастатические сайтов рассмотрены для ES включены лимфатических узлов, легких и трубчатых костей. Самые надежные приживления (100%) и метастазов (40%) были замечены в TC-32 гранулы ксенотрансплантата мышей.
Рисунок 1 . Локализация мышиных надпочечника и УЗИ руководствуясь NB мобильный имплантации. (A) высокое разрешение УЗИ органов брюшной полости мышиных допускается надпочечника имплантации опухолевых клеток. (B) Левая почка была определена. (C левого надпочечника расположен рядом с левой почки как гипоэхогенные (темный) вокруг структуры. Игла была выдвинута в следуют инъекции клеток надпочечников. (D) сочетанием matrigel и метиленового синего красителя использовался для оценки точности процедур инъекций. Представитель ex vivo изображение левой почки и надпочечники с matrigel и метиленового синего красителя на капсула надпочечника и пери надпочечниковой пространства. Эта цифра была изменена с разрешения ван Норду, р.а. и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . В естественных условиях биолюминесценции снимки опухоли приживления и темпы роста. (A) человека NB надпочечников ксенотрасплантатов контролировалось для приживления и роста опухоли более восьми недель. (B) максимальная биолюминесценции сигнал был определен в пределах области интереса. NB клеточных линий (SH-SY5Y, IMR-32, SK-N-BE2) и пациент производные клеток (UMNBL001, UMNBL002) увеличилась моделей сияние и роста с течением времени. Увеличение биолюминесценции в течение восьми недель была статистически значимой (*p< 0,05; **p< 0,001; ***p< 0.0001). Эта цифра была изменена с разрешения ван Норду, р.а. и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . В естественных условиях УЗИ приживления опухоли и роста. УЗИ контроль в vivo прогрессии опухоли. Показано УЗИ изображения и соответствующие изображения биолюминесценции в одно, двух и восемь недель. На одну неделю приживления был визуализирован в обоих изображений условий. Опухоль площади и объема были рассчитаны с помощью УЗИ. 3D УЗИ изображения зеркально подакцизным опухоли после завершения исследования. Эта цифра была изменена с разрешения ван Норду, р.а. и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Локализация мышиных почек и УЗИ руководствуясь имплантация клеток ES. (A) биолюминесценции был использован для мониторинга опухоли сияние и роста. (B-C) Животные разработали локально инвазивной опухоли, которые искаженные вокруг живота структур и вторгся в местные структуры, такие как мышцы. Эта цифра была изменена с разрешения ван Норду, р.а. и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Гистопатология опухоли NB и ES ксенотрансплантата опухолей. (A) NB ксенотрансплантата мышей были локально инфильтративный первичной опухоли на участках коры надпочечников и пери адреналовой железы, искажающих смежных органов брюшной полости. (B) микроскопично (20 X, Бар = 50 мкм), опухоли надпочечников ксенотрансплантата показал морфологических особенностей в соответствии с человека NB (кластеры слабо дифференцированной угловой для круглых клеток), включая случайные псевдо формирования розетки (стрелка). (C) опухолевой ткани показали сильный тирозин гидроксилазы (NB опухолевого маркера) иммунореактивности (40 X, Бар = 40 мкм, положительный контроль пятнать показано на левой панели; 1: 100). (D) ES ксенотрансплантата опухоли имели Гистологические особенности соответствует инфильтративный ES (40 X, Бар = 40 мкм), кластеры угловой для круглых клеток epithelioid, разделенных тонкой фиброзно сосудистой стромы, их стирания и сжатие нормальной соседних почек (стрелка; сжатый остатки паренхимы почек). (E) ES опухолевой ткани показали сильный мембраны иммунореактивности для маркера опухоли ES CD99 (40 X, Бар = 40 мкм, положительный контроль пятнать показано на левой панели; 1: 100). Эта цифра была изменена с разрешения ван Норду, р.а. и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 . Отдаленных метастазов, разработанных в ксенотрасплантатов созданы методом УЗИ руководствуясь инъекций. (A) биолюминесценции изображений показаны первичной NB опухоли надпочечника пространства и метастазов, обнаруженных в кортикальной кости. (B) микроскопический анализ продемонстрировал метастатические опухоли (стрелка), их стирания полости костного мозга и кортикальной кости проксимального отдела бедренной кости (4 X, Бар = 400 мкм). (C) тирозин гидроксилазы цитоплазматических иммунореактивности кортикальной кости NB метастатического узла (40 X, Бар = 40 мкм). (D) микроскопия ксенотрансплантата пациента производные ортотопическая (UMNBL002) с печеночных метастазов (стрелка) в пределах печеночная Вена (стрелка показывает эндотелиальных клеток) и проникают в паренхиме прилегающих печени (L) (20 X, Бар = 50 мкм). (E) нейробластома микро метастазов (стрелка) в пределах паренхимы легких (40 X, Бар = 40 мкм). Эта цифра была изменена с разрешения ван Норду, р.а. и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
УЗИ руководствуясь имплантация NB и ES клеток-это эффективный и безопасный метод, чтобы установить надежный мышиных ксенотрасплантатов для доклинических исследований в биологии рака. Решающее значение для успеха УЗИ руководствуясь ткани целевой имплантация является присутствие и наличие квалифицированного персонала, обладающего опытом в анатомической локализации органа интерес и стереотаксической инъекции опухолевых клеток.
Диссоциация опухолевой ткани оказался решающим шагом в разработке модели описан пациент производные ксенотрансплантата. Родной опухолевой ткани включает в себя сотовой микроокружения и окружающие стромы, которая может повлиять на поглощение опухоли или приживления. Клетки подсчитывает, после процесса диссоциации был полным, предоставляемых датчике сотовой плотности в образце, с 2 x 105 клеток/10 мкл считается оптимальным клеток количество для имплантации и успешные опухоли приживления.
Люцифераза пометки ячеек для проверки опухоли приживления и мониторинга роста опухоли путем измерения биолюминесценции сигнал, с 10-6 до 108 рассматриваются ориентировочные опухоли поглощение9. Для обеспечения успешного трансдукции, Люцифераза деятельности было подтверждено в vitro до инъекции клеток. Это было сделано, иммунофлюоресценции, Люцифераза пробирного комплекты, а также путем изучения клеток для сигнала биолюминесценции. Параметры, используемые для измерения биолюминесценции были, котор держат константа, обеспечивая последовательные данные во время загрузок измерений.
Ex vivo гистопатологические анализ опухоли подтвердил тип ячейки и морфология результирующая опухолей с специфического окрашивания белковых маркеров. Гистопатологические анализ подтвердил приживления опухоли и метастазов, продемонстрированной УЗИ и биолюминесцентных изображений.
Преимущества ультразвуковая руководствуясь сотовой имплантации включают неинвазивный характер, время минимальным животных восстановления и растущий успех в создании нескольких успешных ксенотрансплантата моделей. УЗИ также обеспечивает надежный способ для отслеживания в vivo опухоли прогрессии опухоли томов и. В этих доклинических моделях опухоли достигло локально инвазивное заболевание с метастазами в течение 5 недель. Ограничения включают в себя наличие технологии визуализации высокого разрешения и способности последовательно локализации органа-мишени. Наличие персонала с опытом в УЗИ органа интереса являются важнейшими компонентами этой техники.
Наличие высокого разрешения УЗИ значительно увеличился в течение последнего десятилетия, и его использование продолжает расширять не только в клинической практике, но и в лабораторных исследований. Использование УЗИ для развития современной мышиных ксенотрасплантатов является приложением перспективных, с потенциалом для продвижения доклинические исследования модели для обнаружения рака наркотиков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют не раскрытия.
Acknowledgments
Эта работа получила поддержку Роберт Вуд Джонсон фонд/Amos медицинского факультета развития программы, Таубман исследовательский институт и Секция детской хирургии, Университет штата Мичиган. Авторы хотели бы поблагодарить Kimber Converso-баран и д-р Маркус Jarboe для помощи с ультразвуковой процедуры инъекции и изображений платформы. Мы благодарим Пол гимнастка за его помощь в графический рисунок. Мы также благодарим Отдел радиологии Мичиганского университета для использования центра молекулярной визуализации и Imaging основной опухоли, которые поддерживаются частично Всеобъемлющем Рак центр NIH, Грант Р30 CA046592. Университет Мичигана физиологии фенотипирование ядро, которое поддерживается в части субсидий из низ (OD016502) и центр сердечно-сосудистой Френкель. Ячейки строки аутентификации было сделано на IDEXX РАДИЛ Bioresearch зал, Колумбия, Миссури Мы благодарим Tammy Stoll, доктор Раджен Моди и программа онкологии твердые опухоли Мотт. Наши пациенты и семьи были с благодарностью за их вдохновение, мужество и постоянную поддержку наших исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
- Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).
- Fidler, I. J., Hart, I. R. Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications. Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation. Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice. Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis. In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).
- Stewart, E., et al. Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft. Dev Biol. 407, 344-355 (2015).
- Jäger, W., et al. Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts. J. Vis. Exp. (84), e51123 (2014).
- Teitz, T., et al. Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment. PLoS ONE. 6 (4), e19133 (2011).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours. International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).
- Van Noord, R. A., et al. Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).
- Vormoor, B., et al. Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging. PLoS ONE. 9 (1), e85128 (2014).
- Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature. Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).
- Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor. Sarcoma. 2010, 174528 (2010).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
